一、增生病毒肿瘤靶向性及其分子机制的研究进展（论文文献综述）
郑宇斐[1]（2020）在《中国蜂胶及其黄酮类单体抗黑素瘤作用及其机制》文中研究表明黑素瘤是一种发展极为迅速的恶性皮肤病,具有发展迅速、恶性程度高、预后差、致死率高等特点。早期黑素瘤患者的5年存活率高达92%,但是黑素瘤一旦开始转移,患者的5年存活率迅速下降至15%。目前虽然关于黑素瘤研究已经有了一定的进展,然而针对黑素瘤的主要治疗方法效果并不显着,并且受到严重的副作用和黑素瘤耐药性的困扰。因此,对黑素瘤相关治疗药物和手段的研究仍是目前癌症研究的一个重点和热点。蜂胶是蜜蜂采集植物芽孢及伤口胶质物混合自身上颚腺分泌物而成的一种蜂产品,具有多种生物学活性,包括抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。在抗肿瘤方面,有文献指出中国蜂胶可以有效地诱导包括乳腺癌、结肠癌在内的多种肿瘤发生细胞凋亡和周期阻滞,也是近几年蜂胶药理学研究的热点之一。基于蜂胶的前期抗肿瘤研究,本研究利用细胞模型和小鼠模型,系统性地探究了中国蜂胶及其黄酮类单体（松属素和柯因）对黑素瘤增殖、转移、自噬等方面的影响及其相关机制,以期揭示中国蜂胶的抗黑素瘤作用,为蜂胶的应用提供理论基础,也为黑素瘤的治疗提供新的思路。主要研究结果如下:1中国蜂胶对黑素瘤的发展影响研究我们首次证明了中国蜂胶对黑素瘤细胞系A375的促凋亡作用和抑制转移作用并揭示其分子机制。在经中国蜂胶处理后,A375细胞发生内源性凋亡和细胞周期阻滞。在此基础上,我们发现中国蜂胶在黑素瘤细胞中也能发挥其出色的抗炎作用,caspase-1和caspase-4表达水平降低,同时伴随着IL-1α、IL-1β和IL-18 mRNA水平的下降,进一步证明了中国蜂胶对黑素瘤炎性微环境的保持有抑制作用。我们还发现中国蜂胶可以在A375细胞中激活自噬,而抑制自噬会减弱中国蜂胶对黑素瘤的促凋亡作用,这也说明了自噬的发生增强了中国蜂胶对黑素瘤的细胞毒作用。此外,我们的实验结果证明中国蜂胶能减弱黑素瘤在体外的迁移能力。2中国蜂胶抗黑素瘤单体活性成分筛选利用高效液相色谱,我们确定了本实验中使用的中国蜂胶的主要功能性成分,包括咖啡酸、p—香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸、肉桂酸、山奈酚、杨梅桐、槲皮素、3,4-二甲氧基肉桂酸、芹菜素、短叶松素、柯因、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯和3-O-乙酰基短叶松素等。利用CCK-8实验,我们比较这其中高含量的功能性单体对黑素瘤细胞的细胞毒性,结果显示松属素、咖啡酸苯乙酯、柯因、短叶松素、芹菜素、咖啡酸二甲醚对黑素瘤的细胞活性都有一定的抑制作用。3中国蜂胶活性成分松属素抗黑素瘤作用研究利用体内外模型进一步检测并探究了松属素对黑素瘤的抗肿瘤作用及其相关机制。在细胞实验中,我们发现松属素能诱导黑素瘤细胞（B16F10和A375）发生凋亡,并呈现浓度相关性。对凋亡调控通路的研究显示,松属素通过激活IRE1α/Xbp1通路引发内质网应激,从而活化下游蛋白caspase-12（鼠源细胞）/caspase-4（人源细胞）介导黑素瘤细胞凋亡。此外,我们的结果还显示松属素通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制黑素瘤细胞中自噬的发生,增强了松属素对黑素瘤的促凋亡作用。在小鼠成瘤模型中,松属素显着抑制了黑素瘤在小鼠体内的生长,并且在肿瘤组织中我们检测到了高水平的凋亡信号。4中国蜂胶活性成分柯因抑制黑素瘤转移效果研究我们证明了柯因可以有效抑制黑素瘤转移。通过细胞实验我们发现,在低浓度时,柯因也表现出了对黑素瘤细胞转移、侵袭和促血管生成能力很好的抑制作用。同时,柯因抑制了黑素瘤细胞的失巢凋亡抵抗,增加了其在转移过程中的凋亡率。进一步实验表明柯因通过下调FOXM1/β-catenin通路逆转了黑素瘤细胞上皮细胞间充质转化过程,而过表达FOXM1则会减弱柯因的抗黑素瘤转移作用。我们同时也在小鼠模型上验证了细胞实验的发现。利用肺转移模型,我们证明柯因处理能明显降低小鼠肺转移肿瘤的出现几率,同时在肺部肿瘤组织中,柯因治疗组FOXM1的表达量也更低。综上所述,本论文系统地研究了中国蜂胶的抗黑素瘤作用及其相关机制,有助于中国蜂胶的进一步开发与利用;通过研究中国蜂胶中主要功能活性单体的抗黑素瘤作用及其相关机制,揭示了中国蜂胶抗黑素瘤的物质成分基础,也为黑素瘤治疗药物开发提供了参考。
申燕婷[2]（2020）在《表面增强拉曼光谱技术在细胞器靶向检测与治疗中的应用》文中研究表明细胞是组成生命体结构和功能的基本单元,是除病毒之外所有生物的基本组成。在真核细胞中,亚细胞结构如细胞质、细胞膜、细胞核、线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体等都是必不可少的功能单元。在调节细胞分化、生长、凋亡和细胞内运输中扮演着重要角色。正是由于细胞器在细胞生命活动中具有重要作用,其结构和功能的紊乱将导致各种疾病,如癌症、溶酶体贮积病及各种神经退行性疾病等。因此,对细胞器结构、功能以及微环境进行检测对深入理解其在生命活动中的作用以及对疾病的诊断与治疗十分重要。表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS）是一种可获得物质的分子结构信息并且具有超高检测灵敏度的光谱技术。由于SERS技术具有谱峰窄、光稳定性好、可实现多组分检测、对生物体系损伤较小等优势,已被广泛应用于生物体系的检测与治疗研究中。虽然SERS检测技术已初步用于细胞器相关检测与治疗研究中,但还面临着一些问题。例如,由于缺少有效的细胞器检测手段,研究对象比较局限,大部分是以细胞核研究为主,而且检测准确性有待验证。并且,对细胞器微环境的研究比较匮乏,有待进一步发展。除此之外,以细胞器为靶点,设计制备细胞器靶向探针用以高效地、选择性地杀伤癌细胞已逐渐成为癌症治疗的有效策略。然而,虽然各种治疗方法层出不穷,但其治疗机制尚未明确。因此,急需发展一种可实时追踪细胞器结构和微环境信息及其动态变化的方法去帮助我们更深入地理解细胞器结构和功能以及细胞器靶向治疗机制,并为发展和制备更有效的诊疗平台提供帮助。针对SERS技术在细胞器研究中存在的问题,本论文基于SERS标记和免标记方法,发展了一系列细胞器靶向探针,用于细胞器结构、微环境和治疗机制研究。主要研究内容如下:（1）设计制备了细胞核、线粒体和溶酶体靶向的pH SERS纳米传感器。该纳米传感器由金纳米棒（AuNRs）增强基底、对pH敏感的4-巯基吡啶（MPy）报告分子和细胞器靶向肽构成。通过监测在不同pH下MPy的SERS光谱变化来确定特定细胞器的pH值。并实现了对正常细胞和癌细胞中不同细胞器的pH检测。检测结果显示,HepG2细胞的线粒体、细胞核和溶酶体的平均pH值分别为7.9±0.2、7.5±0.1和4.7±0.3,而BNL.CL2细胞分别为8.2±0.3、7.8±0.2和6.5±0.2。表明细胞的细胞核pH近中性,线粒体为弱碱性,而溶酶体为弱酸性,且癌细胞的细胞器pH值都略低于正常细胞。（2）设计制备了一系列细胞器靶向SERS探针（包括细胞核、线粒体和溶酶体探针）用于深入研究细胞核、线粒体和溶酶体的结构和功能,并对基于不同细胞器靶向探针的光热治疗（Photothermal therapy,PTT）效果进行评估。这些细胞器靶向探针主要由AuNRs和细胞器靶向肽构成,探针不仅具有强的SERS增强作用,还有很高的光热转换效率,可同时用于细胞器分子靶向检测与光热治疗。基于此方法,我们获得了细胞核、线粒体和溶酶体三种细胞器的SERS光谱,并对三种细胞器的主要组成成分进行分析,表明细胞器主要由蛋白质、脂质和碳水化合物组成,而且细胞核具有很多遗传物质信息包括DNA碱基及磷酸骨架等。另外,我们还对三种细胞器之间的分子信息进行比较,加深了对各个细胞器的结构和功能的认识。除此之外,对基于这三种细胞器靶向探针的光热治疗效果进行评估,表明细胞核和线粒体靶向探针具有更好的PTT效果,为进一步研究细胞器靶向治疗机制奠定了基础。（3）设计并制备得到了用于细胞线粒体内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）检测的无干扰SERS活性纳米传感器以实现对光热治疗过程中线粒体ROS的检测。该纳米传感器主要是由无干扰SERS探针分子巯基苯腈（MBN）和金核银壳（Au@Ag）核壳结构组成,通过线粒体靶向肽（MLS）实现线粒体靶向。传感机制主要是基于ROS对Ag壳刻蚀,引起MBN的SERS信号降低,进而实现ROS检测。本项研究中使用的报告分子在细胞拉曼静默区(1800-2800 cm-1)有强的拉曼信号,这极大地避免了细胞内生物大分子的干扰,提高了检测的准确性。基于此方法,我们实现了对细胞线粒体内ROS的检测,并对光热治疗时线粒体中ROS的变化进行了监测。结果表明,随着光照时间的增加,细胞线粒体内的ROS明显增加,且到8 min时达到稳态,很好地揭示了ROS的产生也是PTT引起细胞凋亡的原因之一。（4）基于SERS光谱技术能够在细胞体系中实现生物大分子在细胞生命活动中动态监测的优势,我们以金球（AuNPs）为SERS基底研究了基于线粒体靶向的超碳点（Supra carbon dots,SCDs）探针的PTT机制。首先我们制备了一种在近红外有强吸收的SCDs,并将癌细胞膜穿透肽和线粒体靶向肽修饰在SCDs表面,用于癌细胞的选择性光热治疗。该碳点能够很好地到达癌细胞的线粒体,并在里面聚集,在808 nm激光照射下能有效引起癌细胞死亡而不损伤正常细胞,二者之间的死亡差异高达70%,表明线粒体靶向的SCDs对癌细胞具有高特异性和高选择性。此外,我们还发现该过程中线粒体膜电位降低、功能破坏。进一步通过SERS技术探究该过程中细胞分子的动态变化。结果表明,PTT会引起脂质、蛋白质和DNA的结构变化破坏,进而诱导细胞死亡。该项工作实现了对细胞器靶向光热治疗机制的深入理解。
祁永浩[3]（2018）在《TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤新靶点的分子机制研究》文中研究指明肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）具有独特的生物学功能和结构特异性。它还在人体免疫系统,肿瘤发生和细胞转移中发挥重要作用。TRAF6不仅调节TNFR超家族的细胞内信号转导,而且介导IL-1/TLR超家族信号转导。TRAF6的RING结构域具有E3连接酶活性,能够导致AKT和TAK1两者的活化并促进细胞存活,同时TRAF6的ZINC结构为RING结构域的活性提供了重要的结构支持。另一方面,TRAF6的C末端结构域已被证明主要参与免疫信号转导,并且在调节先天免疫,适应性免疫,应激反应和炎症反应方面至关重要。因此,筛选可与TRAF6特异性相互作用的小分子化合物有助于发现不影响TRAF6的免疫功能的新型抗癌靶标。在这项研究中,选择TRAF6的RING结构域作为开发新的化学治疗剂的作用靶点并且通过体内和体外实验探究其抗肿瘤活性。通过计算机辅助的虚拟筛选,我们发现了天然存在的金鸡纳生物碱可以与Ubc13竞争性结合TRAF6的RING结构域。MTT实验检测发现这些天然产物能够抑制肿瘤细胞的增殖,并且流式细胞术进一步证明它们可以诱导肿瘤细胞的早期凋亡。Western blot和免疫沉淀实验检测TRAF6介导的信号通路,验证这些化合物能抑制AKT和TAK1的激活,进而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达同时促进促凋亡蛋白Bax的表达。此外,动物实验表明,在体内化合物刺激的小鼠的肿瘤增殖率显着低于未刺激组。TUNEL染色结果显示,化合物刺激组的TUNEL阳性细胞多于未刺激组。同时,通过T淋巴细胞亚群和细胞因子的检测分析,我们发现金鸡纳碱化合物可以促进TNF-α,IFN-γ和IgG的分泌,并且不会对CD4+T/CD8+T的比值产生明显的影响,从而说明了金鸡纳碱化合物在诱导肿瘤细胞凋亡的同时不影响TRAF6的C末端结构域,反而增强抗肿瘤免疫性。最后,我们选择金鸡纳碱代表化合物辛可宁,设计合成了一种荧光标记的辛可宁和阻滞活性羟基的辛可宁衍生物。此外,我们还构建了低表达TRAF6的细胞系。免疫荧光实验显示荧光标记的辛可宁可以与细胞中的TRAF6结合,从而验证辛可宁自身与TRAF6的结合。MTT实验结果表明,阻滞羟基活性的辛可宁对细胞增殖的影响明显低于正常辛可宁。最后,低表达TRAF6水平的细胞对这些生物碱的敏感性明显低于正常细胞。这些研究共同表明,天然存在的金鸡纳生物碱可以阻断TRAF6与Ubc13的结合来抑制肿瘤细胞的生长并且对与TRAF6的C端结构域的活性有关的免疫应答具有最小的影响。研究阐明了TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤靶点的可能性,为抗癌新药研发提供坚实的理论基础,为肿瘤的靶向治疗开辟新途径。
牛松涛[4]（2017）在《Lumican在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学作用及机制研究》文中进行了进一步梳理结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤（Extranodal NK/T-cell lymphoma,nasal type）属于非霍奇金淋巴瘤（NHL）的一种少见类型,约占NHL的2%-10%,其在西方人群中非常罕见,但在亚洲、墨西哥和南美洲人群中较为普遍。NK/T细胞淋巴瘤是一个独特的临床病理实体,其发病率居T细胞淋巴瘤的首位,具有侵袭性强、预后不佳的特点,其具体病因和最佳治疗方案到目前为止还尚未搞清楚。所以,进一步研究NK/T细胞淋巴瘤的病因和分子机制有助于评估NKTCL的早期诊断、治疗和预后,也为探索新的治疗靶点提供重要的理论依据。Lumican（LUM）位于人类染色体12q21.3-q22上,其产物基膜聚糖是一种富含亮氨酸的伴有硫酸角质素侧链的原型蛋白多糖,是角质层、皮肤和肌肉结缔组织的主要组成部分。LUM在皮肤、血管、肺、乳腺、胰腺、结直肠、关节软骨等组织中广泛表达。LUM是细胞外基质中的重要组成成分,LUM突变或表达异常或者与整合素相互作用均可以间接地影响肿瘤的转移侵袭,也可以通过参与上皮细胞管样结构的形成调节肿瘤血管的形成,从而影响肿瘤的增殖。有很多研究已证实LUM在消化道肿瘤、呼吸道肿瘤以及泌尿生殖道肿瘤等多种恶性肿瘤中表达异常,其发生突变或者表达异常对肿瘤的发生、发展和转移均可造成一定的影响。LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的研究还未见有报道,LUM对NK/T细胞淋巴瘤的发生、发展等生物学作用以及分子机制都有待深入研究。本研究首先通过免疫组化法检测了LUM在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤以及反应性增生淋巴结中的表达情况,并分析了LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的阳性表达与临床病理参数、临床疗效的关系;体外研究,我们利用慢病毒载体构建了LUM过表达载体,经病毒包装并感染NK/T细胞淋巴瘤YTS细胞,得到了稳定过表达YTS-LUM细胞系,并通过细胞生物学和分子生物学方法检测了LUM过表达对NK/T细胞淋巴瘤细胞YTS细胞克隆形成、凋亡、细胞周期、侵袭以及化疗药物敏感性等生物学特性的影响,同时利用Western blot检测了LUM过表达对增殖和凋亡相关蛋白以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响。最后拟体内研究,我们通过构建肿瘤动物模型,进一步研究了LUM过表达对动物体内NK/T细胞淋巴瘤生长的影响。本研究旨在探索LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学功能和分子机制,为NK/T细胞淋巴瘤的临床治疗提供了重要的候选分子标记和靶基因。实验目的:1.检测LUM在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤以及反应性增生淋巴结组织表达情况,分析其与临床病理参数、疗效之间的关系。2.研究LUM对于NK/T细胞淋巴瘤细胞克隆形成、凋亡、细胞周期、化疗药物敏感性等相关作用,以及对增殖和凋亡相关蛋白以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路的影响。3.进一步研究LUM对小鼠移植瘤生长、增殖和凋亡相关蛋白表达以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路的影响。主要内容:第一部分:LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的表达研究方法1.利用免疫组化方法检测LUM、PCNA在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤及反应性增生淋巴结中的表达差异。2.分析在NK/T细胞淋巴瘤中LUM阳性表达率与临床病理参数的关系。3.分析在NK/T细胞淋巴瘤中LUM阳性表达率与治疗疗效之间的关系。结果1.免疫组化结果显示LUM在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤组织中阳性表达率（25%）显着低于反应性增生淋巴结（79.2%）,P<0.001。2.NK/T细胞淋巴瘤中LUM阳性表达率与患者年龄、性别、发生部位、临床分期、乳酸脱氢酶（LDH）水平均无明显关系（P>0.05）。LUM在PCNA弱表达的患者肿瘤组织中的阳性表达率明显高于PCNA强表达的患者肿瘤组织,即LUM可能与PCNA指数有密切的关系,P<0.05。3.NK/T细胞淋巴瘤中LUM的表达阳性率在有效组（CR+PR）（48.1%）明显高于无效组（SD+PD）（15.6%）,P<0.05。第二部分:LUM对YTS细胞生物功能的影响及其分子机制研究方法1.将LUM基因与慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro结合,构建慢病毒过表达载体plenti-LUM,并送公司测序。然后将病毒包装之后感染YTS淋巴瘤细胞,之后进行嘌呤霉素筛选稳定过表达LUM的LUM-YTS细胞。2.用Western blot检测LUM、增殖和凋亡以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白的表达量。3.细胞克隆形成实验检测LUM过表达对YTS淋巴瘤细胞克隆形成能力的影响。4.利用CCK-8实验检测LUM过表达对YTS细胞增殖能力的影响5.流式细胞仪检测LUM过表达对YTS细胞周期、细胞凋亡的影响。6.利用Transwell方法检测LUM过表达对YTS细胞侵袭能力的影响。7.CCK-8实验检测LUM过表达对YTS细胞阿霉素敏感性的影响。结果1.pLenti-LUM慢病毒过表达载体菌落PCR和基因测序结果显示,其分子大小及序列与NCBI中的参考序列一致。表明LUM过表达慢病毒载体质粒pLenti-LUM构建成功。2.细胞克隆形成实验和CCK-8实验检测发现LUM过表达显着抑制YTS淋巴瘤细胞克隆形成和增殖能力。3.流式细胞仪检测发现LUM过表达可以明显促进YTS淋巴瘤细胞的凋亡,使细胞G1期阻滞。4.Transwell检测发现LUM过表达可以明显抑制YTS淋巴瘤细胞的侵袭。5.Western blot检测发现LUM过表达能促进促凋亡相关蛋白p53,Bax,caspase-3的表达,抑制抑凋亡因子Bcl-2和增殖相关蛋白CCND1、myc的表达。LUM过表达明显抑制淋巴瘤细胞中NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白NF-κB p65、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3的表达。6.LUM过表达能够明显增强YTS细胞对化疗药物ADM的敏感性。第三部分:LUM过表达对动物体内NK/T细胞淋巴瘤生长的影响研究方法1.在BABL/nude雌性小鼠（裸鼠）右前肢皮下接种外源肿瘤细胞YTS、YTS-Con和YTS-LUM,构建淋巴瘤动物模型。接种后开始每隔三天测量小鼠移植瘤体积,32天后将移植瘤剥出称重。2.利用Western blot法检测各组小鼠移植瘤中LUM表达情况。3.用Western blot检测各组肿瘤组织中增殖和凋亡相关蛋白、NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白的表达。结果1.对各组YTS荷瘤小鼠的肿瘤重量和体积检测发现,LUM过表达显着抑制肿瘤的生长。2.利用Western blot检测发现,与对照组相比,YTS-LUM组肿瘤组织中LUM蛋白表达显着增加。3.Western blot检测发现,与对照组相比,YTS-LUM组小鼠肿瘤组织中,促凋亡相关蛋白p53,Bax,caspase-3的表达量明显上升,而抑凋亡因子Bcl-2和增殖相关蛋白CCND1、myc的表达量却明显下降。4.与对照组相比,YTS-LUM组移植瘤组织中NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白NF-κB p65、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达量明显降低。结论1.LUM在NK/T细胞淋巴瘤中表达量明显降低,且其表达与患者年龄、性别、发生部位、临床分期、乳酸脱氢酶（LDH）水平均无明显关系,与治疗疗效和PCNA指数有密切关系。2.细胞实验表明,LUM过表达可能通过调控NF-κB和JAK/STAT3信号通路,从而抑制淋巴瘤细胞增殖、克隆形成、侵袭,阻滞细胞G1期、促进细胞凋亡、增强细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。3.动物体内实验进一步表明,LUM过表达可能通过调控NF-κB和JAK/STAT3信号通路,从而抑制小鼠移植瘤的生长。
胡琼莹[5]（2004）在《L-脯氨酸—间—双（2-氯乙）胺基-L-苯丙氨酰基-L-正缬氨酸乙酯盐酸盐（MF13）的抗肝癌作用及其分子机制的研究》文中提出L-脯氨酸-间-双（2-氯乙）胺基-L-苯丙氨酰基-L-正缬氨酸乙酯盐酸盐（MF13）是一个新颖的含三个肽的氮芥类化合物，分子量为566。MF13在体外对所测定的7株不同来源的人肝癌细胞系均有较强的抗增殖活性，IC50值在0.32～2.32μM之间，IC90值在3.84～29.20μM之间；以人淋巴细胞和正常肝细胞为正常细胞对照的实验结果表明MF13毒性小，对肝癌细胞有较好的选择性。MF13冲击性给药的实验结果显示IC75浓度的MF13与细胞冲击性接触，接触2小时细胞的存活率＜50％，8小时细胞的存活率与连续接触72小时的细胞存活率无显着性差异，提示MF13起效快，作用持久。 流式细胞仪检测结果显示将Bel-7402或HepG2细胞经MF13处理后主要被阻断在S期，24小时后S期细胞所占的比例超过75％；细胞形态学分析和DNA琼脂糖凝胶电泳结果表明MF13作用后的肝癌细胞出现典型的细胞凋亡特征：在形态学上表现为细胞质浓缩，染色质凝集，细胞核固缩，有的细胞核裂解为核碎片等；在生化学上，Bel-7402细胞被0.88μM或更高浓度的MF13作用72小时，在琼脂糖凝胶电泳图上清楚呈现180-200bp整数倍的梯状条带，梯状条带的出现与MF13呈剂量依赖性。 Western Blot的结果表明，MF13作用于Bel-7402或HepG2细胞6小时后细胞内磷酸化的pRb蛋白表达量增加（pRb蛋白磷酸化是Rb蛋白的失活形式，出现在S期），提示细胞被阻断在S期，这与细胞周期分析结果一致；MF13虽然不改变凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表达量，但能明显上调凋亡促进因子Bax的蛋白表达量，且Bax蛋白表达量的增加与MF13的作用呈时间依赖性和剂量依赖性，Bcl-2／Bax的比率下降，细胞趋向凋亡，MF13同样能使CEM（人急性淋巴白血病细胞）、MCF-7（人乳腺癌细胞）细胞内Bax蛋白的表达量增
李月敏[6]（2004）在《肿瘤特异性增殖腺病毒CNHK 500治疗乳腺癌的实验研究》文中研究说明复制缺陷型腺病毒载体介导的肿瘤基因治疗手段发展迅猛，在进入临床研究的全部基因治疗方案中，有三分之二是针对肿瘤的。复制缺陷型腺病毒作为基因治疗的载体有致病性低、不整合到人类基因组、滴度高、易于纯化和制备等多种优点。然而缺陷型腺病毒作为基因治疗的载体也存在几项缺点，包括免疫原性强、缺乏感染的特异性（靶向性差）、在实体瘤中穿透力差以至难以到达全部肿瘤细胞等，这极大地限制了肿瘤基因治疗的临床效果。为了提高病毒感染的特异性和病毒在肿瘤中的播散能力，以杀灭所有肿瘤细胞，人们利用肿瘤细胞与正常细胞的某些生物学性状的差异，提出了条件选择性增殖病毒（conditionally-replicating vims）治疗肿瘤的新策略，并利用增殖病毒作为载体携带肿瘤治疗基因，使基因治疗的局面面目一新。这种条件选择性增殖性病毒在肿瘤治疗方面具有以下几种优势：1． 病毒可以选择性的在肿瘤细胞内有效复制，可使治疗剂量大大减小。2． 病毒在肿瘤细胞内复制，最终将肿瘤细胞裂解导致细胞死亡。3． 新的子代病毒自细胞中释放后继续感染邻近细胞，并继续复制，最终将肿瘤细胞完全消灭。4． 肿瘤细胞裂解后释放的肿瘤抗原可以增强机体抗肿瘤免疫反应。5． 将可选择复制的病毒作为基因治疗的载体，发展结合病毒治疗与基因治疗两者优势的肿瘤治疗新策略，即基因-病毒治疗。6． 对病毒外壳蛋白进一步改造增强其感染的特异性和感染力。7． 病毒只选择性地在肿瘤细胞中复制，对正常细胞的毒性小。为实现病毒选择性在肿瘤细胞内复制，目前有两种普遍采用的方法：一、将病毒复制必需基因全部缺失或部分缺失，这些基因在正常细胞中为病毒复制所必需的，但在肿瘤细胞中则是不需要的，从而病毒在正常细胞中死亡，而在肿瘤细胞中得以有效复制。例如，ONYX-015就是E1B 55 KDa缺失的腺病毒，它利用了多数肿瘤细胞p53功能不良的特点，可以特异地杀伤p53缺失或突变的肿瘤细胞。E1b 55 KDa蛋白可通过结合细胞内的p53使其功能受到阻滞，由于这一缺失突变，ONYX-015不能阻滞p53的功能，ONYX-015感染正常组织细胞时，可以激活细胞内p53，在p53的诱导调控下细胞凋亡（apoptosis）或细胞生长阻滞（growth arrest），因而在正常组织细胞内病毒复制受到抑制。与此相反，ONYX-015感染突变型p53的军事医学科学院中文摘要论文肿瘤细胞后，由于p53蛋白功能缺失，肿瘤细胞不会发生凋亡或生长阻滞，可以在肿瘤细胞内复制并发挥溶瘤作用。 二、采取肿瘤细胞内或某种组织细胞内特异性激活的启动子或增强子，调控病毒复制必需基因（如EIA）的复制，使病毒选择性地在肿瘤组织或某种组织细胞中复制，而不影响正常组织。现已有为数不少的肿瘤细胞特异启动子被鉴定并用于基因表达的调控，如靶向结直肠癌的癌胚抗原（CEA）启动子、靶向乳腺癌的MUCI启动子、革巴向肝癌的甲胎蛋白（AFP）启动子以及靶向鼻咽癌的EB病毒启动子等。另外，尚有针对某一类组织特征的启动子，如采取前列腺细胞特异性抗原（PSA）启动子来杀伤前列腺细胞，包括一前列腺癌细胞，这种方案可克服肿瘤细胞异质性带来的问题，但这种方案须要求这类组织本身对人体并非是至关重要的。用上述启动子调控病毒基因的表达可获得相对特异的肿瘤靶向作用，但缺点也比较明显。首先，这些启动子只针对有限的组织起源的肿瘤细胞，不能广泛应用于大多数肿瘤的治疗;其次，与常用的病毒启动子相比，这些启动子作用相对较弱，所介导的基因表达量低，病毒复制能力较野生型病毒下降。 近年来人们将目光集中于端粒酶启动子的研究上来，采用hTERT基因启动子驱动抗肿瘤基因，靶向端粒酶阳性的肿瘤细胞，而对端粒酶阴性的正常细胞则不起作用，是一项非常有前途的肿瘤治疗策略。端粒酶被认为是目前发现的最广谱的肿瘤分子标记，与肿瘤无限增殖的特性有关。在乳腺癌中的端粒酶阳性率达85%以上，而在绝大多数的正常细胞中无端粒酶活性。hTERT是调节端粒酶活性的主要亚单位，hTE又T启动子只有在端粒酶阳性的细胞中有转录活性。hTERT启动子已被成功地用于基因治疗中的治疗基因靶向表达，如GuJ等用hTERI，启动子调控Bax基因在肿瘤组织特异性表达;shoji等用hTERT启动子调控caspase一8基因局限性在端粒酶阳性细胞表达，而在端粒酶阴性组织不表达。因此，采取hTERI…基因启动子调控腺病毒EIA的表达，可以使病毒选择性的在端粒酶阳性的肿瘤细胞内复制，而在端粒酶阴性的正常细胞中不复制。 实体肿瘤的另一个重要特性是肿瘤组织内部大量乏氧细胞的存在，肿瘤缺氧的微环境是肿瘤放化疗耐受的重要原因。缺氧诱导基因一1（Hypoxia一Indueible Faetor-l，HIF一l）广泛存在于人类多种肿瘤细胞内，HIF活性对维持肿瘤细胞的能量代谢、促军事医学科学院中文摘要博「论文进新血管的形成、促进肿瘤增殖和转移中起重要作用。研究发现，在乳腺癌等多种癌中HIF一1过度表达，而在乳腺良性病变中则不表达。缺氧的信息在肿瘤细胞内部通过一系列的信号传导系统，导致HIF一1转录因子的表达，最后导致细?
李月敏[7]（2003）在《增生病毒肿瘤靶向性及其分子机制的研究进展》文中研究表明
王鹏[8]（2021）在《薯蓣皂苷介导ATM/p53信号通路调控皮肤癌A431细胞凋亡和迁移作用及机制研究》文中提出目的:研究天然产物薯蓣皂苷抗皮肤癌的药理学作用,并对其可能的分子机制进行探讨。材料和方法:1.在体内动物实验中,4-6周龄的BALB/C裸鼠适应性饲养一周后,将皮肤癌细胞株荧光素酶标记的皮肤癌细胞Luc-A431以5×107个/m L悬浮于0.5 m L高压灭菌处理的PBS缓冲液中,皮下注射到小鼠腋下区域,密切关注成瘤情况,随后将接种裸鼠分为空白对照组、薯蓣皂苷给药高、低剂量（80和20mg/kg）给药组共三组,每组5只,连续灌喂给药26天,计算肿瘤体积。最后一次给药后,进行小动物活体成像实验。实验中将建模成功的空白组及给药组（80mg/kg）裸鼠分别注射配制好的荧光素钾盐溶液。随后立即进行异氟烷吸入麻醉,置于成像仪暗箱平台。软件调节成像背景以及视野,等待5分钟至裸鼠体内荧光强度达到峰值,进行拍照,完成成像操作,最后对成像图片进行发光面积的计算。在病理学组织检测分析中,将肿瘤组织包埋在石蜡中,用切片机将其切成5（？）m切片,随后通过脱蜡,苏木精和伊红染色,封片和镜检等步骤进行染色分析,观察肿瘤组织的损伤情况。在免疫组化分析实验中,使用免疫组化二步法试剂盒进行检测,通过脱蜡和水化,抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,滴加封闭用正常山羊血清工作液,孵育一抗,滴加生物素标记山羊抗兔Ig G聚合物,滴加辣根酶标记工作液并进行DAB显色,复染,脱水封片等步骤,最后进行并进行显微镜拍照,观察组织情况。在组织的的免疫荧光分析实验中,将福尔马林固定的肿瘤组织包埋在石蜡中,切成5（？）m切片。将覆盖有p53抗体的组织切片放置于避光湿盒中4摄氏度下过夜,接着加入带有荧光标记的二抗在37摄氏度孵育1小时。细胞核经DAPI（5.0（？）g/m L）染色。免疫荧光的样品通过免疫荧光显微镜随机选择5处拍照,分析图像结果。最后通过western blot实验考察薯蓣皂苷对下游调控细胞迁移、细胞凋亡和DNA损伤信号通路相关蛋白RHO、cdc42、MMP2、MMP9、Cleaved caspase-3/9、Bax,Bcl-2表达的影响。2.在薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞凋亡作用研究实验中,采用MTT法检测薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞的细胞毒性作用。分别配制不同浓度（0.7、1.4、2.9、5.8和11.6（？）M）薯蓣皂苷处理皮肤癌A431细胞不同时间（12、24和36h）后,加入MTT（10mg/ml）10（？）l,37℃孵育4h后,弃上清并加入150（？）l DMSO溶解甲瓒,然后用酶标仪上测定OD值,记录实验结果。同时采用明场条件下的细胞白照实验观察细胞形态变化。平板克隆实验中将对数生长期的皮肤癌A431细胞按2×105个细胞每孔接种于6孔板中,给药组每3天用浓度分别为2.9、5.8和11.6（？）M的薯蓣皂苷处理,空白组每3天更换新鲜培养基。培养2到3周后弃去上清液,4%多聚甲醛室温固定并用1%结晶紫溶液染色。最后用相机对各组进行拍照记录并计算克隆形成率。TUNEL实验和彗星实验考察薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞凋亡和DNA损伤的影响。TUENL实验皮肤癌A431细胞中给予不同浓度的薯蓣皂苷（1.4、2.9、5.8（？）M）,过夜孵育后加入浓度为1.0（？）g/m L溶于PBS的吖啶橙（AO）和溴化乙锭（EB）各20（？）L,最后用荧光显微镜进行观察,记录染色和分析凋亡情况。彗星实验中收集对数生长的皮肤癌A431细胞,给予不同浓度的薯蓣皂苷（2.9、5.8和11.6（？）M）处理24 h,按照彗星电泳检测试剂盒的步骤进行制片,铺胶、细胞裂解和电泳等步骤后最后进行荧光显微镜观察照相,任意选取视野后用分析软件Comet assay software project（CASP）进行分析。在凋亡分子机制探究实验中,首先通过Western blot检测相关凋亡蛋白的表达,用含1%PMSF的RIPA裂解缓冲液裂解细胞,BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜。PVDF膜经封闭,特异性一抗孵育,TBST洗涤三次,用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育后通过增强型化学发光底物检测试剂盒进行ECL显色。最后考察薯蓣皂苷对下游调控细胞凋亡和DNA损伤信号通路相关蛋白ATM,p53、PARP、Cleaved caspase-3/9、Bax,Bcl-2表达的影响。在免疫荧光实验中,收集对数生长期的A431细胞给予不同浓度的薯蓣皂苷（1.4、2.9、5.8（？）M）处理24h。样本用PBS清洗后加入4%的多聚甲醛于室温中固定,用0.2%的Triton-X100通透液进行处理。之后将细胞用脱脂奶粉进行封闭处理,加入一抗并4℃孵育过夜。次日,用PBS清洗两次后再加入二抗FITC-conjugatedgoat anti-rabbit Ig G（1:100）室温避光孵育1h。最后DAPI（1.0μg/m L）染色15min,PBS清洗后,用荧光显微镜观察照相。在p53si RNA体外转染实验中p53 si RNA和control si RNA分别溶解后与lipofectamin 2000试剂混合形成脂质体抑制剂复合物。转染24 h后检测细胞活力、细胞凋亡程度和DNA损伤程度以及p53、PARP、Cleaved-Caspase3/9、Bax、Bcl-2的蛋白表达水平。3.在薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞迁移和侵袭作用研究实验中,采用划痕实验和Transwell侵袭实验检测薯蓣皂苷对细胞迁移和侵袭能力的影响。细胞划痕实验中用移液枪在长满皮肤癌A431细胞的板底上垂直划过形成一条没有细胞的划痕,之后给予不同浓度的薯蓣皂苷（2.9、5.8和11.6（？）M）处理24 h过夜后,用4%的多聚甲醛固定并在显微镜下观察,通过划痕宽度的改变来判断细胞迁移的能力。Transwell侵袭实验中将胰酶消化后的皮肤癌A431细胞离心弃上清,加入不含胎牛培养液使其重悬,在上室加200（？）L（3×104个/室）细胞悬液,随后给药组给予不同浓度的薯蓣皂苷（2.9、5.8和11.6（？）M）的不加胎牛血清的培养基,小室下面为加500（？）L新鲜培养基,其中包含10%胎牛血清。在37℃、5%CO2条件下24 h过夜后取出小室,PBS清洗后用结晶紫染色30 min,显微镜随机选取视野来进行拍照并且对细胞进行计数。随后通过Western blot检测迁移和侵袭相关蛋白的表达,用含1%PMSF的RIPA裂解缓冲液裂解细胞,BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜。PVDF膜经封闭,特异性一抗孵育,TBST洗涤三次,用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育后通过增强型化学发光底物检测试剂盒进行ECL显色。最后考察薯蓣皂苷对下游调控细胞迁移侵袭信号通路相关蛋白RHO、cdc42、MMP2、MMP9表达的影响。在p53si RNA体外转染实验中p53 si RNA和control si RNA分别溶解后与lipofectamin 2000试剂混合形成脂质体抑制剂复合物。转染24 h后检测细胞迁移侵袭能力以及RHO、cdc42等迁移侵袭蛋白表达水平。结果:1.体内移植瘤实验结果表明薯蓣皂苷能有效抑制裸鼠瘤体积和重量的变化,80mg/kg薯蓣皂苷治疗后接种皮肤癌A431细胞,裸鼠瘤体积和重量分别减少了80.4%和73.3%。免疫荧光结果显示薯蓣皂苷能显着上调靶蛋白p-ATM、p53、PARP和cleaved-caspase-3,Western blot结果显示薯蓣皂苷能显着上调p53、PARP、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9和Bax蛋白表达水平,同时显着下调RHO、cdc42、MMP2、MMP9和Bcl2表达水平。2.MTT实验结果表明,与空白组相比,薯蓣皂苷处理组中薯蓣皂苷显着降低了皮肤癌A431细胞活力;平板克隆实验证明薯蓣皂苷能抑制细胞增殖能力,TUNEL实验的彗星电泳实验表明薯蓣皂苷能诱导皮肤癌A431细胞凋亡及DNA损伤。进一步p53si RNA转染实验结果表明薯蓣皂苷对皮肤癌A431凋亡和DNA损伤的药理作用,可能是通过调控p53介导的迁移侵袭信号通路产生的。3.划痕实验和Transwell实验证明薯蓣皂苷能抑制细胞迁移和侵袭能力,体外分子机制实验结果表明薯蓣皂苷调节皮肤癌A431细胞中Rho、cdc42、MMP2、MMP9等迁移相关蛋白的表达,抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭的发生。进一步p53si RNA转染实验结果表明薯蓣皂苷对皮肤癌A431迁移侵袭药理作用,可能是通过调控p53介导的迁移侵袭信号通路产生的。结论1.薯蓣皂苷能显着抑制皮肤癌A431细胞荷瘤裸鼠肿瘤的生长。薯蓣皂苷通过调控ATM/p53通路,调节皮肤癌A431细胞中p53、caspase等凋亡相关蛋白的表达,诱导肿瘤组织中细胞的凋亡;通过调节Rho、cdc42等迁移相关蛋白的表达,抑制肿瘤组织中细胞迁移和侵袭。2.薯蓣皂苷能显着促进皮肤癌A431细胞的凋亡和DNA损伤产生,且呈剂量依赖性。并且这种作用是通过调控凋亡和DNA损伤相关蛋白ATM、p53、PARP、Cleaved-Caspase3/9、Bax、Bcl-2的表达实现的。3.薯蓣皂苷能显着抑制皮肤癌A431细胞的迁移和侵袭的发生,且呈剂量依赖性。并且这种作用是通过调控迁移和侵袭相关蛋白Rho、cdc42、MMP2、MMP9的表达实现的。综上所述,薯蓣皂苷具有很好的抗皮肤癌作用,这种作用是通过上调p-ATM和p53表达,进而调控细胞凋亡、细胞迁移和DNA损伤蛋白信号通路来实现的。总之,薯蓣皂苷在抗皮肤癌方面具有较大的研究和开发价值。
吴孟闱[9]（2021）在《基于肿瘤转移相关基因的胰腺癌预后模型构建及RNF138对胰腺癌恶性表型的调控及其分子机制研究》文中提出第一部分:基于肿瘤转移相关基因的胰腺癌预后模型的构建研究背景胰腺癌恶性程度高、预后极差,早期便出现局部侵袭及远处转移。胰腺癌细胞高度侵袭和转移的特性是导致胰腺癌不良预后的重要原因之一。然而,介导胰腺癌侵袭和转移的分子机制目前尚未完全阐明。深入探究介导胰腺癌侵袭和转移的关键分子机制,筛选胰腺癌中异常表达的转移相关基因有望解析胰腺癌高度侵袭转移的特性,为胰腺癌分子治疗提供新的靶点。此外,转移相关基因能直接反映胰腺癌易转移的生物学特性,具有预测胰腺癌患者预后的重要潜能。改善胰腺癌患者的预后有赖于个体化的系统性治疗,临床亟需能更为有效而个体化地预测胰腺癌患者预后的评估系统,以辅助临床决策。临床目前常用以评价胰腺癌患者预后的是基于临床病理学参数进行评估的分期系统。然而,传统的分期系统无法跟随患者病情的进展进行动态地评估,也不能基于分子层面反映患者肿瘤的恶性生物学行为。因此,有必要建立能更为精准和个体化评估胰腺癌患者预后的模型。近年来,随着癌症基因组学大数据的不断积累,利用癌症相关基因转录组数据和有效的生物信息学分析方法,建立包含数个特定关键基因的基因模型已被证明是癌症患者诊断、预后和疗效评估的重要评价手段。鉴于转移相关基因与胰腺癌恶性生物学行为和预后的相关性,鉴定胰腺癌中影响预后的转移相关基因,基于此建立预测胰腺癌预后的基因模型可能是开发更为精准的胰腺癌预后评估系统的有效策略。研究目的本部分研究的主要研究目的是应用转录组数据挖掘并结合临床和随访数据筛选胰腺癌中影响预后并呈差异表达的转移相关基因,基于此筛选关键基因,建立基因模型,并进一步整合预后相关的临床病理学参数,建立更优的胰腺癌预后评估系统。研究方法在本部分研究中,为了于胰腺癌基因芯片样本中得到可靠的、具有代表性的表达谱数据,首先,基于GEO数据库,我们下载并整合了四套胰腺癌基因芯片表达谱数据集:GSE15471,GSE16515,GSE32676和GSE22780,并使用R语言对数据进行了一系列处理,鉴定胰腺癌中差异表达的基因。我们进一步从人类癌症转移基因数据库获取转移相关基因列表,分析他们在胰腺癌组织中的表达水平,与差异分析结果取交集,获得胰腺癌中差异表达的转移相关基因（DE-MTGs）,并进行生物信息学分析。我们进一步在TCGA-PAAD数据库的胰腺导管腺癌患者队列中基于生存分析筛选预后相关的DE-MTGs,基于LASSO回归筛选关键基因,建立基因预测模型,计算风险评分。我们使用Xtile软件确定风险评分的最佳介值将胰腺癌患者分为高风险组和低风险组。采用Kaplan-Meier生存分析中的log-rank检验,判断不同风险组间胰腺癌患者的总生存是否存在统计学差异。采用R语言软件包timeROC构建时间依赖的受试者工作特征曲线（ROC）,确定曲线下面积（AUC）,预测胰腺癌患者的1、2、3年的总生存率。并进一步计算一致性指数C-index,评估模型的预测效果。使用Delong等描述的方法判断不同预测模型的AUC间是否存在统计学差异。在外部数据集GSE62452及PACA-AU中进行外部验证,评估该基因预后模型在外部验证数据集中的预后预测效果。我们还使用基因集富集分析（GSEA）进一步挖掘DE-MTGs基因模型与胰腺癌不良预后相关的潜在分子机制。使用ESTIMATE和CIBERSORT生物信息学算法,基于转录组测序数据评估胰腺癌组织中的免疫细胞浸润情况,并使用Pearson相关性检验分析DE-MTGs表达水平与免疫细胞浸润的相关性。研究结果本部分研究在胰腺癌中共鉴定出36个与预后相关的DE-MTGs,并基于此进一步筛选关键基因建立基因模型,以预测胰腺癌预后。该基于DE-MTGs的基因模型包括 RACGAP1、RARRES3、TPX2、MMP28、GPR87、KIF14和TSPAN7,可以准确预测胰腺癌患者的总生存。基于DE-MTGs的基因模型能够鉴别出预后显着较差的高风险胰腺癌患者,其预后预测效能在训练集和外部验证数据集中分别得到了验证。生存分析结果表明,基于DE-MTGs的基因模型是胰腺癌预后的独立危险因素。基因集富集分析结果显示,高风险组胰腺癌的分子改变与多个肿瘤学相关途径有关。此外,肿瘤免疫微环境分析显示,高风险组胰腺癌的卵泡辅助性T细胞和M0巨噬细胞浸润水平显着高于低风险组,而幼稚B细胞,CD8+T细胞,单核细胞和静息树突状细胞的浸润水平显着较低。免疫细胞的浸润水平与多个DE-MTG的表达水平呈显着相关。最后,我们进一步整合了基因模型和预后相关的临床病理学参数以进一步优化预后模型的预测效能,并以列线图的形式可视化地进行展示。验证结果提示,与常规分期相比,该列线图具有更优的预后预测效能。结论本部分研究中,我们所鉴定的DE-MTGs与胰腺癌的进展和预后密切相关,是潜在的治疗靶点。基于DE-MTGs的基因模型和列线图相较传统预后评估系统具有更优的预后预测效能,有益于辅助临床决策。第二部分:RNF138对胰腺癌恶性表型的调控及其分子机制研究研究背景胰腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是一种高度恶性的消化系统肿瘤,预后极差,早期即发生局部侵袭及远端转移。手术切除是目前唯一有望根治胰腺癌的手段,但即使行根治性切除术,80%以上的患者仍易复发。常规应用单药或多药联用化疗方案并未大幅改善胰腺癌患者的预后,晚期胰腺癌患者中位生存时间仍小于1年。目前,免疫治疗是恶性肿瘤治疗领域的研究热点。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）治疗在血液系统肿瘤以及某些类型的实体瘤中可明显改善患者的预后,但其在胰腺癌中的治疗效果尚不令人满意。RFN138 E3泛素化连接酶（Ring finger protein 138,RNF138）在癌与正常组织中呈差异表达,可能通过调控细胞生物学过程促进肿瘤生长、参与肿瘤微环境（tumourmicroenvironment,TME）的调节并抑制抗肿瘤免疫。但RNF138与胰腺癌的发生发展、及与肿瘤微环境调控的关系尚未见报道。本研究初步提示RNF138在胰腺癌中发挥着促癌作用。因此,阐明RNF138在胰腺癌中的促癌作用及其下游分子机制将有望加深对胰腺癌高度侵袭转移的特性与免疫抑制微环境的了解,为胰腺癌的治疗提供潜在的新靶点,有助于胰腺癌免疫治疗效果的提高及预后的改善。研究目的明确RNF138在胰腺癌组织中的表达及其预后价值;探索RNF138对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移、肿瘤微环境中免疫细胞组成等胰腺癌生物特性的调控作用及其发挥作用经由的信号通路。研究方法采用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色的研究方法,在胰腺癌、配对癌旁和正常组织样本中初步明确RNF138的表达情况;分析RNF138表达与胰腺癌临床病理学参数的相关性及其预后价值,对比RNF138高表达或低表达胰腺癌肿瘤免疫细胞的浸润数量与种类;利用western blot和实时定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测RNF138在各胰腺癌细胞系和正常胰腺细胞系中的RNA和蛋白表达谱;采用PANC-1细胞株瞬时敲减RNF138,于体外水平初步明确干扰RNF138表达对细胞增殖能力的影响;应用慢病毒系统转染PANC-1和BXPC-3细胞株,筛选并建立RNF138敲减稳转细胞株（RNF138KD）;利用划痕实验检测明确RNF138对胰腺癌细胞运动能力的影响;利用transwell细胞迁移侵袭实验明确RNF138对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响;利用克隆形成、细胞增殖实验、凋亡检测、和细胞周期实验检测RNF138对胰腺癌细胞增殖能力的影响;利用RNF138KD PANC-1进行裸鼠皮下成瘤模型,进一步验证RNF138敲低对胰腺癌体内的增殖抑制作用,;利用转录组测序联合IPA与GO富集分析检测PANC-1细胞株敲低RNF138后基因表达谱和关键信号通路的变化;利用western blot及qRT-PCR研究其下游IFN信号通路中关键分子的表达与其内源性激活情况,进一步明确RNF138表达变化对于外源性IFN α与IFNγ刺激反应的影响;转染野生型RNF138质粒于RNF138KD PANC-1细胞中,进行重表达和功能挽救实验,探索RNF138是否为STAT1表达与细胞体外增殖能力的关键调控因子;探索RNF138在胰腺癌肿瘤组织中异常高表达的关键上游调控机制,明确C-myc与RNF138转录的正相关作用;通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）研究 RNF138 与 p53 的相互作用关系,以及 RNF138对于微小核数量的影响;构建RNF138各功能结构域的突变型质粒转染于稳定低表达RNF138的PANC-1细胞,明确胰腺癌细胞中的RNF138是否依赖其泛素化功能域发挥功能;最后构建人源化免疫系统小鼠的胰腺癌PDX模型,于此进行si-RNF138与PD-1单抗的联合治疗,并进行肿瘤浸润淋巴细胞的分析以明确RNF138抑制对于胰腺癌免疫抑制微环境的改善与治疗价值。所使用的统计学方法包括 Student’s t 检验、Mann-Whimey U 检验、Kaplan-Meier 生存分析、Cox 回归检验以及Pearson检验。P值<0.05视为差异具有统计学意义。研究结果1、胰腺癌中RNF138的预后价值IHC染色显示,RNF138在胰腺癌组织中的表达水平显着高于癌旁组织（P<0.005）。胰腺癌组织中RNF138的表达水平与TNM分期及病理分级呈显着正相关（P<0.05）。单因素生存分析结果表明,RNF138的高表达与胰腺癌患者的不良预后相关（P<0.05）,高表达RNF138的胰腺癌患者总体生存时间显着短于RNF138低表达的患者（P<0.05）。多因素生存分析进一步表明,RNF138的高表达是胰腺癌患者不良预后的独立危险因素（HR=2.265,P=0.00291）。此外,肿瘤组织RNF138的高表达与CD8+T细胞浸润水平及PD-L1的表达呈显着负相关（P<0.05）。2、RNF138对胰腺癌恶性表型的调控Western blot证明,RNF138在胰腺癌细胞系中呈高表达,在正常胰腺细胞系中呈低表达。瞬时敲减RNF138可以在体外水平改变PANC-1细胞的细胞周期（P<0.05）;在稳定敲低RNF138的PANC-1和BXPC-3细胞株中,RNF138敲低能在体外显着抑制胰腺癌细胞的增殖和克隆形成,并引起细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。但是,RNF138敲低对胰腺癌细胞的体外运动以及侵袭转移能力无显着影响（P>0.05）。体内实验表明,RNF138敲低的PANC-1细胞在裸鼠皮下不成瘤。3、RNF138对胰腺癌恶性表型调控的分子机制利用转录组测序联合IPA分析基因表达谱和关键信号通路的变化,发现PANC-1细胞稳定敲低RNF138表达后STAT1的mRNA的表达量明显升高,富集分析提示IFN γ通路激活状态增加（P<0.05）。在PANC-1和BxPC-3细胞株中,RNF138稳转敲低时,STAT1与IRF1的mRNA及其蛋白表达水平明显增高（P<0.05）,下游的 IFN 标志基因 STAT1、IFIT1、IRF1、HLA-A、及 CD274（PD-L1）的mRNA表达量明显升高,而STAT1第701位点酪氨酸磷酸化水平相对不变。RNF138敲低后的PANC-1细胞增殖受外源性IFNγ刺激的抑制明显增加,而IFN α的作用较不明显。在RNF138KD的PANC-1细胞株中重表达野生型RNF138能有效降低了 STAT1的蛋白表达并挽救了细胞增殖能力的降低;RNF138不影响STAT1 mRNA的转录后稳定性,而是抑制其转录;生信预测与细胞实验均提示c-myc与RNF138的转录与蛋白表达呈正相关,可能是RNF138的转录诱导因子。RNF138预测的泛素化靶标蛋白为p53,免疫共沉淀进一步明确了RNF138与突变型p53之间存在分子相互作用,且RNF138敲低后胰腺癌细胞系中微小核数量明显减少;重表达各个功能域突变的RNF138提示RING与UIM功能域对于其抑制STAT1的功能至关重要。以上结果表明RNF138通过其泛素化修饰功能抑制STAT1表达以及IFN下游基因的激活,介导了 RNF138促进的胰腺癌发生发展以及免疫抑制的生物学现象。我们进一步探索了 RNF138抑制对于胰腺癌的治疗作用,在人源化免疫系统小鼠的PDX胰腺癌模型中联用si-RNF138与PD-1单抗有效抑制了肿瘤的生长速度,且流式分析肿瘤浸润淋巴细胞提示RNF138抑制可增加CD8+细胞浸润。结论1.胰腺癌中RNF138的预后价值（1）RNF138在胰腺癌组织中的表达水平显着高于胰腺癌旁组织,而在正常胰腺中几乎不表达。（2）RNF138高表达组胰腺癌患者总体生存期明显短于RNF138低表达组患者,且是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素。（3）RNF138高表达与胰腺癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润呈负相关。2.RNF138对胰腺癌恶性表型的调控（1）RNF138促进了胰腺癌细胞体外增殖与细胞周期进展,抑制细胞凋亡。（2）RNF138敲低可抑制胰腺癌细胞在裸鼠体内成瘤的能力。（3）RNF138不影响胰腺癌细胞体外侵袭转移能力。3.RNF138对胰腺癌恶性表型调控的分子机制（1）RNF138敲低后STAT1蛋白表达与IFN下游信号通路激活明显增加。（2）c-myc诱导RNF138 mRNA转录与蛋白表达。（3）RNF138与p53结合并依赖突变型p53发挥对于STAT1与IFN的抑制功能。（4）RNF138依赖其泛素化连接酶功能域对STAT1与IFN信号通路进行调控。（5）si-RNF138抑制剂于人源化免疫系统小鼠PDX胰腺癌模型中联用PD-L1可增加肿瘤微环境免疫细胞浸润与CD8/CD4 比值,有效减缓肿瘤生长。
顾焱[10]（2020）在《Abhd5/HOXA13促进结肠癌恶性表型的作用及机制研究》文中提出一、研究背景:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是严重危害人类健康的重大疾病之一,其发病率及死亡率均呈逐年上升趋势。肿瘤干细胞是肿瘤发生发展及复发的根本原因。自我更新是肿瘤“干性”的基本特征,导致肿瘤无限增殖及复发转移。研究表明,阻断肿瘤干细胞的自我更新能力是肿瘤靶向治疗的有效途径,但目前肿瘤干细胞自我更新调控机制仍不清楚。表观修饰（甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等）对蛋白活性功能发挥重要作用。研究表明多种抑癌基因及癌基因的甲基化修饰与其抑癌或促癌活性密切相关,参与调控肿瘤“干性”表型,但其受何种机制调控尚不明确。深入研究癌基因或抑癌基因表观修饰的调控机制及其对肿瘤干细胞自我更新的影响,可进一步阐释肿瘤发生发展的分子机制,对肿瘤靶向药物研发具有重要意义。目前代谢基因的异常激活或失活成为恶性肿瘤的重要标志。课题组成员前期研究成功鉴定出一个新的脂代谢相关抑癌基因,含自水解酶域蛋白5,又称Abhd5（Abhydrolase domain containing 5,Abhd5）,其表达缺失可显着促进结肠癌发生发展,但其具体分子机制仍不清楚。Abhd5是体内甘油三酯分解过程中的重要辅助因子,其本身虽没有脂肪酶的活性,但它可通过激活其他甘油三酯脂肪酶参与调控非脂肪组织和脂肪组织中的脂肪分解过程。本研究发现Abhd5的缺失促进Wnt信号通路的激活,以非β-Catenin依赖性方式增加并维持结肠癌细胞的“干性”,推测Abhd5介导的结肠癌细胞自我更新能力的改变是促进结肠癌发生发展的重要原因,深入探索Abhd5与DPY30相互作用影响组蛋白甲基转移酶SET1A活性进而维持结肠癌“干性”的分子机制,进一步阐明了该基因发挥抑癌基因的作用的分子途径。90%的结肠癌和所有家族性腺瘤息肉病都与Wnt信号通路的过度激活相关,然而在结肠癌中单纯阻断Wnt信号通路的策略并无显着效果,因此揭示新的靶基因,特别是调节Wnt/β-Catenin信号通路的基因,将在临床肿瘤的诊断和治疗中具有重要的意义和价值。近年来大量研究证实了发育相关基因参与调控Wnt信号通路并促进结肠癌发生发展。本研究发现发育相关基因,同源盒基因A13（Homeobox A13,HOXA13）,在结肠癌中显着上调,并且其基因高表达显着促进结肠癌细胞的增殖。为进一步明确HOXA13在结肠癌中的促癌作用,利用慢病毒载体技术建立HOXA13敲低及过表达结肠癌细胞模型,深入探索HOXA13在调控Wnt信号通路促进结肠癌发生发展的具体分子机制。二、研究目的1.明确Abhd5通过与DPY30相互作用影响SET1A活性,进而调控重要癌基因YAP甲基化激活的分子途径,揭示Abhd5在表观遗传调控中的新功能。2.进一步阐明Abhd5发挥抑癌基因作用的分子途径,为结肠癌临床治疗提供新的靶标。3.探索HOXA13在结肠癌恶性增殖中的作用及分子机制。三、材料与方法1.利用慢病毒载体技术建立Abhd5敲低的HCT-116结肠癌细胞模型,基因敲除技术构建Abhd5肠道特异性敲除APCmin/+小鼠,结合TCGA数据库分析、干细胞成球实验、软琼脂克隆形成实验、流式细胞学技术、无限稀释成瘤实验、腺相关病毒尾静脉注射等方法,验证Abhd5缺失激活YAP信号对结肠癌“干性”的影响。2.利用人结肠癌细胞HCT-116为模型,结合质谱分析、免疫组化、免疫荧光染色、Western Blot、Co-IP、Chip等实验方法,阐明Abhd5调控YAP翻译后修饰对YAP细胞定位及活性的影响。3.基于慢病毒载体构建Abhd5高低表达的结肠癌细胞系,结合荧光素酶报告基因实验、免疫荧光、Co-IP等实验技术探索Abhd5调控SET1A对YAP细胞定位的修饰的影响。4.利用核浆分离实验、质谱检测、IP等实验阐明Abhd5调控DPY30核转位影响SET1A活性的分子机制。5.利用结肠癌组织芯片的免疫组织化学染色检测HOXA13在结肠癌及癌旁组织的表达和临床相关性。6.慢病毒载体技术构建HOXA13基因敲低和过表达的人结肠癌细胞系用于体外增殖能力检测及机制研究。四、研究结果1.Abhd5缺失增加CD133+/CD44+及ALDH+细胞比例,显着促进结肠癌细胞的“干性”,结肠癌细胞敲低Abhd5表达后,调控干细胞自我更新能力的Wnt通路靶基因Met表达升高,且在Abhd5敲低的结肠癌细胞中进一步敲低Met表达可显着逆转细胞自我更新能力。进一步研究发现,Abhd5缺失激活Wnt通路靶基因Met并非通过经典β-Catenin依赖的途径,β-Catenin的表达活性在Abhd5缺失的结肠癌细胞中无显着变化。继续探索发现在Abhd5敲低的细胞中,YAP信号途径被激活,YAP核定位增加,促进Met的转录表达。2.Abhd5缺失促进SET1A介导的YAP K342甲基化,进而促进YAP核定位及活性。在Abhd5敲低的结肠癌细胞中,YAP在K342位点的甲基化水平显着升高,且这种YAP的甲基化依赖于组蛋白甲基转移酶SET1A的活性。3.Abhd5缺失显着上调SET1A复合物核心亚基DPY30的表达及核转位,且进一步研究发现Abhd5在胞浆中与DPY30发生相互结合而促进DPY30泛素化降解。4.以Abhd5lowDPY30highMethigh为特征的结肠癌患者可从Met抑制剂沃利替尼（Savolitinib）中获益。5.人结肠癌组织中HOXA13的表达较正常组织高,且HOXA13在癌组织中的高表达与临床预后不良密切相关。6.基于慢病毒载体构建HOXA13敲低和过表达的人结肠癌细胞系,使用克隆形成、CCK-8实验和裸鼠移植瘤实验发现HOXA13高表达促进结肠癌细胞的恶性增殖。7.HOXA13通过β-Catenin依赖的Wnt信号通路促进结肠癌的恶性增殖。进一步研究发现Wnt信号通路在HOXA13高表达的结肠癌中显着富集,且HOXA13过表达的结肠癌细胞中β-Catenin的活性明显增加,HOXA13与β-Catenin结合,HOXA13的过表达导致Wnt/β-Catenin通路下游靶基因Cyclin D1、Met的表达升高。五、结论1.Abhd5缺失通过非β-Catenin依赖的途径激活Wnt信号通路靶基因Met,进而促进结肠癌自我更新能力;2.Abhd5缺失抑制DPY30泛素化降解而促进DPY30入核激活甲基化酶SET1A,进而诱导YAP K342位点甲基化及核定位而持续激活下游基因Met的表达,导致结肠癌细胞“干性”而促进结肠癌恶性进展;3.HOXA13在人结肠癌组织中高表达,其高表达与临床预后不良相关;4.HOXA13与β-Catenin结合并促进β-Catenin的核积累,从而导致Wnt通路靶基因Cyclin D1、Met上调,Wnt/β-Catenin信号通路的活性增强,进而促进结肠癌细胞的恶性增殖。
二、增生病毒肿瘤靶向性及其分子机制的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、增生病毒肿瘤靶向性及其分子机制的研究进展（论文提纲范文）
（1）中国蜂胶及其黄酮类单体抗黑素瘤作用及其机制（论文提纲范文）
| 缩略词Abbreviations |
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述部分 |
| 第一章 黑素瘤治疗研究进展 |
| 1 黑素瘤发生诱发因素及其分子机制 |
| 2 黑素瘤治疗方法 |
| 2.1 化学药物治疗 |
| 2.2 免疫治疗 |
| 2.3 靶向治疗 |
| 2.4 黑素瘤的耐药机制 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 蜂胶及其单体抗肿瘤活性及其机制研究进展 |
| 1 蜂胶的抗肿瘤活性 |
| 2 蜂胶中活性单体成分的抗肿瘤活性 |
| 2.1 黄酮类化合物 |
| 2.2 萜烯类化合物 |
| 2.3 酚酸类化合物 |
| 3 蜂胶及其有效活性成分的抗肿瘤机制 |
| 3.1 诱导细胞凋亡 |
| 3.2 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 3.3 抗血管增生 |
| 3.4 抗肿瘤转移 |
| 3.5 对致癌因素的防治 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 研究目的及主要内容 |
| 1 研究目的与意义 |
| 2 研究思路和主要内容 |
| 2.1 中国蜂胶的抗黑素瘤活性研究 |
| 2.2 中国蜂胶中抗黑素瘤活性单体筛选研究 |
| 2.3 松属素对黑素瘤的促凋亡作用及其机制研究 |
| 2.4 柯因对黑素瘤的抗转移作用及其机制研究 |
| 3 技术路线 |
| 实验研究部分 |
| 第四章 中国蜂胶对黑素瘤的促凋亡影响研究 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料与方法 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 蜂胶样品收集和提取 |
| 2.4 细胞活力检测 |
| 2.5 细胞凋亡检测 |
| 2.6 细胞周期检测 |
| 2.7 总蛋白提取 |
| 2.8 蛋白印迹分析 |
| 2.9 基因表达丰度检测 |
| 2.10 细胞划痕实验 |
| 2.11 数据分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 中国蜂胶诱导线粒体主导的人黑素瘤细胞A375内源性死亡 |
| 3.2 中国蜂胶诱导人黑素瘤细胞A375 S-G2/M期细胞周期阻滞 |
| 3.3 中国蜂胶通过抑制NLRP-1相关炎性通路诱导A375细胞凋亡发生 |
| 3.4 中国蜂胶引发自噬从而增强其对人黑素瘤的细胞活性 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 中国蜂胶抗黑素瘤单体活性成分筛选 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 液相色谱法-质谱联用(LC-MS)分析 |
| 2.2 实验试剂与成分 |
| 2.3 细胞活力检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 中国蜂胶成分分析 |
| 3.2 中国蜂胶抗黑素瘤单体成分筛选 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 中国蜂胶活性成分松属素抗黑素瘤作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞活性试验 |
| 2.4 细胞凋亡率检测 |
| 2.5 TUNEL试验 |
| 2.6 蛋白免疫印迹 |
| 2.7 细胞自噬检测 |
| 2.8 动物实验 |
| 2.9 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 松属素诱导黑素瘤细胞凋亡 |
| 3.2 松属素诱导凋亡caspase级联反应与线粒体无关 |
| 3.3 松属素通过IRE1/Xbp1/CHOP通路诱导内质网应激介导的凋亡 |
| 3.4 松属素通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制黑素瘤细胞中自噬发生 |
| 3.5 松属素在动物模型中抑制黑素瘤的生长 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 柯因抑制黑素瘤转移效果研究 |
| 1 引言 |
| 2 试剂与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 蛋白质印迹实验 |
| 2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.4 免疫荧光染色 |
| 2.5 C57BL/6小鼠肺转移模型 |
| 2.6 FOXM1过表达实验 |
| 2.7 细胞划痕实验 |
| 2.8 Transwell迁移实验 |
| 2.9 体外血管生成实验 |
| 2.10 体外细胞失巢死亡实验 |
| 2.11 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 柯因在体内外抑制黑素瘤细胞转移 |
| 3.2 柯因调控黑素瘤细胞上皮间充质转化过程和细胞基质降解 |
| 3.3 柯因减弱黑素瘤失巢凋亡抵抗和血管生成能力 |
| 3.4 柯因通过针对FOXM1调节黑素瘤细胞中β-catenin通路 |
| 3.5 过表达FOXM1减弱柯因对A375细胞转移的抑制作用 |
| 3.6 柯因通过干扰Pin1-FOXM1信号转导促进FOXM1降解 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第八章 总结与展望 |
| 1.研究总结 |
| 2.创新点 |
| 3.研究展望 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）表面增强拉曼光谱技术在细胞器靶向检测与治疗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细胞器简介 |
| 1.1.1 细胞器的分类和组成 |
| 1.1.1.1 细胞核 |
| 1.1.1.2 线粒体 |
| 1.1.1.3 溶酶体 |
| 1.1.1.4 内质网 |
| 1.1.1.5 高尔基体 |
| 1.1.2 细胞器与疾病 |
| 1.2 细胞器靶向检测与治疗 |
| 1.2.1 细胞器靶向策略 |
| 1.2.1.1 被动靶向 |
| 1.2.1.2 主动靶向 |
| 1.2.2 细胞器靶向检测 |
| 1.2.2.1 细胞器相关检测技术 |
| 1.2.2.2 细胞器结构成像 |
| 1.2.2.3 细胞器微环境检测 |
| 1.2.3 细胞器靶向治疗 |
| 1.2.3.1 细胞核靶向治疗 |
| 1.2.3.2 线粒体靶向治疗 |
| 1.2.3.3 溶酶体靶向治疗 |
| 1.3 表面增强拉曼光谱技术在细胞器检测与治疗中的应用 |
| 1.3.1 表面增强拉曼光谱简介 |
| 1.3.2 表面增强拉曼光谱在细胞器检测与治疗中的应用 |
| 1.4 本论文的研究思路和主要内容 |
| 第二章 细胞器靶向的SERS纳米传感器用于细胞器pH传感 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 AMT pH SERS纳米传感器的制备和表征 |
| 2.2.3 超分辨共聚焦荧光显微镜观察靶向纳米传感器在细胞内的分布 |
| 2.2.4 细胞TEM成像 |
| 2.2.5 细胞毒性评估 |
| 2.2.6 pH标准曲线的绘制 |
| 2.2.7 细胞器的pH检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 pH SERS纳米传感器的制备和表征 |
| 2.3.2 pH SERS纳米传感器的靶向性 |
| 2.3.3 PBS和培养基中MPy的 pH响应 |
| 2.3.4 探针的稳定性 |
| 2.3.5 正常细胞和癌细胞中细胞器pH检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 细胞器靶向金纳米棒SERS探针用于细胞器生物大分子分析和增强光热治疗效果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 基于AuNRs的细胞器靶向探针的制备 |
| 3.2.3 暗场荧光成像优化AMT、ANT和 ALT与细胞培养时间 |
| 3.2.4 超分辨共聚焦荧光显微镜观察AMT、ANT和 ALT在细胞内的分布 |
| 3.2.5 细胞TEM成像 |
| 3.2.6 SERS检测 |
| 3.2.7 AMT、ANT和 ALT的光热性能研究 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 细胞器靶向探针的制备和表征 |
| 3.3.2 荧光暗场成像优化ANT、AMT、和ALT与细胞培养的时间 |
| 3.3.3 探针在细胞内的精确定位 |
| 3.3.4 细胞器的原位SERS光谱 |
| 3.3.5 细胞器SERS光谱分析 |
| 3.3.6 细胞器SERS光谱比较 |
| 3.3.7 细胞器靶向探针用于光热治疗 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 无干扰SERS纳米传感器用于光热治疗过程中线粒体活性氧的动态监测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 AuNPs的合成 |
| 4.2.3 不同Ag壳厚度的Au@Ag NPs的合成 |
| 4.2.4 Au@MBN@Ag@MLS的合成 |
| 4.2.5细胞毒性实验 |
| 4.2.6 水溶液中的ROS传感 |
| 4.2.7 细胞外源性和内源性ROS的检测 |
| 4.2.8 PTT过程中线粒体ROS的成像监测 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 Au@Ag NPs的制备及表征 |
| 4.3.2 不同Ag壳厚度的MBN的SERS响应 |
| 4.3.3 水溶液中的ROS传感 |
| 4.3.4 Au@MBN@Ag NPs对线粒体的靶向能力 |
| 4.3.5 探针稳定性 |
| 4.3.6 细胞内外源性和内源性ROS的检测 |
| 4.3.7 在细胞器水平上监测PTT过程中ROS动态变化 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 线粒体靶向超碳点用于癌细胞选择性光热治疗及其分子机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 CDs和 SCDs的制备 |
| 5.2.3 线粒体靶向SCDs的制备 |
| 5.2.4 光热效应评估 |
| 5.2.5 细胞培养 |
| 5.2.6 超分辨共聚焦荧光显微镜确定SCDs-MT在细胞内的位置 |
| 5.2.7细胞毒性实验 |
| 5.2.8 Calcein-AM/PI实验 |
| 5.2.9 线粒体损伤检测 |
| 5.2.10 SERS检测 |
| 5.3 结果和讨论 |
| 5.3.1 CDs、SCDs和 SCD-MT的制备和表征 |
| 5.3.2 SCDs的光热性质、稳定性和生物相容性 |
| 5.3.3 癌细胞选择性消融 |
| 5.3.4 PTT过程中的线粒体损伤 |
| 5.3.5 SERS研究PTT过程中细胞生物分子的动态变化 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（3）TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤新靶点的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 现代医学对肿瘤的认识和治疗 |
| 1.1.1 肿瘤认识的发展 |
| 1.1.2 肿瘤产生的病理研究 |
| 1.1.3 肿瘤的预防 |
| 1.1.4 肿瘤的治疗 |
| 1.2 TRAF6 简介 |
| 1.2.1 TRAF超家族的结构特点和功能 |
| 1.2.2 TRAF6 的结构特点 |
| 1.2.3 TRAF6 相关信号通路的研究 |
| 1.2.4 TRAF6 与肿瘤的关系 |
| 1.3 靶向抗肿瘤研究进展 |
| 1.3.1 以分子量分类的靶向抗肿瘤药物 |
| 1.3.2 以作用靶点分类的靶向抗肿瘤药物 |
| 1.4 靶向TRAF6 抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 利用miRNA调节TRAF6 的表达来抑制肿瘤细胞的增殖 |
| 1.4.2 利用TRAF6 的干扰剂抑制肿瘤细胞的增殖 |
| 1.4.3 根据TRAF6 独特的结构,通过计算机模拟筛选出能够和TRAF6结合的小分子化合物抑制肿瘤细胞的增殖 |
| 1.5 靶向TRAF6的RING-Zn结构域的抗肿瘤研究位点的选取 |
| 1.5.1 泛素化系统简介 |
| 1.5.2 RING-Zn结构域作为抗肿瘤靶点的选取 |
| 1.5.3 研究优势 |
| 1.5.4 本研究设计思路 |
| 第2章 计算机辅助药物设计与小分子化合物的筛选 |
| 2.1 实验材料和筛选软件 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.1.4 计算机筛选所需软件及用途 |
| 2.2 计算机辅助药物设计理论基础 |
| 2.2.1 计算机辅助药物设计的原理 |
| 2.2.2 计算机辅助药物设计的研究思路 |
| 2.2.3 计算机辅助药物设计的方法 |
| 2.2.4 计算机辅助药物设计的发展趋势 |
| 2.3 利用分子对接筛选小分子化合物 |
| 2.3.1 分子对接法基本原理 |
| 2.3.2 分子对接方法 |
| 2.3.3 计算机模拟分子对接的流程 |
| 2.3.4 筛选能与TRAF6的RING-Zn结构域结合的小分子化合物 |
| 2.4 小分子化合物抗肿瘤活性的初步筛选 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 细胞传代 |
| 2.4.3 细胞冻存 |
| 2.4.4 细胞复苏 |
| 2.4.5 细胞计数 |
| 2.4.6 MTT法检测化合物对细胞增殖的影响 |
| 2.4.7 统计学分析 |
| 2.5 分子对接法筛选结果 |
| 2.5.1 分子对接筛选能与Ubc13 竞争性结合TRAF6的RING-Zn结构域的化合物 |
| 2.5.2 MTT实验结果 |
| 2.5.3 竞争性结合TRAF6的RING-Zn结构域的化合物的确定 |
| 2.5.4 化合物与TRAF6 的结合 |
| 2.6 本章小结和讨论 |
| 第3章 靶向RING-Zn结构域的化合物对细胞早期凋亡的影响及其分子机制的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 抗体和试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.2 化合物对细胞早期凋亡的影响 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 流式细胞术检测合物对HeLa细胞早期凋亡的影响 |
| 3.3 免疫印迹法检测蛋白水平的变化 |
| 3.3.1 细胞总蛋白的提取 |
| 3.3.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.3.3 SDS-PAGE凝胶的制备 |
| 3.3.4 蛋白上样 |
| 3.3.5 电泳 |
| 3.3.6 半干转法转膜及蛋白印迹检测 |
| 3.4 免疫沉淀检测蛋白之间的相互作用 |
| 3.4.1 免疫沉淀法实验步骤 |
| 3.4.2 检测蛋白之间的相互作用 |
| 3.5 统计学方法 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.6.1 细胞中TRAF6 表达量的检测 |
| 3.6.2 化合物对HeLa细胞凋亡的检测结果 |
| 3.6.3 化合物对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.4 化合物处理后对AKT活化的影响 |
| 3.6.5 化合物刺激细胞后对TAK1 活化的影响 |
| 3.7 本章小结和讨论 |
| 第4章 动物体内抗肿瘤机制的研究和对免疫系统的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系和实验动物 |
| 4.1.2 抗体和试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.2 肿瘤模型的构建和抗肿瘤活性的检测 |
| 4.2.1 构建宫颈癌小鼠模型 |
| 4.2.2 检测金鸡纳碱化合物在体内的抗肿瘤活性 |
| 4.3急性毒性实验 |
| 4.4 TUNEL法检测化合物对肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 4.4.1 制备肿瘤组织切片 |
| 4.4.2 TUNEL法实验步骤 |
| 4.5 化合物刺激后对免疫系统的影响 |
| 4.5.1 金鸡纳碱化合物对外周血中T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.5.2 金鸡纳碱化合物对脾脏细胞中T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.5.3 金鸡纳碱化合物对血清中TNF-α、IFN-γ、IgG表达水平的影响 |
| 4.6 统计学方法 |
| 4.7 实验结果 |
| 4.7.1 C57BL/6J小鼠肿瘤的增长曲线 |
| 4.7.2 化合物对C57BL/6J小鼠宫颈癌模型的抑瘤作用 |
| 4.7.3 化合物对小鼠急性毒性的影响 |
| 4.7.4 金鸡纳碱化合物对小鼠宫颈癌模型肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 4.7.5 金鸡纳碱化合物对肿瘤模型小鼠的胸腺和脾脏的影响 |
| 4.7.6 金鸡纳碱化合物对小鼠宫颈癌模型外周血中淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.7.7 金鸡纳碱化合物对小鼠宫颈癌模型脾脏中淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.7.8 金鸡纳碱化合物对小鼠宫颈癌模型血清中的TNF-α、IFN-γ、IgG表达水平的调节 |
| 4.8 本章小结和讨论 |
| 第5章 TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤靶点的验证 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞系 |
| 5.1.2 抗体和试剂 |
| 5.1.3 仪器 |
| 5.1.4 溶液配制 |
| 5.2 通过免疫荧光实验检测辛可宁和TRAF6 在细胞内的结合 |
| 5.2.1 带荧光标签的辛可宁的合成 |
| 5.2.2 免疫荧光法检测辛可宁和TRAF6 的结合 |
| 5.3 构建TRAF6 低表达的HeLa细胞系并检测其对化合物的敏感性 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 利用siRNA干扰TRAF6在HeLa细胞中的表达 |
| 5.3.3 TRAF6 cDNA的获得 |
| 5.3.4 Quantitative real time-PCR法进行细胞m RNA水平检测 |
| 5.3.5 Western blot法对TRAF6 蛋白表达检测 |
| 5.3.6 利用MTT法检测TRAF6 低表达细胞对金鸡纳碱化合物的敏感性 |
| 5.4 带有惰性集团的辛可宁对HeLa细胞增殖的影响 |
| 5.4.1 合成惰性辛可宁(Cinchonine-OMe) |
| 5.4.2 利用MTT法检测惰性辛可宁(Cinchonine-OMe)和辛可宁对HeLa细胞和NHDF细胞增殖的影响 |
| 5.5 统计学方法 |
| 5.6 实验结果 |
| 5.6.1 带荧光标签的辛可宁的合成 |
| 5.6.2 细胞中TRAF6 和辛可宁的相互作用 |
| 5.6.3 qRT-PCR检测TRAF6 mRNA水平 |
| 5.6.4 Western blot法分析TRAF6 蛋白表达水平 |
| 5.6.5 化合物对TRAF6 低表达HeLa细胞增殖的影响 |
| 5.6.6 惰性辛可宁Cinchonine-OMe的合成 |
| 5.6.7 惰性辛可宁和辛可宁对HeLa细胞和NHDF细胞增殖的影响 |
| 5.7 本章小结和讨论 |
| 第6章 结论和展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 本论文的创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）Lumican在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的表达研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LUM对YTS细胞生物功能的影响及其分子机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LUM过表达对动物体内NK/T细胞淋巴瘤生长的影响研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 1 LUM的基本结构 |
| 2 LUM的功能与作用机制 |
| 3 LUM与肿瘤的关系 |
| 4 结语及展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（5）L-脯氨酸—间—双（2-氯乙）胺基-L-苯丙氨酰基-L-正缬氨酸乙酯盐酸盐（MF13）的抗肝癌作用及其分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 论文发表 |
| 致谢 |
| 附件一 |
| 附件二 |
| 附件三 |
（6）肿瘤特异性增殖腺病毒CNHK 500治疗乳腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文 肿瘤特异性增殖腺病毒CNHK500治疗乳腺癌体内外实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肿瘤特异性增殖型腺病毒CNHK500的构建和制备材料和方法 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肿瘤特异性增殖腺病毒CNHK500治疗乳腺癌体外实验研究材料和方法 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肿瘤特异性增殖腺病毒CNHK500治疗乳腺癌裸鼠移植瘤实验研究材料和方法 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 文献综述 肿瘤增殖腺病毒ONYX-015的试验研究及临床研究进展 |
| 文献综述 选择性增殖腺病毒肿瘤靶向性的分子机制研究进展 |
（8）薯蓣皂苷介导ATM/p53信号通路调控皮肤癌A431细胞凋亡和迁移作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 薯蓣皂苷对皮肤癌裸鼠移植瘤的抑癌作用研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞凋亡作用及分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 薯蓣皂苷对皮肤癌A431细胞迁移侵袭作用及分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 创新性评价 |
| 参考文献 |
| 综述一 薯蓣皂苷抗肿瘤作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 皮肤癌的治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（9）基于肿瘤转移相关基因的胰腺癌预后模型构建及RNF138对胰腺癌恶性表型的调控及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分: 基于肿瘤转移相关基因的胰腺癌预后模型的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: RNF138对胰腺癌恶性表型的调控及其分子机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 局限与展望 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 综述 Ubiquitin ligase in tumorigenesis and therapy of pancreatic cancer |
| Reference |
| 攻读学位期间取得的研究成果及奖励 |
| 致谢 |
（10）Abhd5/HOXA13促进结肠癌恶性表型的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Abhd5缺失调节YAP信号通路促进结肠癌细胞自我更新 |
| 2.1 Abhd5缺失促进结肠癌细胞自我更新能力 |
| 2.2 ABHD5缺失通过非β-Catenin依赖途径激活Wnt通路靶基因Met,进而促进结肠癌细胞自我更新能力 |
| 2.3 Abhd5缺失促进YAP核定位及活性,进而激活Wnt靶基因Met的表达 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Abhd5通过调节SET1A活性调控YAP赖氨酸342位点甲基化对结肠癌“干性”相关基因转录表达的调控作用 |
| 3.1 Abhd5缺失诱导YAP K342甲基化,进而促进YAP核定位及活性 |
| 3.2 Abhd5缺失促进SET1A介导的YAP K342甲基化,进而促进YAP核定位及活性 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 Abhd5调控DPY30蛋白稳定性及入核影响SET1A活性的分子机制 |
| 4.1 Abhd5缺失通过非PNPLA2依赖途径促进SET1A诱导的YAP甲基化 |
| 4.2 Abhd5在胞浆中结合SET1A辅助蛋白DPY30促进其泛素化降解,进而抑制DPY30入核发挥其促SET1A诱导YAPK342甲基化 |
| 4.3 Met的药理学抑制作用可降低Abhd5~(low)DPY30~(high)Met~(high)肿瘤的原代结肠癌细胞的干性 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 部分总结 |
| 第五章 同源盒转录因子HOXA13对结肠癌生物学行为的影响及作用机制 |
| 5.1 同源盒转录因子HOXA13表达与结肠癌临床病理特征相关性研究 |
| 5.2 同源盒转录因子HOXA13对结肠癌细胞生物学行为的影响及其分子机制 |
| 5.3 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结肠癌的表观遗传学:生物标志物和治疗潜力 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、增生病毒肿瘤靶向性及其分子机制的研究进展（论文参考文献）
- [1]中国蜂胶及其黄酮类单体抗黑素瘤作用及其机制[D]. 郑宇斐. 浙江大学, 2020
- [2]表面增强拉曼光谱技术在细胞器靶向检测与治疗中的应用[D]. 申燕婷. 吉林大学, 2020(08)
- [3]TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤新靶点的分子机制研究[D]. 祁永浩. 天津大学, 2018(06)
- [4]Lumican在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学作用及机制研究[D]. 牛松涛. 郑州大学, 2017(05)
- [5]L-脯氨酸—间—双（2-氯乙）胺基-L-苯丙氨酰基-L-正缬氨酸乙酯盐酸盐（MF13）的抗肝癌作用及其分子机制的研究[D]. 胡琼莹. 中国协和医科大学, 2004(12)
- [6]肿瘤特异性增殖腺病毒CNHK 500治疗乳腺癌的实验研究[D]. 李月敏. 中国人民解放军军事医学科学院, 2004(04)
- [7]增生病毒肿瘤靶向性及其分子机制的研究进展[J]. 李月敏. 肿瘤研究与临床, 2003(06)
- [8]薯蓣皂苷介导ATM/p53信号通路调控皮肤癌A431细胞凋亡和迁移作用及机制研究[D]. 王鹏. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [9]基于肿瘤转移相关基因的胰腺癌预后模型构建及RNF138对胰腺癌恶性表型的调控及其分子机制研究[D]. 吴孟闱. 北京协和医学院, 2021
- [10]Abhd5/HOXA13促进结肠癌恶性表型的作用及机制研究[D]. 顾焱. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)