一、天麻蜜环菌同步栽培法（论文文献综述）
封海东,金善忠,周明,张振,秦光明,袁修华,李坤,司海倩,周军,张泽志[1]（2019）在《十堰市杂交天麻零代种高效制作与培育技术初探》文中进行了进一步梳理结合十堰地区特点,介绍了鄂天麻1、2号与宜红优1号零代种高效制作与培育技术,以供农户参考。
肖舒卉[2]（2019）在《天麻GeCPR与共生蜜环菌Lac基因克隆及其功能鉴定》文中进行了进一步梳理天麻是一种名贵的中药材,属于一种真菌营养型兰科植物,能镇静催眠、抗惊厥眩晕、镇痛、改善记忆、治疗老年痴呆,还能够提高免疫力。天麻主要药用活性成分为天麻素和对羟基苯甲醇,药用天麻两者总含量不能低于0.25%。天麻中活性成分的合成与细胞色素P450相关,而细胞色素P450还原酶（CPR）是细胞色素P450酶系（CYPs）中重要的组成成分,为CYPs提供电子。蜜环菌是天麻生长过程中最重要的大型共生真菌,侵入到天麻体内的蜜环菌将被天麻消化转化为营养物质供给自己生长,蜜环菌的生长影响到天麻产量和品质。蜜环菌主要靠降解菌材中的木质纤维素为葡萄糖等小分子有机物供蜜环菌生长需要。蜜环菌利用菌材能力与蜜环菌分泌漆酶活性有关。目前,天麻是药食同源植物,市场需求量大,主要靠人工栽培天麻满足市场需求。然而,人工栽培天麻功能活性成分含量和利用菌材效率比较低。因此,本研究利用生物工程技术,首先建立蜜环菌转基因技术,然后通过蜜环菌天麻转录组测序,基于转录组数据,筛选天麻细胞色素P450还原酶基因（GeCPR）和蜜环菌漆酶基因（Lac）,找出他们CDS序列,通过RACE-PCR技术扩增出这些基因全长序列,构建Lac基因真核过表达载体,转入蜜环菌以期提高漆酶活性和提高蜜环菌对菌材利用效率,促进蜜环菌的生长;构建GeCPR基因真核过表达载体,转入蜜环菌以期使蜜环菌能够转化前体物质甲苯为4-羟基苯甲醇,提高蜜环菌4-羟基苯甲醇含量,再通过接种天麻提高天麻4-羟基苯甲醇含量和天麻素含量,为天麻生产提供新的栽培技术和方法。获得如下主要研究结果:利用红色光荧光蛋白对蜜环菌转基因方法进行研究。从plot1载体上扩增出红色荧光蛋白基因,并成功构建真核表达载体pH2GW-35S-mRFP1。通过农杆菌介导法转化蜜环菌,在转基因蜜环菌中观察到红色荧光,说明农杆菌介导法可用于蜜环菌转基因方法。同时对农杆菌介导法的影响因素进行了优化。基于蜜环菌和天麻转录组分析数据,筛选出蜜环菌降解菌材的漆酶基因,找出CDS序列,通过RACE-PCR技术克隆获得该基因全长1617 bp,能编码538个氨基酸残基,组成Lac蛋白的氨基酸中丙氨酸含量最高。对该蛋白进行生物信息学分析,预测该蛋白质的分子量为59千道尔顿,理论PI值为4.28,整体呈亲水性,有42个氨基酸位点呈现不同程度的磷酸化。对Lac蛋白进行三维建模,发现无规卷曲为其主要结构。本实验成功构建漆酶基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得重组蛋白。对重组蛋白进行酶学特性分析发现,该酶的最适温度为40℃,最适的pH值为4,金属离子Fe2+对该酶的活性具有抑制作用,Mg2+,Cu2+能够促进漆酶活性,Ca2+,K+,Na+,Zn2+四种离子对漆酶的活性影响较小。基于天麻蜜环菌转录组分析数据,筛选出细胞色素P450还原酶（GeCPR）相关基因。RACE-PCR技术克隆获得该基因全长2094bp,能编码697个氨基酸残基,这些氨基酸残基中亮氨酸含量最高。对该蛋白进行生物信息学分析,预测该蛋白质分子量为77千道尔顿,理论PI值为5.28,整体呈亲水性,有67个磷酸化位点,对GeCPR蛋白进行三维建模,发现α螺旋为其主要结构。本实验成功构建GeCPR基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,纯化获得重组蛋白。酶学特性分析表明GeCPR酶的最适温度为35℃;最适pH值为8;Cu2+,Fe2+和Mg2+对酶活性有抑制作用,Zn2+对GeCPR活性具有较强的抑制作用,Ca2+,K+和Na+对酶活性基本无影响。利用Gateway技术成功构建了GeCPR基因的真核表达载体pH2GW-35S-GeCPR,通过农杆菌pMP90转染蜜环菌,获到具有阳性克隆的转GeCPR基因蜜环菌工程菌株。该菌株能够成功催化对甲酚转化为对羟基苯甲醇。
黄庆林[3]（2013）在《汉中市人工栽培猪苓的空窝原因及对策》文中研究表明分析总结猪苓空窝的原因有选种不严或苓种退化,场地选择不当,蜜环菌退化或生长不良,栽培技术不完善,灾害性天气,病虫危害等。提出相应防治措施为严把苓种质量关,按时培养优质蜜环菌材,选择适宜的栽培场地,精心栽种确保成活,改进栽培技术,加强管理等。
黄庆林[4]（2013）在《汉中市人工栽培猪苓空窝的原因及对策》文中研究说明猪苓是一种名贵的药用真菌,具有利尿、渗湿等功效,为我国常用的菌类药材,已有2500多年的药用历史,在国内外享有盛名。汉中市秦巴山区是我国猪苓最大的适生区和主产区,近年来随着人工栽培猪苓技术的不断成熟,汉中市的种植规模、产品质量、综合效益己居全国之首,己成为汉中市山区农民致富的朝阳产业。本文总结了该技术在汉中市推广中存在的主要问题及对策。
廖伟坤,廖天南,曾其华[5]（2010）在《林区可仿野生栽培天麻》文中提出野生天麻多生长在海拔500～2500米、夏季冷凉多湿、冬季积雪深厚、阔叶树繁茂、枯枝落叶层厚的山林地带。在林区,可以利用特有的地理优势,仿野生条件栽培天麻。
谭自春[6]（2007）在《天麻无土节能栽培技术》文中进行了进一步梳理传统的天麻人工栽培法,人们都习惯性的用直径5～10cm的硬杂椴木做菌材,用沙土做填充物。但笔者认为这种传统性的栽培方法,只是根据天麻的生长特性和自然规律仿野生的一种栽培模式。它不仅单位产量低浪费有限的林业资源,而且更与现行封山育林的国策相违背;再者它的栽培范围也有了区域性的限制,从而制约了天麻迅速繁殖和规模化发展。笔者经过十几年的苦心研究和反复栽培试验,结合天麻的生活习性与自然规律总结探索出了一套既高产又节能的栽培模式——无土节能栽培法。现简报如下:
刘红,黄庆林[7]（2007）在《天麻有性繁殖出现空窝的原因及预防措施》文中研究说明天麻有性繁殖共生萌发菌拌播技术,是目前天麻生产上的最佳方法,总结了该技术在推广中所存在的问题及防止措施。
王建中,李来祥,郭四拜,孙淑兰,魏斌[8]（2003）在《提高天麻商品率有效途径研究初报》文中指出依据天麻和密环菌生物学特性及其生长发育对环境条件的要求 ,通过采用有性、无性相结合的繁殖方式 ,调节播期 ,选择优质菌种、菌材及种子 ,改善栽培环境 ,改变传统的栽培方法 ,加强管理 ,可明显提高天麻商品率。
华秀爱[9]（2003）在《天麻高产栽培试验》文中研究表明利用液体深层培养蜜环菌种,其菌丝生长速度快,比固体培养缩短时间一倍以上。并试验用高杆作物秸杆内包捆代料代替段木栽培天麻,能促进天麻快速生长,产量大为提高。不仅降低成本节约资源并缩短栽培周期100～200天。
刘厚荣,陈先惠[10]（2003）在《天麻蜜环菌沙箱同步栽培法》文中研究指明
二、天麻蜜环菌同步栽培法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、天麻蜜环菌同步栽培法（论文提纲范文）
（1）十堰市杂交天麻零代种高效制作与培育技术初探（论文提纲范文）
| 1 天麻的环境要求 |
| 1.1 环境选择 |
| 1.2 基质选择 |
| 2 杂交天麻种子培育 |
| 2.1 母麻选择 |
| 2.2 培育场地及时间 |
| 2.3 培育方法 |
| 2.4 摘顶 |
| 2.5 人工授粉 |
| 2.6 种子采收 |
| 3 菌种与菌材的制作与处理 |
| 3.1 萌发菌与蜜环菌 |
| 3.2 天麻种子与萌发菌混合 |
| 3.3 菌材用树 |
| 3.4 蜜环菌处理 |
| 4 直播繁殖 |
| 4.1 播种 |
| 4.2 置木材与蜜环菌 |
| 4.3 室内管理 |
| 4.3.1 环境管理 |
| 4.3.2 虫鼠害防治 |
| 4.4 采挖 |
| 4.4.1 采挖时间 |
| 4.4.2 采挖方法 |
| 5 生产效益 |
| 5.1 天麻杂交种子生产效益 |
| 5.2 米麻生产效益 |
| 6 天麻生产效益分析及总结 |
（2）天麻GeCPR与共生蜜环菌Lac基因克隆及其功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 天麻的研究进展 |
| 1.1.1 天麻的生活史 |
| 1.1.2 天麻的药食价值 |
| 1.2 天麻主要活性成分 |
| 1.2.1 天麻素 |
| 1.2.1.1 天麻素的合成途径 |
| 1.2.1.2 天麻素的药用价值 |
| 1.2.2 对羟基苯甲醇的研究进展 |
| 1.3 蜜环菌研究概述 |
| 1.3.1 蜜环菌研究进展 |
| 1.3.2 天麻与蜜环菌的关系 |
| 1.4 漆酶研究现状 |
| 1.4.1 漆酶的概述 |
| 1.4.2 漆酶参与的生化反应 |
| 1.5 细胞色素P450 氧化酶系的研究进展 |
| 1.5.1 细胞色素P450 氧化酶系的主要成员 |
| 1.5.2 细胞色素P450 家族基因的起源 |
| 1.5.3 细胞色素P450 参与的生物合成 |
| 1.5.4 细胞色素P450 氧化还原酶的作用 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 农杆菌介导的蜜环菌转基因方法优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 蜜环菌的培养 |
| 2.1.2 主要培养基及仪器 |
| 2.1.3 红色荧光蛋白m RFP1 基因的扩增 |
| 2.1.4 目的片段的回收与TA克隆 |
| 2.1.5 真核表达载体pHGWL7-mRFP1 的构建 |
| 2.1.6 单核蜜环菌培养 |
| 2.1.7 表达载体pHGWL7.0-35S-mRFP1 转化农杆菌 |
| 2.1.8 农杆菌介导pHGWL7-mRFP1 表达载体转化蜜环菌验证 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 真核表达载体pHGWL7-mRFP1 的构建 |
| 2.2.2 蜜环菌单孢子培养单倍体蜜环菌菌丝 |
| 2.2.3 农杆菌介导的蜜环菌遗传转化 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 蜜环菌漆酶基因的克隆与分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 蜜环菌培养 |
| 3.1.3 主要试剂与仪器 |
| 3.1.4 总RNA的提取 |
| 3.1.5 cDNA的合成 |
| 3.1.6 巢式PCR扩增目的基因的未知片段 |
| 3.1.7 目的片段的回收与克隆。 |
| 3.1.8 转化大肠杆菌 |
| 3.1.9 目的基因的拼接及检测 |
| 3.1.10 漆酶基因全长克隆 |
| 3.1.11 漆酶原核表达载体构建 |
| 3.1.12 漆酶酶活性的测定 |
| 3.1.13 漆酶酶学性质研究 |
| 3.1.13.1 漆酶最适作用温度 |
| 3.1.13.2 漆酶最适作用pH |
| 3.1.13.3 金属离子对漆酶活力的影响 |
| 3.1.14 漆酶蛋白功能预测与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 漆酶基因全长的获得 |
| 3.2.1.1 漆酶基因后段序列扩增电泳检测 |
| 3.2.1.2 漆酶全长基因的获得 |
| 3.2.2 漆酶基因的生物信息学分析 |
| 3.2.2.1 Lac基因合成的氨基酸残基序列 |
| 3.2.2.2 Lac基因的氨基酸组成及理化性质 |
| 3.2.2.3 Lac蛋白的疏/亲水性分析 |
| 3.2.2.4 Lac蛋白磷酸化位点分析 |
| 3.2.2.5 Lac蛋白的二级结构预测 |
| 3.2.2.6 漆酶基因同源性分析 |
| 3.2.3 漆酶基因的原核表达载体构建及转化BL21 感受态 |
| 3.2.3.1 漆酶原核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.2.3.2 漆酶原核表达蛋白的诱导分析 |
| 3.2.3.3 漆酶重组蛋白的纯化 |
| 3.2.4 漆酶蛋白酶学特性分析 |
| 3.2.4.1 漆酶的最适酶促反应温度 |
| 3.2.4.2 漆酶酶促最适pH值 |
| 3.2.4.3 金属离子对漆酶活性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 GECPR相关基因的克隆及功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株及载体 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 4.1.4 RT-qPCR验证 |
| 4.1.5 巢式PCR扩增目的基因的未知片段 |
| 4.1.6 目的片段的回收与克隆。 |
| 4.1.7 目的基因的检测及拼接 |
| 4.1.8 GeCPR基因全长克隆 |
| 4.1.9 Ge CPR蛋白功能预测与分析 |
| 4.1.10 转化大肠杆菌 |
| 4.1.11 GeCPR原核表达载体的构建 |
| 4.1.12 GeCPR重组蛋白的纯化 |
| 4.1.13 GeCPR酶活性的测定 |
| 4.1.14 GeCPR酶酶学性质的研究 |
| 4.1.14.1 GeCPR酶最适作用温度 |
| 4.1.14.2 GeCPR酶最适作用pH |
| 4.1.14.3 金属离子对GeCPR酶活力的影响 |
| 4.1.15 引物设计及PCR扩增GeCPR基因 |
| 4.1.16 构建Ge CPR的真核表达载体 |
| 4.1.17 转化蜜环菌及转基因蜜环菌的培养筛选 |
| 4.1.18 菌株培养及生物转化 |
| 4.1.19 HPLC检测4 羟基苯甲醇的含量 |
| 4.1.20 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 细胞色素P450 还原酶相关基因相对表达水平分析 |
| 4.2.2 Ge CPR基因的获得 |
| 4.2.2.1 GeCPR基因后段序列扩增电泳检测 |
| 4.2.2.2 GeCPR基因全长的获得 |
| 4.2.3 天麻GeCPR基因的生物信息学分析 |
| 4.2.3.1 Ge CPR基因的氨基酸残基序列 |
| 4.2.3.2 GeCPR蛋白的氨基酸组成及理化性质 |
| 4.2.3.3 GeCPR蛋白的疏/亲水性分析 |
| 4.2.3.4 GeCPR蛋白的磷酸化位点分析 |
| 4.2.3.5 GeCPR蛋白的二级结构预测 |
| 4.2.3.6 GeCPR基因的同源性分析 |
| 4.2.4 GeCPR原核载体构建 |
| 4.2.4.1 GeCPR原核载体的构建及鉴定 |
| 4.2.4.2 原核表达重组质粒的鉴定及检测 |
| 4.2.4.3 原核表达蛋白的诱导分析 |
| 4.2.4.4 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.5 细胞色素P450 还原酶(GeCPR)的酶学特性分析 |
| 4.2.5.1 细胞色素P450 还原酶(Ge CPR)的最适酶促反应温度 |
| 4.2.5.2 细胞色素P450 还原酶酶促最适pH值 |
| 4.2.5.3 金属离子对细胞色素P450 还原酶活的影响 |
| 4.2.6 GeCPR真核表达载体构建 |
| 4.2.6.1 入门载体pENTR2B-GeCPR的构建 |
| 4.2.6.2 过表达载体p H2GW7.0-35S-GeCPR的构建 |
| 4.2.7 过表达载体转染蜜环菌生长情况及鉴定 |
| 4.2.8 转基因蜜环菌对对甲酚的降解效果研究 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的论文 |
（3）汉中市人工栽培猪苓的空窝原因及对策（论文提纲范文）
| 1 猪苓空窝的原因 |
| 1.1 选种不严或苓种退化 |
| 1.2 场地选择不当 |
| 1.3 蜜环菌退化或生长不良 |
| 1.4 栽培技术不完善 |
| 1.5 灾害性天气及病虫危害 |
| 1.6 其他因素 |
| 2 防止空窝的措施 |
| 2.1 严把苓种质量关 |
| 2.2 按时培养优质蜜环菌材 |
| 2.3 选择适宜的栽培场地 |
| 2.4 选择适宜的栽培时间 |
| 2.5 3种栽培方法 |
| 2.6 改进栽培技术 |
| 2.7 加强管理 |
（6）天麻无土节能栽培技术（论文提纲范文）
| 1 天麻生长的必备条件 |
| 1.1 温度 |
| 1.2 湿度 |
| 1.3 光照 |
| 1.4 土壤 |
| 2 种子的采摘标准 |
| 3 播种期 |
| 4 无土袋内繁殖育种前的准备 |
| 5 拌种 |
| 6 装袋 |
| 7 埋袋与管理 |
| 8 采收 |
（7）天麻有性繁殖出现空窝的原因及预防措施（论文提纲范文）
| 1 天麻有性繁殖出现空窝的原因 |
| 1.1 蜜环菌退化或生长不良 |
| 1.2 果实采收时间不当或保藏不良 |
| 1.3 其它原因 |
| 2 防止空窝率的主要技术措施 |
| 2.1 培育优质天麻种子 |
| 2.2 按时培育优质蜜环菌材及菌床 |
| 2.3 精心播种确保成活 |
| 2.4 改进栽培技术减少空窝损失 |
（8）提高天麻商品率有效途径研究初报（论文提纲范文）
| 1.采取有性与无性相结合的办法, 使供种与栽培同步进行。 |
| 2.适期早播, 创造适宜的前期温湿度条件。 |
| 3.选择优质菌种和菌材蜜环菌作天麻营养供体, 而菌材是营养源, 这是天麻高产的物质基础。 |
| 4.调节基础培养料组分及通气状况基础。 |
| 5.改变传统栽培方法。 |
| 6.加强田间管理。 |
| 7.收获及加工。 |
（10）天麻蜜环菌沙箱同步栽培法（论文提纲范文）
| 一、枝椴蜜环菌种的制备 |
| 二、沙箱同步栽培 |
| 1.所需原料 (以1箱为例) |
| 2.装箱 |
| 三、栽培季节 |
四、天麻蜜环菌同步栽培法（论文参考文献）
- [1]十堰市杂交天麻零代种高效制作与培育技术初探[J]. 封海东,金善忠,周明,张振,秦光明,袁修华,李坤,司海倩,周军,张泽志. 湖北农业科学, 2019(11)
- [2]天麻GeCPR与共生蜜环菌Lac基因克隆及其功能鉴定[D]. 肖舒卉. 昆明理工大学, 2019(01)
- [3]汉中市人工栽培猪苓的空窝原因及对策[J]. 黄庆林. 食药用菌, 2013(05)
- [4]汉中市人工栽培猪苓空窝的原因及对策[A]. 黄庆林. 2013首届全国猪苓会议论文集, 2013
- [5]林区可仿野生栽培天麻[J]. 廖伟坤,廖天南,曾其华. 科学种养, 2010(05)
- [6]天麻无土节能栽培技术[J]. 谭自春. 食用菌, 2007(04)
- [7]天麻有性繁殖出现空窝的原因及预防措施[J]. 刘红,黄庆林. 食用菌, 2007(04)
- [8]提高天麻商品率有效途径研究初报[J]. 王建中,李来祥,郭四拜,孙淑兰,魏斌. 甘肃农业, 2003(12)
- [9]天麻高产栽培试验[J]. 华秀爱. 吉林蔬菜, 2003(04)
- [10]天麻蜜环菌沙箱同步栽培法[J]. 刘厚荣,陈先惠. 农业新技术, 2003(04)