逆转录病毒转染的 VEGF 在兔骨髓基质细胞中的表达

一、转染逆转录病毒的VEGF在兔骨髓基质干细胞内的表达（论文文献综述）

王庆锋^[1]（2020）在《TGR5对成骨细胞分化的影响及相关机制研究》文中研究指明背景骨是由成骨细胞和破骨细胞调节的一种精细的动态器官,在调节骨周转率中起着关键作用。成骨细胞对骨形成很重要,破骨细胞负责骨吸收。成骨细胞来源于间充质干细胞和成骨前细胞,通过成骨分化形成。成骨分化功能障碍导致正常骨重塑或骨翻转功能受损,并伴有多种骨代谢紊乱,包括骨质疏松症。骨质疏松症的主要病理特征为骨密度降低、骨稳态崩溃、骨脆性增加。成骨细胞的成熟是一个复杂的生理过程,由细胞增殖、分化、矿化等多个步骤调控。前体细胞成功的分化和矿化成功能性成骨细胞被认为是骨形成的关键步骤。多种细胞内信号通路被报道参与成骨细胞分化和矿化过程。例如,AMPK活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）可刺激内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）磷酸化,增加成骨前细胞MC3T3-E1一氧化氮（nitric oxide,NO）的产生,促进成骨细胞分化和矿化,提高成骨细胞活性,促进骨形成。AMPK/eNOS通路的激活导致RUNT相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,Runx-2）的表达,该转录因子通过调节碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）、骨黏连蛋白（osteonectin）、骨桥蛋白（osteopontin）和Ⅰ型胶原的表达参与成骨细胞成熟。促进成骨分化被认为是治疗骨质疏松症等骨疾病的重要治疗策略。G蛋白偶联受体TGR5是G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor,GPCR）家族的重要成员。它最初被鉴定为胆汁酸的膜受体。据报道,TGR5在调节胆汁酸和能量稳态以及葡萄糖代谢方面发挥着关键作用。TGR5存在于多种组织和细胞中,通过异三聚体G蛋白转导细胞外信号,具有多种药理特性。例如,最近报道TGR5激活在抑制脂多糖（LPS）诱导的全身急性胃炎症中起关键作用,该过程主要是通过抑制IκBα/NF-κB信号通路的激活完成的。也有报道称TGR5在治疗肾脏炎症相关疾病中具有抑制NF-κB和STAT3信号的作用。TGR5在氧化偶氮甲烷（azoxymethane,AOM）小鼠模型中也通过减轻神经炎症和改善预后显示其具有神经保护作用。然而,关于TGR5在成骨分化中的作用的信息以前很少有报道。目的本课题拟通过体内和体外实验探究TGR5对成骨细胞分化和骨骼发育形成的影响,以及参与调控成骨细胞正常分化的具体作用机制,不仅研究TGR5在骨形成过程中的生理功能,为骨代谢的分子机制提供了新的见解,也为临床治疗骨相关疾病提供了新的理论基础和靶点。方法正常成骨细胞分化障碍与骨质疏松等骨丢失相关疾病有关。G蛋白偶联受体TGR5被认为是胆汁酸和能量稳态的重要调节因子。关于TGR5对成骨细胞骨形成和基质矿化的影响,以往报道较少。在本研究中,我们首先利用RNA-seq检测了 β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异,确定了目的基因TGR5可能参与调控β-GP/AA诱导的成骨细胞的分化与成熟,能够促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞的分化。然后,我们利用TGR5激动剂GPBARA和siRNA技术证明了 TGR5的活性能够调控MC3T3-E1成骨细胞分化相关基因（ALP、OCN、Osx）、成骨细胞分化转录因子Runx2的表达,影响细胞ALP活性及基质钙化。之后,我们通过进一步的机制研究发现TGR5通过激活AMPK信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞的分化。最后,我们通过TGR5缺失的转基因小鼠模型体内证明TGR5通过影响AMPK信号通路对小鼠骨骼的发育和成骨细胞的分化产生影响。结果（1）β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异β-甘油磷酸/抗坏血酸（β-glycerophosphate/ascorbicacid,β-GP/AA）能够诱导成骨细胞的分化和形成。我们利用前成骨细胞系MC3T3-E1作为成骨细胞前体细胞（osteoblastprecursors,OBPs）,该细胞能够诱导分化成成骨细胞。我们用4 mMβ-GP和25 μg/mlAA分别处理MC3T3-E1 24h、48h和72h后,收取不同组的RNA,送公司行二代测序。RNA-seq和生物反应路径分析（Ingenuity Pathway Analysis,IPA）发现β-GP/AA诱导24h有1488个基因表达上调,诱导48h有1417个基因表达上调,诱导72h有337个基因表达上调,其中TGR5是三组中表达上调最明显的。因此,我们推测TGR5可能参与调控β-GP/AA诱导的成骨细胞的分化与成熟,能够促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞的分化。（2）β-GP/AA 诱导促进 MC3T3-E1 TGR5 的表达TGR5在不同类型的细胞和组织中表达。然而,目前尚不清楚TGR5是否在MC3T3-E1细胞中表达。因此,我们通过RT-PCR和western blot检测了 TGR5是否在MC3T3-E1细胞中表达。小鼠MIN6细胞作为TGR5表达的阳性对照[16]。与预期一样,通过RT-PCR和western blot分析,我们在MC3T3-E1细胞的RNA水平和蛋白水平分别检测到了 TGR5的表达。接下来,我们发现在成骨培养基（含4mMβ-GP和25 μg/mlAA的α-MEM）培养的MC3T3-E1细胞中,TGR5的表达从第3天到第14天逐步增加,且呈时间依赖性。这些结果提示TGR5可能是MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的一个重要因素,说明TGR5参与MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化。（3）TGR5激动剂能够促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化GPBARA作为TGR5的特异性激动剂被广泛应用于TGR5的激活研究[17]。前面已经证明TGR5可能参与MC3T3-E1细胞成骨细胞的分化,下面我们利用TGR5特异性激动剂做进一步的验证。我们利用含TGR5激动剂GPBARA（3μM）的成骨培养基培养MC3T3-E1细胞,然后测定成骨细胞ALP活性、茜素红S染色及成骨细胞分化标志物基因表达情况,用于检测成骨细胞分化情况。结果发现:与对照组相比,GPBARA（3μM）能够显着提高MC3T3-E1的ALP活性,且差异具有统计学意义（p<0.05）。相应地,茜素红S染色结果表明,与对照组相比,添加GPBARA（3μM）能够显着促进MC3T3-E1细胞在第14天的矿化作用,且差异具有统计学意义（p<0.05）。同时,RT-PCR结果表明,TGR5激动剂GPBARA（3μM）的使用能够显着增强成骨细胞相关标记基因的表达,包括ALP、OCN、Osx和Col-I,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（4）TGR5能够促进MC3T3-E1成骨细胞特异性转录因子Runx2的表达与成骨细胞分化相关的标记基因的表达主要受转录因子Runx-2调控。结果发现,与对照组相比,GPBARA（3μM）处理能够显着促进MC3T3-E1Runx2的表达,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（5）TGR5敲低能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化为了进一步验证TGR5在成骨分化中的生物学功能,通过TGR5 siRNA转染敲除TGR5的表达。western blot证明TGR5敲除成功。重要的是,TGR5的沉默部分阻止了 ALP活性增加、基质矿化以及成骨细胞分化标记基因的表达,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。这些结果均提示TGR5可能在成骨分化中起重要作用。（6）TGR5通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化eNOS 的磷酸化和 AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）产生NO在成骨细胞分化过程中起关键作用。因此,我们检测了 GPBARA（3μM）是否能够影响MC3T3-E1eNOS/NO信号通路。结果发现:GPBARA（3μM）能够显着促进MC3T3-E1eNOS的磷酸化,且具有时间依赖性。DAF-FMDA染色用于检测MC3T3-E1NO的产生。结果表明,GPBARA处理将MC3T3-E1NO的产生时间从1h增加到6h。此外,我们还发现GPBARA（3μM）能够促进MC3T3-E1AMPK和ACC的磷酸化,且具有时间依赖。因此,我们推测TGR5通过激活AMPK信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞的分化。（7）AMPK抑制剂能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化为了进一步证实AMPK在调节GPBARA诱导的成骨分化作用中的作用,我们使用了特定的AMPK抑制剂化合物C来处理MC3T3-E1。利用条件性成骨培养基培养MC3T3-E1细胞,培养时间为14天。结果发现,复合物C的存在抑制了 GPBARA诱导的ALP活性升高、基质矿化和成骨细胞分化标记基因表达。同时我们还发现,使用复合物C阻断AMPK的活化,可以抑制GPBARA诱导的Runx-2表达。这些结果表明,TGR5在成骨分化中的作用是由AMPK介导的。（8）在骨骼形成过程中TGR5是成骨细胞分化必不可少的为了体内证明TGR5对小鼠骨骼发育和成骨细胞分化的影响,我们构建了 TGR5缺失的转基因小鼠,通过原位杂交分析TGR5的表达对骨骼形成的影响。结果发现:在E14.5,与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠ECM矿化的面积明显较少,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。Von Kossa染色用于检测骨骼中的钙含量以及ECM的矿化程度。与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠骨骼中的钙含量更低,ECM的矿化程度更低,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。阿尔新蓝染色发现TGR5缺失的小鼠骨骼ECM中大部分为软骨一类细胞,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。此外,我们还发现与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠骨骼中成骨细胞分化的相关基因OCN、Col-Ⅰ的表达也显着降低,成骨细胞分化的转录因子Runx2的表达也显着降低,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。因此,在骨骼形成和发育过程中,TGR5能够影响骨骼中钙的沉积,调控成骨细胞分化相关基因的表达。（9）TGR5通过调控AMPK信号通路影响骨骼发育前面己经证明了 TGR5主要通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化,我们通过尾静脉注射的方式给TGR5缺失的小鼠给予AMPK激动剂GSK621（2mg/kg）注射,结果发现AMPK激动剂能够促进TGR5缺失小鼠骨骼的发育,也会促进成骨细胞分化相关基因OCN、Col-Ⅰ以及转录因子Runx2的表达。因此,在骨骼形成和发育过程中,TGR5能够通过AMPK信号通路影响骨骼的发育,调控成骨细胞分化相关基因的表达。结论总之,TGR5能够通过调控AMPK信号通路影响成骨细胞相关基因的表达,进而影响成骨细胞的分化和骨骼的发育。本研究不仅阐明了 TGR5在骨形成过程中的生理功能,为骨代谢的分子机制提供了新的见解,也为临床治疗骨相关疾病提供了新的理论基础和靶点。

买买艾力·玉山^[2]（2020）在《rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究》文中进行了进一步梳理目的:1)建立一个合理的可重复的大鼠负重长骨牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）模型,为今后进一步探讨和深入研究促进牵张成骨区骨再生与矿化的方法以及分子机制奠定基础;2)建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的获取和体外培养体系,并进一步扩增,纯化及鉴定。通过人重组血小板衍生生长因子-BB（rhPDGF-BB）基因慢病毒体外转染BMSCs并观察对BMSCs的影响;3)以大鼠自体BMSCs作为载体,通过体外携带rhPDGF-BB基因的慢病毒转染后,将rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs导入大鼠股骨牵张间隙中,探讨rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs对大鼠股骨牵张间隙新生骨再生矿化的影响,进一步为临床上应用牵张成骨技术（骨传送技术）治疗四肢大段骨缺损探讨一种快速而有效的缩短治疗周期的治疗方法。方法:1)大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立:选择雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠为实验动物,<6月龄,350-400g。使用自行研制的延长型外固定器,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,选择大鼠右侧股骨中段行截骨后用4枚螺钉固定延长型外固定器。术后经过7天潜伏期后进行缓慢牵张,速度为0.5mm/天（分两次）,连续牵张14天,共牵张延长7mm,牵张结束后固定牵张器。分别于牵张结束后第0周,2周,4周及8周四个时间点处死3只动物,处死前麻醉状态下行X线检查,处死后取出右侧股骨标本进行大体观察,组织学HE染色及番红固绿染色观察;2)大鼠BMSCs的分离培养,鉴定及rhPDGF-BB基因体外转染:大鼠自体BMSCs的培养和传代,通过细胞活性检测,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色方法进行细胞鉴定,通过应用密度梯度离心法获取生长状态良好第3代大鼠BMSCs经上述方法鉴定后进一步应用基因转染和下一步的治疗。构建同时携有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因和rhPDGF-BB基因的重组慢病毒载体后经体外扩增,纯化后转染大鼠BMSCs观察其体外对BMSCs的影响;3)rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs促进大鼠股骨牵张成骨效果的检测:应用自行研制的延长型外固定器将54只SD大鼠随机分为3组,每组于术后21天分别在牵张区局部注射等剂量rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs（实验组）,骨髓MSCs（实验对照组）,PBS（空白对照组）,活体X线检查于DO牵张结束后不同时间点进行4次,检测时间点为牵张结束（术后天21天）,矿化期2周（术后第35天）,矿化期4周（术后第49天）,矿化期8周（术后第77天）。矿化期第8周末处死动物取双侧股骨,并小心剔除骨组织表面肌肉进行Micro-CT,生物力学及组织病理学检测分析。结果:1)纳入本次实验研究的实验动物活体观察提示所有入组实验动物均耐受手术且顺利完成术后牵张成骨过程,观察期间所有实验动物的饮食及大小便均正常,牵张结束后延长侧股骨较对侧相比达到预定目标长度。通过标准X线检查和组织学观察证实大鼠股骨牵张模型牵张间隙成骨良好;2)应用密度梯度离心法成功分离了大鼠BMSCs,细胞活性检测结果提示细胞生长良好,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色结果提示表达高水平的ALP活性,矿化细胞外基质,形成矿化结节。构建出的rhPDGF-BB基因体外转染鉴定过的大鼠BMSCs,转染后对细胞的生长无明显影响;3)rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs局部应用于大鼠股骨牵张模型。X线片显示,矿化期第8周实验组10只延长区均达到骨性愈合,实验对照组和空白对照组分别为5只和4只达到骨性愈合的标准。生物力学测试（三点力学测试）结果表明实验组所有抗扭强度指标均显着优于其他两个对照组,且实验组抗扭强度指标与自体对侧未牵张正常股骨的抗扭强度相当。Micro-CT扫描后获得的数据结果分析提示矿化期第8周实验组牵张区间隙内新生骨骨痂的主要构成结构由皮质骨构成而松质骨结构极为少见,此外牵张间隙新生骨矿化区可见骨髓腔部分或全部与牵张两骨端骨髓腔基本贯通,其构成和结构与自身长骨管状骨的结构基本类似,而其他两对照组牵张区间隙内新生的骨组织以松质骨结构为主且骨髓腔结构改建较差。矿化期第8周获取的股骨标本行组织学切片后HE和Safranin O染色结果提示,实验组牵张间隙新生骨痂内软骨组织残留较少而两个对照组牵张区间隙新生骨组织结构上仍有部分软组织结构,新生骨已经矿化,皮质骨已连续,骨髓腔开始重建,提示rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs治疗处理后新生骨痂矿化明显。免疫组化结果提示三组中实验组OPN、OCN、VEGF和CD31表达高于两对照组。结论:1)自制延长型外固定器能够满足大鼠单侧股骨牵张的要求,牵张成骨的潜伏期成骨与骨折愈合过程类似,但牵张成骨在其特有的牵张期和矿化期的时间段里牵张区间隙新骨再生具有其特有的组织学变化特点。本实验部分通过所获得的大鼠股骨参数,自制研发出适用于研究SD大鼠股骨牵张成骨模型的微型单边可延长型外固定装置,并顺利构建出可重复性较高适合大批量SD大鼠DO实验研究的动物模型,为今后利用DO动物实验模型并通过细胞或基因治疗缩短治疗周期或DO过程中的细胞分子机制的研究提供动物模型实验平台;2)密度梯度离心法获取的大鼠BMSCs体外培养结果提示其增殖活性较强,鉴定结果提示其可作为本次实验研究进行细胞治疗以及基因治疗较为理想的种子细胞。目的基因靶细胞转染后在不同时间点通过不同倍数荧光显微镜下观察结果提示,脂质载体介导的瞬时转染可以使rhPDGF-BB基因在BMSCs中成功表达;3)X线,Micro-CT,生物力学,组织学和免疫组织化学观察都证实,与单纯BMSCs及PBS相比,rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs可较为有效的促进大鼠股骨牵张间隙区成骨过程中新骨的形成和矿化。应用rhPDGF-BB基因体外转染BMSCs于牵张结束后局部应用能够促进牵张成骨中的骨再生从而缩短DO治疗周期,为临床上应用牵张成骨（骨传送）技术治疗骨缺损提供了一个新的策略。

潘政军^[3]（2019）在《Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究》文中指出研究目的:探讨抑制细胞调亡的B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因（Bcl-xL）对人脐带血干细胞定向诱导分化的影响,观察Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞定向诱导分化以后修复兔关节软骨损伤的疗效。研究内容:（1）人脐带血干细胞的获取,分离培养、定向诱导分化成软骨细胞;（2）慢病毒编码的抑制细胞凋亡基因Bcl-xL转染人脐带血干细胞;（3）检测Bcl-xL基因过表达对干细胞凋亡的影响;（4）检测Bcl-xL基因过表达对干细胞分泌II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3和基质金属蛋白酶3等蛋白的影响;（5）制造兔膝关节软骨损伤模型;（6）海藻酸钠盐支架包被Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞,植入并修复兔软骨损伤;（7）检测植入的人脐带血干细胞是否能在异种动物体内存活;（8）HE、MASSON和改良蕃红O-固绿等染色方法观察软骨缺损的修复;（9）免疫组化、实时PCR、WB等方法检测Bcl-xL基因的表达对动物体内软骨细胞分泌II型胶原、半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3等蛋白影响。材料与方法:（1）在正常分娩过程中获得人脐带血,体外分离获取干细胞,贴壁培养。取P2代细胞用TGF-β1因子联合使用胰岛素样生长因-1和地塞米松诱导干细胞向软骨细胞方向分化,培养至细胞爬满玻片时,用甲苯胺蓝染色和免疫组化染色方法鉴定诱导分化的效果,并与对照组比较。（2）用编码Bcl-xL的慢病毒对人脐带血干细胞进行修饰,取第3代人脐带血干细胞接种于6孔板,当细胞融合达到5070%时,用编码Bcl-xL基因的慢病毒载体转染人脐带血干细胞。实验分四组进行,分别为对照组、诱导组、诱导+Bcl-xL慢病毒转染组、诱导+慢病毒空载组。对照组只分离培养干细胞,不加任何诱导因子;诱导组加入TGF-β1等诱导因子;诱导+Bcl-xL慢病毒转染组是在诱导组的基础上再加入编码Bcl-xL基因的慢病毒;空载组是在诱导组的基础上只加入未编码Bcl-xL基因的慢病毒。以上四组继续培养48h,在倒置显微镜下连续观察并记录细胞形态特征;甲苯胺蓝染色证实Bcl-xL基因转染后的干细胞仍具有软骨细胞的特征;通过流式细胞仪鉴定软骨细胞特征性的表面抗原如:CD90和CD105的表达。通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况,评价Bcl-xL基因对干细胞的凋亡的影响。实时PCR检测Bcl-xL基因在mRNA水平的表达;同时以β-actin为内参;Western blotting（WB）印迹法检测Bcl-xL基因在蛋白水平的表达;实时PCR及WB等方法检测Bcl-xL基因表达及其对II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3、基质金属蛋白酶3等蛋白表达的影响;SPSS17.0软件统计学分析比较各组间mRNA和蛋白水平表达的差异。（3）制备海藻酸钠支架,加入人脐带血干细胞形成细胞-支架复合物。将1.2%的海藻酸钠溶液滴入102m M氯化钙溶液在模具中凝固形成无细胞的海藻酸钠支架;将人脐带血干细胞加入1.2%的海藻酸钠溶液制成1×106/ml的单细胞悬液,滴入102m M氯化钙溶液在模具中凝固形成含人脐带血干细胞的海藻酸钠支架复合物。（4）制造兔软骨损伤模型,30只三个月大的日本大耳兔,分为5组,每组12只膝关节。麻醉后备皮,双侧后腿膝关节内侧切口进入膝关节,在股骨髁关节面用电钻造成一个直径4mm,深度约3mm柱状缺损,穿透软骨下骨,造成全层关节软骨损伤。按照5种不同的方式修复软骨缺损:假手术组（对照组）:只进行假手术,软骨无损伤;模型组:进行软骨损伤造模而未予其它治疗干预措施,然后直接缝合;空载体治疗组:慢病毒空载体转染人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域;干细胞治疗组:未经慢病毒转染的人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域。Bcl-xL基因修饰治疗组:Bcl-xL基因修饰慢病毒转染人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域。饲养8周后全部动物处死,获取膝关节标本。采用抗人细胞核特异性抗体鉴定植入软骨缺损处的干细胞在正常免疫功能的兔体内是否能存活;观察Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞移植治疗关节软骨损伤的效果,用HE、MASSON、改良番红O-固绿等染色方法观察关节软骨损伤的修复效果,用免疫组化、实时PCR及WB等方法检测动物体内Bcl-xL基因的表达及其对II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3等蛋白表达的影响;用SPSS 17.0软件统计学分析比较各组间mRNA和蛋白水平表达的差异。结果:1、人脐带血中可成功分离出具有多向分化潜能的干细胞,并可体外培养、定向诱导分化软骨细胞;2、用编码Bcl-xL的慢病毒对人脐带血干细胞进行修饰,干细胞增殖分化后仍具有软骨细胞特征。干细胞内的Bcl-xL基因在mRNA和蛋白水平的表达均上调;Bcl-xL基因可抑制干细胞的调亡,Bcl-xL基因可促进软骨细胞II型胶原蛋白在mRNA和蛋白水平的表达,显着抑制半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的表达,组间分析具有统计学意义,P<0.05。3、海藻酸钠盐支架-干细胞复合体植入动物体内,检测到干细胞存活;病理染色显示,各组软骨损伤均有修复,3种染色方式均显示:Bcl-xL基因修饰的干细胞组软骨结构修复最满意,而模型组的修复相对最不满意;免疫组化染色、实时PCR和WB检测结果基本一致:软骨损伤促进了II型胶原纤维在mRNA和蛋白水平的表达,而Bcl-xL基因修饰进一步增加了II型胶原纤维的表达;对于半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的检测结果显示:与假手术组比较,模型组的半胱氨酸蛋白酶-3和基质金属蛋白酶3表达均明显上调（P<0.05）,而Bcl-xl基因修饰组人脐带血干细胞相对模型组明显下调。组间分析差异显着（P<0.05）。此外,与正常人脐带血干细胞相比,Bcl-xL修饰的干细胞可进一步降低软骨损伤诱导的半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的表达,提高II型胶原蛋白的表达。结论:1、人脐带血干细胞可定向诱导分化成软骨细胞,Bcl-xL基因修饰可降低干细胞凋亡。2、移植人脐带血干细胞有利于修复软骨损伤,而Bcl-xL修饰则能提高人脐带血干细胞移植修复软骨损伤的疗效。

肖樵苏^[4]（2017）在《脂质体介导双基因转染兔骨髓基质干细胞的体外成骨能力研究》文中指出目的:（1）探索采用密度梯度离心法分离、贴壁法收集并体外培养兔骨髓基质干细胞并将其作为组织工程骨种子细胞的方法（2）探索利用脂质体介导BMP-2、VEGF-165双基因质粒转染兔骨髓基质干细胞的方法,明确经BMP-2、VEGF-165共转染后兔骨髓基质干细胞的细胞增殖能力变化（3）明确BMP-2、VEGF-165基因在共同转染兔骨髓基质干细胞后表达过程中的相互影响及双基因转染兔骨髓基质干细胞的体外成骨能力鉴定。方法:（1）提取健康新西兰兔的股骨骨髓,利用密度梯度离心分离骨髓成分、体外培养及增殖兔骨髓基质干细胞并鉴定。（2）利用Lipofect-amine2000脂质体介导A组:p IRES-h BMP2-h VEGF165转染组、B组:p IRES-h BMP2转染组、C组:p IRES-h VEGF165转染组、D组:空载体转染组的质粒分别转染兔骨髓基质干细胞。荧光显微镜观察前述各组以不同质粒转染兔骨髓基质干细胞后的形态并以MTT法绘制生长曲线,根据MTT结果和转染后荧光照片明确不同质粒转染后细胞的增殖能力变化。（3）通过酶联免疫吸附法等方法明确各组在不同质粒转染后BMP-2和VEGF-165基因的表达情况,以及根据对碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型骨胶原蛋白以及骨钙素染色水平的检测以比较其体外成骨能力与单基因转染组的区别。结果:（1）兔骨髓基质干细胞的形态变化:原代兔BMSCs分离的初始可见悬浮培养液中绝大多数的细胞为单个存在的较大体积圆形有核细胞,48小时后逐渐贴壁细胞变多,且部分细胞变为三角形、逗号形或短棍形,可观察到少许伪足形成;培养后6-10天时,许多贴壁细胞的体积逐渐变大,开始汇集形成集落并不断增大,细胞形态开始向多角形以及细长形变化,胞内变为1至2个细胞核;培养14天时培养瓶出现融合的单层细胞,大部分细胞的细胞核消失。传代后的兔BMSCs细胞呈球形或椭圆样,很快贴壁并重新变为梭子形,待细胞完全贴壁及密度提高后,细胞形状成为单一的梭形。经过传代后细胞的增殖速度较传代前变快,传代5到7天后细胞再次铺满培养瓶底,呈螺旋状均匀分布。进一步行连续传代后未见明显的细胞形态变化。基因转染后的兔骨髓基质干细胞仍为梭子形或多边形,分裂增殖速度较转染前有所降低。通过荧光显微镜观察,转染后24小时后各转染组即可见少量绿色荧光,证明转染成功,但转染率尚低。转染48-72小时后荧光逐渐增强,直至转染4d后见荧光强烈发出。（2）转染后MTT结果:各组细胞的OD值随培养时间增加而逐渐增长,各细胞组之间和每个细胞组在各时间点间所测得的OD值增长情况无明显统计学差异。P3代普通兔BMSCs细胞在1、2d时OD无明显变化,3d后OD值出现了明显增加直到第7d时达最大值。A组转染后的细胞在第1d和2d时OD值未见明显增长,第2天后OD值逐渐增长,增长幅度不及原代细胞大,OD值在第6d达高峰后缓慢下降进入平台期。B组及C组细胞OD值与生长曲线与A组细胞相当,两两对比未见明显统计学意义。而D组细胞与P3代普通兔BMSCs细胞OD值变化相比未见明显统计学意义。（3）不同质粒转染4d后,酶联免疫吸附法（Elisa）检测见p IRES-h BMP2-h VEGF165转染组BMP-2及VEGF-165基因表达达到最大化,分别与p IRES-h BMP2转染组及p IRES-h VEGF165转染组相比较,BMP-2和VEGF-165表达较单基因转染组明显升高,具有明确的统计学差异（P<0.05）,空质粒转染组为阴性表达。（4）在不同组质粒转染转染4d后,经形态学观察和免疫组化实验明确p IRES-h BMP2-h VEGF165转染组的Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素表达较p IRES-h BMP2转染组及p IRES-h VEGF165转染组、空质粒转染组明显提高,有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）利用脂质体介导BMP-2、VEGF-165双基因质粒体外转染对的兔骨髓基质干细胞的增殖能力无明显影响,与分别以BMP-2、VEGF-165单基因转染相比无明显区别;（2）双基因转染后VEGF-165和BMP-2基因在兔骨髓基质干细胞中得到了良好表达,相较VEGF-165、BMP-2基因分别单独转染兔表达水平显着提高,VEGF-165和BMP-2基因在共转染兔BMSCs细胞后的表达相互促进,具有协同成骨作用;（3）BMP-2、VEGF-165双基因转染后的兔骨髓基质干细胞相较单基因分别转染骨髓基质干细胞具有更优良的体外成骨能力,为接下来的实验过程中构建组织工程骨用于动物体内长段骨缺损修复提供了研究基础。

张剑飞^[5]（2016）在《Dlx2过表达对小鼠间充质细胞骨向分化及软骨向分化的作用及机制研究》文中研究指明[目的]先天性颅颌面部缺损及畸形的诊治是长期以来口腔颌面外科医师所面临的一项挑战。因此,探究颅颌面发育畸形的原因及机制对于临床诊疗及优生优育具有重要意义。目前只有少数颅颌面发育畸形的发病机制得到解释并明确定位,如van der Woude综合征、腘翼综合征均由IRF6突变所致,常染色体隐性遗传腭裂由PVRL1缺失所致。部分恒牙缺失及腭裂突变由Msx1突变引起等。但大多数疾病并无明显遗传特征,多为表观遗传水平改变。而转录调控作为表观遗传调控的重要组成部分,其在发育、肿瘤、炎症等过程中均起核心调节作用。同源盒基因作为转录因子的核心组分,对颅神经嵴细胞来源的颅颌面发育过程起着重要的调控作用。而作为同源盒基因的组成成分之一的Dlx家族,其在胚胎发育中的缺失或表达异常会出现一系列的功能障碍。既往研究中,Dlx2的基因敲除鼠及我们课题组之前构建的Dlx2颅颌面条件性过表达转基因小鼠均出现较多的颅颌面先天发育畸形,如异位软骨、成骨障碍等。然而,对于Dlx2在成骨和成软骨过程中的具体调控机制尚不清楚。本课题拟对Dlx2在小鼠间充质来源的细胞成骨和成软骨分化中的调控作用开展系列研究并探讨其调控机制。[材料和方法]本研究分为两部分。第一部分:选择小鼠颅盖骨来源的Mc3T3 E1细胞系及小鼠股骨来源的骨髓基质干细胞（m BMSCs）,通过构建慢病毒提高Dlx2在上述细胞成骨向分化过程中的表达水平。通过实时定量PCR技术、蛋白免疫印迹技术（WB）验证已构建好的Dlx2过表达细胞系;茜素红及碱性磷酸酶染色技术等对过表达细胞株及对照组进行染色及相应定量分析;实时定量PCR技术进行可能靶向因子的筛选;染色质免疫共沉淀技术（Ch IP）、荧光素酶报告基因检测技术、蛋白免疫共沉淀技术（co-IP）技术对可能机制及靶向因子进行验证,由此得到Dlx2在间充质来源的细胞成骨向分化过程中扮演的角色及机制。第二部分:选择小鼠颅底联合软骨细胞及小鼠TMC-23软骨细胞系,通过构建慢病毒提高Dlx2在上述细胞成软骨向分化过程中的表达水平。通过实时定量PCR技术、蛋白免疫印迹技术（WB）验证Dlx2过表达细胞系;基因芯片技术进行候选靶基因的筛选;阿利新蓝染色染色技术等对过表达细胞株及对照组进行染色及相应定量分析;染色质免疫共沉淀技术（Ch IP）、荧光素酶报告基因检测技术对可能机制及靶向因子进行验证,由此得到Dlx2在间充质来源的细胞成软骨向分化过程中的作用及可能机制。[结果]第一部分:1、成功构建Dlx2过表达的小鼠成骨前体细胞系（Mc3T3 E1 cells）。2、Dlx2过表达后,碱性磷酸酶染色及茜素红染色明显更深,碱性磷酸酶定量分析表明成骨活性增强。3、通过荧光实时定量的方法从成骨相关基因分子通路里筛选可能的靶向基因osteocalcin,在Mc3T3 E1、C3H10 T1/2细胞系及m BMSCs中验证Dlx2的过表达均能够明显上调osteocalcin的表达水平。4、荧光素酶报告基因实验表明Dlx2过表达能够上调携带osteocalcin启动子2kb序列的荧光素表达水平;Ch IP实验能够在第八段序列内部得到阳性条带;而将上述阳性序列的片段定点突变后,携带突变后osteocalcin启动子序列的质粒的荧光素酶的表达水平与空白组较为一致。5、蛋白质免疫共沉淀实验发现Dlx2过表达的样品能够检测到Msx2的表达,提示Msx2可能做为一个共转录因子参与了Dlx2的成骨促进作用。第二部分:1、成功构建Dlx2过表达的小鼠软骨前体细胞系（TMC23 cells）,并将过表达Dlx2的TMC23细胞及转染空载病毒的TMC23细胞样本进行基因芯片分析。2、Dlx2过表达后,软骨相关的阿利新蓝染色着色明显更深。3、将1芯片分析结果与软骨发育相关的基因进行集合分析,得出Dlx2可能通过与以下基因相互作用参与软骨分化过程:MMP2、MMP13、MMP14、VEGFa、VCAM1、ICAM1、Sox6、Fibin、Adam 12、Adam 15、Dlx5、ECM。之后通过q RT-PCR、Western Blot及通路相关分析,定位MMP13是Dlx2参与软骨分化的核心作用因子。4、将MMP13的上游2kb启动子序列进行荧光素酶报告基因实验分析,得出在Dlx2过表达的细胞内部,Dlx2的过表达能够明显抑制携带MMP13启动子的荧光素酶的发光水平;同时染色质免疫共沉淀实验（Ch IP）分析表明在MMP13启动子区域的第四段序列出现明显富集;且将上述核酸序列内部的可能结合位点进行定点突变后,荧光素的表达水平能够回归到空白对照组水平。[结论]Dlx2可通过结合于osteocalcin的启动子序列的,提高osteocalcin的转录水平,促进间充质细胞来源的Mc3T3 E1细胞系和小鼠BMSCs成骨向分化;此外,Dlx2可通过结合于MMP13的启动子序列,降低MMP13的转录水平及翻译水平,继而抑制间充质细胞来源的TMC-23细胞和小鼠颅底软骨细胞的细胞外基质的降解,从而参与软骨终末分化的调控。

范大鹏^[6]（2016）在《SHP-2基因转染骨髓间充质干细胞修复大鼠骨缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理目的 骨缺损的再生主要依靠骨自身的修复能力。骨组织虽然具有强大的再生能力,但因各种原因导致的大面积骨缺损仍是临床中比较棘手的问题。在组织工程中,生长因子是诱导成骨能力的重要媒介。骨组织工程利用生长因子诱导细胞成骨,并联合支架材料用于骨缺损,已经被临床和科研广泛采用。目前在组织工程中应用较为广泛的生长因子主要有骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、转化生长因子等。但它们都存在着相应的缺点和弊端,难以完美满足骨组织过工程发展的需要。而我们通过文献研究发现目前有多项研究报道SHP-2基因可以有效地促进破骨细胞分化,并参与成骨分化细胞通路,且该基因敲除的小鼠出现了骨发育迟缓障碍,因此我们预测该基因可以促进成骨细胞分化和骨生成,并通过实验证实这一假设方法 使用PCR方法扩增SHP-2基因,构建SHP-2基因慢病毒表达载体,并转染大鼠骨髓间充质干细胞。根据细胞状态设计4个实验组,分别为:单纯BMSCs组,经成骨细胞诱导液诱导的BMSCs组,经SHP-2基因修饰的BMSCs组和成骨细胞诱导液联合SHP-2基因修饰的BMSCs组,四组细胞进行体外培养,并在不同的培养阶段利用PCR、Western检测定各组成骨标志物的表达,碱性磷酸酶和茜素红染色检测成骨活性。制作大鼠颅骨缺损模型,将4组细胞/磷酸三钙复合物植入到颅骨缺损处,取材后将组织进行放射学检查、HE、Masson染色和免疫组织化学染色鉴定骨修复的效果。结果 SHP-2慢病毒表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞后持续有效的增加了SHP-2在细胞内的表达。体外实验中,SHP-2基因转染BMSCs组和成骨细胞诱导液联合SHP-2基因修饰的BMSCs组成骨标志物较其他组表达为高。在体内实验中,植入后8周大体组织学和影像学检查表明,SHP-2基因转染组和SHP-2基因转染联合成骨细胞诱导液诱导组在成骨标志物表达和促进骨组织生成方面多于其他组。结论 SHP-2高表达可促进大鼠骨髓间质干细胞在体外向成骨细胞分化。SHP-2基因转染大鼠骨髓干细胞联合β-TCP支架可以有效地的修复大鼠骨缺损模型。

汤浩^[7]（2013）在《强化表达VEGF的老年人骨髓基质细胞治疗脑缺血的实验研究》文中指出一、研究背景脑血管病是严重危害人类健康的三大致死疾病之一,具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率等特点,给家庭和社会带来了极大的负担。在脑血管疾病中,缺血性脑血管病占了80%左右。然而,迄今为止只有重组组织血纤维蛋白溶酶原激活物（rt-PA）一种药物获得了FDA的批准用于急性脑缺血的治疗。但rt-PA介入溶栓治疗有严格的时间限制（必须在卒中发生6小时内应用）,而且大剂量使用rt-PA也增加了发生脑出血的危险性。因此,如何促进脑缺血后有效的组织和功能修复是当前研究的热点,但也是难点,而干细胞移植是近年来兴起的具有良好的临床应用前途的治疗脑缺血的新方法之一。BMSCs是源于骨髓的一种多潜能成体干细胞,其应用于细胞治疗的主要优势在于其可以自体移植,因而不存在胚胎干细胞移植所存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制。而且骨髓源成体干细胞取材相对简单,不像神经干细胞主要位于脑室下带、海马等脑深部结构中,损伤风险性大、获得困难、细胞来源有限。BMSCs移植治疗已经应用于脑缺血动物实验及临床试验性治疗。BMSCs移植治疗脑缺血的方法较多,包括通过静脉途径、动脉途径或脑内局部注射移植,用于BMSCs治疗大鼠大脑中动脉阻断模型（MCAO）,结果发现移植的细胞能定向向缺血灶周围迁徙,参与损伤修复,并促进神经功能的恢复。由于BMSCs具有分化成神经细胞的能力,利用移植的BMSCs发挥细胞替代作用重建神经环路是最直接的治疗方法。然而,大部分的研究发现移植的BMSCs只有相当少的一部分表达神经元或神经胶质细胞的表面标志,而即使这些少量的表达神经组织标志的细胞,目前也没有电生理的或其他方面的证据显示它们具有神经细胞的功能,更无法确定它们是否同其他的神经细胞建立了联系。目前的研究显示,BMSCs的起效机制是多方面的,如：减少缺血半影区细胞凋亡、促进内源性神经干细胞的增殖、促进缺血区新血管再生、抑制胶质瘢痕增生以及促进轴突再生等。归结起来,BMSCs治疗脑缺血的机制主要的并不是其替代了缺失的神经元,而是其在脑内缺血的微环境的刺激下,发挥了“分子工厂”的作用,分泌各种营养因子,介导了以上的治疗作用。BMSCs在骨髓中的数量稀少,因此在应用于细胞移植治疗时必须进行体外扩增以获得足够多的细胞。然而,BMSCs同大多数的成体细胞一样,会发生衰老,主要表现在两个方面：①随年龄增长,BMSCs的数量和质量均有明显下降,而老年人正是脑缺血的高发人群,是可能的需要细胞移植治疗的主体；②BMSCs在体外传代过程中,细胞形态会逐渐发生变化,由细梭形变成宽扁平状,细胞的增殖能力、分化潜力、乃至向病灶区归巢的能力均会逐渐丧失。因此,如果没有采取特殊的处理方法对BMSCs进行改造,只是在体外充分扩增BMSCs再回输回病人体内,实际上已经大大缩短了BMSCs的寿命,也严重影响了治疗的效果。既往对BMSCs发生衰老的机制研究表明,BMSCs不表达端粒酶是一个很重要的原因。因此为了延长BMSC的寿命甚至使之永生化,近几年来,有多家实验室采用的是hTERT基因转染的方法,并成功获得BMSCs永生细胞系。此法建立的细胞系在体外长期培养扩增中端粒长度没有明显缩短,保持了同原代BMSCs相似甚至更好的增殖及多向分化潜能。更为重要的是,用hTERT转染建立的BMSCs细胞系在体外长期培养后仍保持了正常的染色体组型,细胞的生长存在接触抑制,体内、体外实验均没有明显的致瘤性。这是我们选择hTERT作为修饰改造BMSCs的基因之一的原因。此外,通过神经干细胞移植或神经营养因子来促进受损的神经网络的修复是脑缺血治疗的有效策略,但我们注意到,在缺血缺氧的微环境中,干细胞的成活十分困难,增殖和分化能力明显减弱,难于发挥治疗作用。血供的恢复是神经修复的基础,而VEGF是已知的胚胎发育期血管发生及成体后血管再生的最关键因子,VEGF对于脑缺血的治疗作用已有较多文献报道,因此我们又选定了VEGF作为改造BMSCs的另一个基因。既往对于老年的BMSCs的研究较少,对其进行双基因改造的研究更是乏见,近年有研究表明,VEGF和hTERT两者之间有难得的协同增强效应,这也是对我们这一探索性研究意义的一个侧面的肯定。二.研究目的骨髓基质细胞（BMSCs）移植是治疗脑缺血的一个有效策略,然而,BMSCs随年龄增长以及在体外扩增过程中会发生衰老,这阻碍了它的治疗应用。本研究拟以人端粒酶催化亚单位（hTERT）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）慢病毒表达载体双基因联合修饰老年人的BMSCs,探索构建强化表达VEGF的永生化BMSCs系,检测其生物学特征,并以改造后的BMSCs治疗大鼠脑缺血／再灌注模型,检测治疗效果,探讨治疗机制。在实验过程中,与未经修饰的BMSCs及hTERT或VEGF单基因修饰的BMSCs进行对比研究。由于BMSCs含有自体的遗传信息,研究成果将有助于探索制备个体化的（patient-specific）、针对脑缺血治疗的（disease-specific）干细胞产品,也会为进一步的实验研究打下坚实的基础。三.材料和方法1、老年人骨髓基质细胞hBMSC的分离、培养与鉴定：采用本实验室已建立的全血细胞贴壁培养的方法,取正常成年人骨髓,年龄在50岁以上,1：1-1：2加入含有20%FBS血清的DMEM low glucose培养基（含1%双抗）,48小时后半量换液,小心去除上层悬浮红细胞,勿晃动下层贴壁细胞,随后继续培养。72小时候再次半量换液,并于倒置显微镜下观察,可见贴壁细胞,随后3～4天正常全量换液,去除多余的不贴壁细胞,一般15天左右可长满,为原代hBMSCs。随后用0.05%的胰酶消化,1：2传代,多次传代后去除可能的成纤维细胞。2、实验分组：将实验细胞分为以下5组：①未转染组（hBMSC）;②空病毒组（vehicle）③VEGF转染组（hBMSC-VEGF）,应用慢病毒载体携带VEGF165基因以最佳感染复数（multiplicity of infection, MOI）=5体外转染hBMSCs;④TERT转染组（hBMSC-TERT）:应用慢病毒载体携带hTERT基因以感染复数MOI=5体外转染hBMSCs;⑤双病毒转染组（hBMSC-V&T）:慢病毒载体携带VEGF和hTERT依次以感染复数MOI=5体外转染hBMSCs.3、细胞表型特征：流式细胞仪检测各组细胞表面标志。4、体外管状结构形成：检测细胞接种在Matrigel Matrix（基底膜基质）上,观察细胞形成毛细胞血管状结构的能力。5、裸鼠体内成血管能力测试：将各组细胞移植入裸鼠皮下三周后检测其在裸鼠体内形成血管的能力。6、移植细胞治疗短暂脑缺血模型（tMCAO）大鼠,对其有效性做行为学、组织学、细胞学以及蛋白学等多水平的观察检测,并试图揭示其可能的机制。7、对细胞移植的模型鼠行CatWalk行为学综合评价,以期找到最适合的指标,并评价治疗的效果。8、取移植细胞的模型大鼠脑组织,研究移植细胞在体内的转归及其对缺血大脑分泌细胞因子的影响。9、所有原始数据用均数±标准误（X±SE）表示,采用SPSS13.0统计软件处理。造模后各组大鼠各时间点的数据比较用重复测量的方差分析,单个时间点间数据比较用one-way ANOVA分析,组间的多重比较采用LSD检验法,如果数据方差不齐,则采用welch法进行多组均数的比较,组间多重比较采用Tamhane’s T2法；以P<0.05为差异有统计学意义。四.结果1、本课题组前期实验已验证慢病毒对细胞的转染是成功有效的,细胞的寿命得到显着延长,细胞对端粒酶和VEGF的表达显着增加,并没有明显的致瘤性。2、在前期实验结果的基础上,我们进一步的实验表明,VEGF和hTERT的转染能显着增强hBMSCs的体外成血管能力。3、免疫荧光结果显示Dil标记的移植细胞增加了裸鼠体内表达vWF的血管状结构的形成,并整合进了这种新生的血管样结构。统计结果显示,VEGF或和TERT的转染能显着提高hBMSC移植后在裸鼠体内形成血管样结构的密度和周长。4、大鼠移植hBMSC后,神经功能评分皆有好转,移植组与对照组的差异早期并不是非常显着,但到第7天开始在hBMSC-V （6.5±0.18）和hBMSC-V&T（6.9±0.24）组与对照组（7.6±0.26）见可见显着性差异,并在随后的14天和28天两个时间点移植细胞干预的三组与对照组均出现了显着性的差异。5、TTC染色结果表明,hBMSC的移植对大鼠的梗死区域有减小作用,而其中hBMSC-V&T和hBMSC-V组的效果最明显。6、对大鼠缺血损伤侧的左前肢压强结果分析,各组大鼠28天的左前肢压强有一定程度的恢复,但是在各组间比较,移植hBMSC-V, hBMSC-T和hBMSC-V&T细胞的三组大鼠左前肢压强恢复更显着,与对照组比较有显着性差异,并且V&T组恢复的程度最大。7、对各组大鼠缺血28天后大鼠的四肢最大接触面积结果分析,移植BMSC-V, hBMSC-T和hBMSC-V&T细胞的三组大鼠四肢最大接触面积较仅移植hBMSC的对照组有显着增大。8、模型组大鼠运动速度在造模后第1、3、7、14、28天均比对照组明显减慢,差异均有统计学意义（P<0.05）,而步调改变为一过性,模型组大鼠造模后第1、3、7天与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）,第14、28天与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。9、MRI成像结果基本同TTC染色结果较一致,各组间存在差异,28天时hBMSC-V&T组的脑梗死灶最小,恢复的程度最大,为153.5±8.45mm3, hBMSC-V组为174.6±6.80mm3, hBMSC-T组为183.1±10.17mm3,而hBMSC对照组为242.3±9.85mm3。10、模型鼠脑组织切片显示移植细胞主要分布在缺血半影区,沿缺血灶周边分布,观察终点时仍有较强的荧光表达。11、基因检测结果表明,模型鼠脑组织的VEGF（人和大鼠）、hTERT（人）、突触素P38表达均增加,CD31染色表明细胞整合进新生的血管,且较对照组血管数目和密度都有增加。五.结论1、hTERT基因慢病毒载体和VEGF基因慢病毒载体联合修饰老年人BMSCs,建立强化表达VEGF的BMSCs细胞系是可行的,安全有效的,具有重要的临床价值。2、大鼠短暂脑缺血模型验证联合修饰的细胞对大鼠的治疗效果显着,神经功能恢复较对照组有明显改善。3、强化表达VEGF的BMSCs细胞治疗缺血性脑卒中的机制可能是增加了大鼠损伤灶周围神经营养因子的分泌,并促进了局部新生血管的形成。

周诺^[8]（2012）在《PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究》文中研究表明目的牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）技术是利用骨痂的愈合机理产生新骨,是一种内源性的骨组织工程学技术。自其开始应用于颅颌面领域以来,大量基础和临床研究逐渐开展,随着基础研究的深入以及该技术的改进和成熟,牵张成骨在颌面部整形、肿瘤的术后重建以及牙槽种植修复等方面展现出了广阔的应用前景,成为口腔颌面外科领域的研究热点。虽然DO有许多传统手术不可比拟的优势,已被广泛地应用于各种颅颌面的畸形以及四肢短小畸形的矫治,但其较长的牵张和固定时间,限制了其在临床上的广泛应用。因此如何提高DO的新骨形成的速度,缩短其固定时间,减少其并发症的发生和保证新骨形成质量,正成为目前该领域的研究热点。本课题利用hBMP-2作为促进因子,将基因工程和组织工程的技术结合起来,先把hBMP-2转染入兔BMSCs,构建稳定表达hBMP-2的BMSCs,再与组织工程支架材料Pluronic F-127复合,注射入牵张区内,使hBMP-2能在牵张区内稳定持续地起作用,拟让其能促进兔下颌骨的牵张成骨新骨生成。从组织学水平、蛋白水平、基因水平观察和检测牵张间隙内新骨的形成以及改建的情况,为牵张成骨技术在治疗各种颌面部畸形或骨缺损等疾患上的广泛应用奠定基础。方法1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化:取成年健康新西兰大白兔,穿刺双侧胫骨抽取骨髓,通过密度梯度离心法收集细胞后培养,原代培养8-10d后传代培养,按照1:3传代,每3-4天可传代1次,传到第3代时用地塞米松,β-甘油磷酸钠,抗坏血酸配制而成的成骨诱导分化液进行成骨诱导14至21天,并分别用茜素红染色,ELISA以及免疫组化的方法检测其矿化结节的形成和ALP、BGP的表达。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs:取第3代BMSCs,用脂质体介导携带hBMP-2基因的pcDNA3.1质粒转染入BMSCs中,观察GFP表达的情况,MTT法检测转染后细胞的增殖和生长的能力,通过RT-PCR检测瞬时转染后hBMP-2 mRNA的表达。转染后再用G418筛选2周,筛选出稳定转染的阳性细胞,收集备用。将经过筛选后的BMSCs培养4周后,对其进行BMP-2的免疫组织化学以及Western Blot检测。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养:利用Pluronic F-127低温下为水溶液,室温可凝固的特点,冰浴中制备凝胶并消毒后与转染hBMP-2的BMSCs复合,调整细胞浓度,使细胞浓度达到2.5×107个/ml,MTT法检测Pluronic F-127的细胞毒性。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型的建立:取成年健康新西兰大白兔6只,依据其下颌骨的解剖结构设计牵张器。利用传统单线骨皮质切开的术式,在右侧下颌骨第二和三磨牙间行骨切开术,固定牵张器。术后潜伏期为5天,第6天开始牵张,每天牵张2次,每次0.5mm,共牵张7mm,随后固定。于牵张固定2周、6周后分别摄X线片以观察新生骨愈合以及改建情况。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究:取健康新西兰白兔48只随机分为4组,每组12只,于固定期第2天进行干预。实验分组:A组:牵张间隙内注射200 u 1 hBMP-2基因修饰的BMSCs/Pluronic F-127凝胶复合物;B组:注射200μ1 hBMP-2基因修饰的BMSCs液;C组:注射200μ1 BMSCs液;D组:注射200μ1生理盐水。分别于牵张结束固定2w、6w各组处死动物6只,通过大体病理、摄X线片、扫面电镜、HE染色组织切片、免疫组化等手段检测新骨形成和改建情况。结果1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化结果:BMSCs培养8-10d后即可长满瓶底,并可传代,传代后细胞生长状态良好,可一直维持BMSCs的典型形态以及生长状态,细胞呈现长梭形形状,旋涡式的排列并可成功向成骨方向诱导。其中钙结节茜素红染色见阳性结节染色。ALP含量逐渐升高,并在2周后达到最高,与未诱导组有显着差异（p<0.05）。BGP免疫组化也呈阳性染色。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs的结果:利用脂质体介导携带hBMP-2的pcDNA3.1质粒成功转染BMSCs,转染效率约30%;转染24h能观察到弱荧光表达,48h后荧光强度增强;MTT法显示转染后的BMSCs生长增殖能力无明显变化;RT-PCR也检测到了hBMP-2 mRNA的表达。用G418成功筛选出稳定转染的细胞,该细胞培养4周可用免疫组织化学以及Western Blot方法检测到BMP-2蛋白地稳定表达。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养的结果:Pluronic F-127在4℃时为水溶液,37℃下为凝胶状,其与转染hBMP-2基因的BMSCs复合后,MTT检测结果见复合物中的BMSCs生长增殖能力无明显变化（p>0.05）。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型建立的结果:所有的实验动物都成功地完成了手术,术区与口内无穿通,无感染,并能顺利牵张。实验动物全部存活至预定时间,体重皆有不同程度地增加。从手术至取材,应用于体内的牵张器均固位良好,无断裂以及脱钉现象。X线片见新骨形成在时间段有明显变化,符合临床上牵张成骨的成骨规律。动物模型构建成功。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究结果:通过大体病理、X线、扫描电镜和HE染色组织切片观察,新骨形成质量由高到低排列为:A组>B组>C组=D组;通过免疫组化观察并经过灰度值统计软件分析,在固定期第2周和6周A组牵张区骨质量明显高于B组（p<0.05）,B组牵张区骨质量明显高于C组与D组（p<0.05）,在各期C、D两组间无明显差异（p>0.05）。结论1.密度梯度离心法简便、易行,可大量扩增、纯化兔骨髓间充质干细胞,所获细胞经过诱导后可向成骨细胞分化。2.通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因导入BMSCs,并使其获得基因及蛋白的表达。3.组织工程支架材料Pluronic F-127具有低温下为水溶液,室温可凝固的特点,细胞相容性良好。4.兔子不仅性情温顺,饲养方便,对手术耐受性好,易于操作,而且术后愈合效果好,是一个稳定可靠的实验模型动物,可适合较大样本的实验研究。5.hBMP-2基因修饰BMSCs复合可注射骨组织工程支架材料Pluronic F-127移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成,为临床上缩短牵张成骨治疗周期提供了一定的理论依据以及技术参考。

刘保一^[9]（2012）在《骨髓基质干细胞治疗兔股骨头坏死的研究》文中指出背景:骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cell,BMSC）是一类来源于骨髓,具有自我更新能力和多分化潜能的多能干细胞。在特定的培养条件下,可分化为成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞等间充质细胞,并且具有来源广泛,易于分离培养等特点,因此成为组织工程最为理想的种子细胞。近年来对股骨头缺血性坏死、骨组织工程学的研究表明,骨髓间充质干细胞不仅充当骨生成细胞的来源,而且可作为基因治疗技术适宜的细胞载体。股骨头缺血性坏死的修复与重建是骨科常见的难题,在保留股骨头治疗中,一个必须完成的步骤是清除坏死骨,为股骨头修复提供条件。而病灶清除后如何更有效的使骨缺损区的骨质再生与血运重建,临床亟需能够有效促进股骨头修复的新方法。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是其中关键的促血管化因子,且在骨组织发生、发育以及再生过程中起着重要的调节作用。然而,直接将VEGF-165应用于股骨头坏死处易被周围组织中的酶类所降解,作用时间短。基因治疗能克服上述缺点。近年来应用VEGF-165基因治疗骨缺损等各种骨科疾病成为国内外研究的热点,并已开始进行临床试验。因此,应用VEGF增强成骨能力可望成为股骨头坏死临床治疗的新途径。本研究拟以兔BMSCs为细胞模型,进行体外体外培养,构建以腺相关病毒（Recombinant Adeno-Associated Virus, rAAV）介导hVEGF-165转染的兔BMSCs复合物,关节镜下回植,探讨其在修复兔股骨头缺血性坏死中的作用,为股骨头缺血性坏死的基因治疗提供实验基础。股骨头坏死软骨的缺损一直是进行保头治疗延缓股骨头塌陷的一大难题,Bio-gide胶原膜负载骨髓间充质干细胞修复软骨缺损的试验研究为这一难题提供理论支持。目的:本实验拟研究兔骨髓基质干细胞分离、培养与鉴定的方法,探讨骨髓基质干细胞的向成骨细胞及软骨细胞转化的特性,检测骨髓基质干细胞成骨能力及成软骨能力,检测rAAV-2-hVEGF-165转染的骨髓间充质干细胞的转染效率及转染后的基因表达,探讨其作为股骨头坏死骨缺损及软骨损伤修复组织工程种子细胞的可行性,并将骨髓基质干细胞与Bio-gide复合培养,检测骨髓基质干细胞在Bio-gide生物膜的生长,探讨Bio-gide胶原膜做为骨髓基质干细胞生长载体的优势,研究髓芯减压关节镜监视下hVEGF基因转染骨髓间充质干细胞在治疗股骨头缺血性坏死中的作用及价值。方法:在无菌条件、水合氯醛麻醉（1.5ml/Kg）下,双侧股骨外侧髁和胫骨近端穿刺获取成年新西兰白兔（4月龄,体重2.0-3.0Kg）骨髓,采用密度梯度离心方法分离兔骨髓间充质干细胞并大量扩增,加入8ml的DMEM-低糖培养液（含10 %的胎牛血清）进行培养,倒置显微镜下观察细胞生长及形态特征,细胞标本苏木精—伊红（HE）染色,在细胞80%汇合以1: 3传代,MTT法测绘第1、2、3、4、5代细胞生长曲线,细胞免疫荧光鉴定兔骨髓基质干细胞。体外诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞及软骨细胞分化,并检测成骨及成软骨能力。制备rAAV-2-hVEGF-165转染兔骨髓间充质干细胞,应用腺相关病毒介导绿荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）转染兔骨髓间充质干细胞检测转染效率,将病毒以感染被率（MOI）为1×105v.g./cell进行转染。荧光显微镜检测计算转染效率。应用RT-PCR和Western bloting检测转染BMSCs中外源hVEGF基因的转录与表达,得出最佳的转染时间。将骨髓基质干细胞与Bio-gide胶原膜进行体外复合培养,通过倒置相差显微镜,透射电镜进行观察。144只新西兰白兔建立液氮即刻冷冻股骨头缺血性坏死模型,根据不同移植物随机分为4组,每组36只,A组为空白骨坏死对照组,B组为髓芯减压并BMSCs组,C组髓芯减压并hVEGF转染BMSCs组,D组髓芯减压植入hVEGF-165转染BMSCs和Bio-gide胶原膜复合物组。关节镜监视并对坏死骨清除后植入骨髓间充质干细胞及复合物,术后2周、4周和8周分别处死各组兔（12只）,并对股骨头行X线分析,切片血管计数并行免疫组化检查,生物力学分析,并进行统计学分析,观察疗效。结果:采用密度梯度离心方法结合贴壁筛选法能获得高纯度高活性的骨髓基质干细胞,在MTT法检测时发现第3代细胞增殖速度较第1、2、4、5代稍快,对数期持续时间也相对较长,免疫荧光检测发现高表达CD44,CD90阳性,CD34阴性,说明所获得细胞不是成纤维细胞,造血细胞及内皮细胞;骨髓基质干细胞在一定的条件下可以向成骨细胞及软骨细胞转化,进行细胞内碱性磷酸酶含量测定、钙结节染色、碱性磷酸酶染色、I型胶原免疫组化染色显示具有成骨细胞生物特性;甲苯胺蓝染色发现见各代软骨细胞均着色,传代后染色逐渐变浅;II型胶原免疫组化染色见5代以内软骨细胞内棕黄色颗粒沉淀。腺相关病毒转染的兔骨髓间充质干细胞测得转染率为70% ,rAAV-2-hVEGF-165转染的兔骨髓间充质干细胞可有效表达hVEGF-165,RT-PCR和Western bloting检测可见转染MSCs中外源hVEGF基因的转录与表达。转染后48h即可有表达,10d时表达最强。BMSCs可在Bio-gide胶原膜上贴附增殖,并复层生长,BMSCs并可与Bio-gide胶原膜长为一体。X线示植入后2周A组周边可见骨小梁出血伴轻度坏死塌陷,B组周边骨小梁轻度坏死塌陷,C组骨小梁轮廓不整,骨小梁轻度塌陷,少量成纤维细胞与破骨细胞反应;植入后4周A组骨小梁坏死塌陷,B组软骨下成纤维细胞与破骨细胞反应,可见新生骨小梁,C组骨小梁周边有较多毛细血管及新骨形成,填充区周围有肉芽组织生成;植入后8周B组周边骨小梁可见见新生毛细血管及新生骨,新生毛细血管不丰富,C组骨小梁周边有明显成骨反应,表面有较多成骨细胞及血管内皮细胞,新生骨小梁毛细血管丰富。免疫组化检测发现C组植入后2周弱阳性表达,4周时可见软骨下成骨,软骨细胞膜阳性表达,8周时可见大量阳性表达。生物力学分析实验组明显强于对照组。D组成骨反应与C组相似,但未见明显软骨修复。对各组股骨头抗压强度进行统计学分析,结果表明空白对照组软骨下骨力学性能下降明显,仅为正常骨的1/3左右,容易塌陷,这可能与坏死区涉及到软骨下骨有关。A组股骨头在8周时均已塌陷。2周、4周、8周各组股骨头抗压强度的差异均具有统计学意义,其中E组为正常股骨头组,D组抗压强度较高。植入BMSCs组（B组）显着强于对照组（A组）（P<0.05）;基因治疗组（C,D组）可在短时间促进植入部位和周围的新骨形成,显着强于对照组（A组）及单纯植入BMSCs组（B组）（P<0.05）; C组和D组间无统计学差异;8周时,D组较接近于正常股骨头组（E组）。结论:BMSCs可作为股骨头坏死软骨缺损修复组织工程种子细胞来源。在体外一定的条件下骨髓基质干细胞具有向软骨细胞转化的潜能。hVEGF-165基因转染的兔骨髓间充质干细胞可有效表达具有生物活性的hVEGF-165蛋白,为以hVEGF-165基因和骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗在股骨头缺血性坏死修复与再造的应用中提供了实验基础。将BMSCs与Bio-gide胶原膜体外复合培养,行形态学可见BMSCs在胶原膜表面复层生长,密度较高,并融为一体,生长状态良好明显基质分泌。显示Bio-gide胶原膜可作为细胞生长载体为BMSCs的支架材料应用于软骨组织工程研究。通过关节镜监视可以彻底清除死骨,使hVEGF-165基因修饰的骨髓间充质干细胞准确的回植入股骨头坏死处,可使股骨头缺血性坏死的修复加强,对股骨头缺血性坏死的治疗意义较大。回植入兔股骨头的hVEGF-165基因可有效表达。hVEGF-165基因治疗兔股骨头缺血性坏死后基因治疗组股骨头抗压强度明显强于单纯BMSCs治疗组以及空白对照组,并且接近正常对照组股骨头抗压强度。

王亚寒^[10]（2012）在《hCGRP α基因修饰BMSCs联合自体骨移植治疗股骨头坏死的实验研究》文中研究指明目的（1）构建人降钙素基因相关肽α（hCGRPα）重组逆转录病毒载体（pLNCX2-hCGRPα）,制备重组逆转录病毒液,进行病毒滴度测定。（2） hCGRPα基因修饰兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）,观察对BMSCs生物活性和成骨活性的影响。（3）液氮冷冻法制作家兔股骨头坏死模型,观察转基因BMSCs联合白体骨移植治疗股骨头坏死的效果。方法1.制备重组逆转录病毒（1）人工合成hCGRPα基因：根据GenBank中hCGRPα的cDNA编码序列,在5’端与3’端分别加上HindⅢ和EcoRⅤ内切酶位点,人工合成得到hCGRPαDNA片段。（2）构建病毒载体：用HindⅢ和EcoRⅤ同时双酶切pLNCX2和人工合成的hCGRPαDNA片段,纯化后用T4连接酶将hCGRPα重组入pLNCX2中,经测序分析得到重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα。（3）病毒包装：将重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα转染入PT67细胞进行包装,收集病毒液,离心、过滤,进行病毒滴度测定。2.细胞学实验（1）分离、培养家兔BMSCS:选用4～6周龄家兔,于无菌条件下获得兔自体骨髓,使用Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心法进行细胞的分离、培养,得到自体原代骨髓干细胞。（2）重组逆转录病毒感染体外BMSCs:于感染前12-18h,取第2代BMSCs以1.5×105/的孔密度接种于6孔细胞培养板中。将细胞随机分为3组：①正常对照组：BMSCs正常培养,不给予特殊处理。②实验组：经pLNCX2-hCGRPα感染的BMSCs组。③空载体组：pLNCX2感染组。（3）将细胞培养至第三代,RT-PCR检测细胞hCGRPα-mRNA的表达；Western-blot检测细胞hCGRPα蛋白的表达。（4）MTT法检测细胞增殖活性；碱性磷酸酶（ALP）活性测定；胶原（Collagen）含量测定；骨钙素（13GP）含量测定；层粘连蛋白（LN）测定。3.动物实验：（1）分组实验：取健康新西兰种家兔74只,2～3月龄,体重2.7±0.5kg/只,雌雄不拘。应用液氮冷冻法随机制作家兔单侧股骨头坏死。造模8周后,随机选取2只处死,行组织形态学检查。其余72只随机分为3组,每组实验动物24只。①A组：转基因BMSCs联合自体支撑骨移植。手术暴露股骨头,于股骨转子部凿取一皮质骨小骨柱,长约4mm、宽约2mm。另向深部挖取数团松质骨小颗粒,术中备用。在颈后部股骨头软骨缘下方开一小骨窗,挖除股骨头内部坏死骨。将术前备用的兔转基因BMSCs（含有pLNCX2-hCGRPα质粒）与松质骨小颗粒混合,植于股骨头软骨下方及头内四周。随后于股骨头内中央位置支撑植入皮质骨骨柱,上端与软骨内面顶紧,远端卡牢。②B组：正常BMSCs联合自体支撑骨移植。手术方式同A组,植入干细胞为正常BMSCs（不含pLNCX2-hCGRPα质粒）。③C组：单纯自体支撑骨移植。手术方式同A组,植入骨不与干细胞混合。（2）观察治疗效果：于植骨手术后第3、6月末处死动物,生物力学与组织形态学HE染色观察治疗效果。结果（1）重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα菌液的测序结果与GenBank公布的DNA序列一致。重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα经过包装细胞PT67的包装,其产生的病毒上清液感染NIH3T3细胞,获得稳定表达后,计算病毒滴度为1.7x106pfu/mL,具有较高的感染效率。（2）将hCGRPα基因转染BMSCs, RT-PCR检测转基因BMSCs可表达hCGRPα基因；Western blotting分析可表达hCGRPα蛋白。（3）表达hCGRPα基因的BMSCs （BMSCs/pLNCX2-hCGRPα细胞）与正常培养的BMSCs和只转染空载体的干细胞（BMSCs/pLNCX2细胞）相比,表现出较高的增殖率（P<0.05）。BMSCs/pLNCX2-hCGRPα细胞与BMSCs/pLNCX2细胞和正常BMSCs相比,其ALP、Collagen、LN、BGP的含量明显高于两对照组细胞,具有显着性差异（P<0.05）。而BMSCs和BMSCs/pLNCX2细胞相比,其ALP、Collage、LN、BGP的含量无显着性差异（P>0.05）。（4）于液氮冷冻法造模8周,组织学观测见动物模型侧股骨头组织内出现大量空骨陷窝,并且骨小梁变细、组织稀疏,排列紊乱。部分骨小梁断裂,骨髓腔内造血组织减少,骨细胞出现变性死亡,为典型的股骨头坏死表现。治疗术后3月：A组中新生骨小梁排列基本规则,骨小梁为成熟的骨小梁,并有大量的骨细胞形成；B组标本中骨小梁排列不规则,观察到骨小梁大部分为幼稚的骨小梁,可见骨细胞生成；C组标本骨小梁变细、稀疏、部分断裂,骨髓腔内充满坏死组织碎片,骨细胞变性死亡,造血组织坏死,大量空骨陷窝出现。移植骨治疗术后3个月,测得A组手术侧股骨头软骨下骨、松质骨的平均弹性模量和最大压缩强度均高于B组、C组（p<0.05）,而与正常侧相比差异无统计学意义（p>0.05）。移植骨治疗术后6个月A组手术侧股骨头软骨下骨、松质骨的平均弹性模量和最大压缩强度与正常侧相比差异无统计学意义（p>0.05）,而C组手术侧股骨头已塌陷。结论（1）利用基因工程技术可成功构建重组逆转录病毒载体pLNCX2-hCGRPα,经包装后的病毒液具有较高的感染效率。（2）应用逆转录病毒介导的方法可将hCGRPα基因转染至兔BMSCs中,转基因BMSCs可表达hCGRPα基因并检测到hCGRPα蛋白的合成。（3） hCGRPα基因可促进BMSCs的增殖,且可提高BMSCs成骨活性。（4）经hCGRPα基因修饰的BMSCs联合自体骨移植可在动物体内提高成骨诱导活性,促进骨组织的修复,提高治疗ONFH的成功率。

二、转染逆转录病毒的VEGF在兔骨髓基质干细胞内的表达（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、转染逆转录病毒的VEGF在兔骨髓基质干细胞内的表达（论文提纲范文）

（1）TGR5对成骨细胞分化的影响及相关机制研究（论文提纲范文）

（2）rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究（论文提纲范文）

（3）Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究（论文提纲范文）

（4）脂质体介导双基因转染兔骨髓基质干细胞的体外成骨能力研究（论文提纲范文）

（5）Dlx2过表达对小鼠间充质细胞骨向分化及软骨向分化的作用及机制研究（论文提纲范文）

（6）SHP-2基因转染骨髓间充质干细胞修复大鼠骨缺损的实验研究（论文提纲范文）

（7）强化表达VEGF的老年人骨髓基质细胞治疗脑缺血的实验研究（论文提纲范文）

（8）PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究（论文提纲范文）

（9）骨髓基质干细胞治疗兔股骨头坏死的研究（论文提纲范文）

（10）hCGRP α基因修饰BMSCs联合自体骨移植治疗股骨头坏死的实验研究（论文提纲范文）

四、转染逆转录病毒的VEGF在兔骨髓基质干细胞内的表达（论文参考文献）

• [1]TGR5对成骨细胞分化的影响及相关机制研究[D]. 王庆锋. 苏州大学, 2020(06)
• [2]rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究[D]. 买买艾力·玉山. 新疆医科大学, 2020(07)
• [3]Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究[D]. 潘政军. 安徽医科大学, 2019(07)
• [4]脂质体介导双基因转染兔骨髓基质干细胞的体外成骨能力研究[D]. 肖樵苏. 西南医科大学, 2017(01)
• [5]Dlx2过表达对小鼠间充质细胞骨向分化及软骨向分化的作用及机制研究[D]. 张剑飞. 上海交通大学, 2016(06)
• [6]SHP-2基因转染骨髓间充质干细胞修复大鼠骨缺损的实验研究[D]. 范大鹏. 上海交通大学, 2016(03)
• [7]强化表达VEGF的老年人骨髓基质细胞治疗脑缺血的实验研究[D]. 汤浩. 南方医科大学, 2013(03)
• [8]PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究[D]. 周诺. 广西医科大学, 2012(08)
• [9]骨髓基质干细胞治疗兔股骨头坏死的研究[D]. 刘保一. 南方医科大学, 2012(01)
• [10]hCGRP α基因修饰BMSCs联合自体骨移植治疗股骨头坏死的实验研究[D]. 王亚寒. 郑州大学, 2012(08)

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