一、哺乳动物细胞核移植(克隆)研究进展(下)（论文文献综述）
康宇[1]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中认为哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
李昊[2]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究表明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
邓明田[3]（2018）在《LncRNA参与调控山羊合子基因组激活期核移植胚胎重编程的研究》文中研究表明哺乳动物合子基因组激活（Zygotic genome activation,ZGA）过程中合成大量新蛋白,接替母源物质调控早期胚胎发育。体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）胚胎发育过程中,合子基因组激活异常,导致核移植胚胎发育阻滞在ZGA时期。研究表明长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lncRNA）参与调控合子基因组激活。但山羊胚胎ZGA时期尚不明确,lncRNA保守性较差,同时lncRNA参与调控核移植胚胎重编程的研究也鲜有报道。因此,本研究以山羊胚胎为试验材料,探究lncRNA调控山羊ZGA期核移植胚胎重编程的机制。本研究主要分为以下四部分:试验一、山羊ZGA期差异表达mRNA和lncRNA的研究本试验旨在确定山羊合子基因组激活期,并筛选鉴定影响山羊合子基因组激活的mRNA和lncRNA。首先,利用体外培养试验和免疫荧光的方法确定山羊合子基因组激活期。其次,使用单细胞转录组测序技术分析山羊ZGA过程中mRNA和lncRNA的表达变化。最后,利用显微注射siRNA（Smallinterfering RNA）的方法研究干扰lncRNA对山羊早期胚胎发育的影响。结果显示:（1）在体外培养试验和20 μg/ml α-鹅膏菌素（α-amanitin）处理试验中,山羊胚胎出现8细胞期阻滞现象;同时,RNA聚合酶Ⅱ在8细胞期胚胎中高表达。（2）与4细胞期胚胎相比,8细胞期胚胎中有800个mRNA和250个lncRNA差异表达。（3）差异表达mRNAKdm4d与H3K9me3有关,在8细胞期胚胎中表达水平显着升高;H3K9me3在山羊胚胎ZGA过程中动态变化,在8细胞期胚胎中几乎不表达,但在发育阻滞的8细胞期胚胎中高表达。（4）差异表达lncRNA lnc1178、lnc137和lnc3263均靶向作用于多个差异表达的转录因子,因此选作功能性lncRNA;分别干扰lnc1178、lnc137和lnc3263在山羊合子中的表达,发现干扰lnc137的山羊胚胎中,嚢胚率显着降低（19.4±0.44%Vs.75±2.89%,P<0.01）。（5）干扰lnc137显着降低8细胞胚胎中合子基因CXCL6、EIF-1A和HSP70.1的表达水平（P<0.01）,并上调母源基因GDF9（P<0.01）的表达水平。以上结果表明,山羊合子基因组激活发生在8细胞期;在山羊合子基因组激活过程中,mRNA和lncRNA动态变化;LncRNA lnc137可能通过促进母源基因降解和合子基因表达,影响山羊早期胚胎发育。试验二、山羊核移植胚胎ZGA期差异表达mRNA的研究SCNT胚胎中普遍存在异常的合子基因组激活。因此,本试验利用单细胞转录组测序技术分析山羊核移植胚胎ZGA期mRNA的表达变化。其次,分析组蛋白甲基化修饰相关基因和组蛋白修饰H3K4me3在核移植胚胎发育过程中的变化。最后,利用显微注射技术分析差异表达mRNA对核移植胚胎体外发育的影响。结果显示:（1）与8细胞期单精子胞质注射（Intracytoplasmic sperm injection,ICSI）胚胎相比,8细胞期核移植胚胎中,813个mRNA表达水平显着升高,235个mRNA表达水平显着降低。（2）H3K4me3去甲基化基因Kdm5a（P<0.01）和Kd5b（P<0.05）在8细胞期山羊核移植胚胎中表达水平显着降低。（3）组蛋白甲基化修饰H3K4me3在山羊ICSI胚胎合子基因组激活过程中逐渐降低,在ICSI囊胚中消失,但在8细胞期核移植胚胎中H3K4me3修饰水平仍然较高。（4）注射Kdm5b mRNA可有效移除8细胞期核移植胚胎中的H3K4me3修饰,并显着提高山羊核移植胚胎囊胚率（47.91±0.86%Vs.17.67±3.1%,P<0.01）;干扰Kdm5b导致8细胞期核移植胚胎中H3K4me3水平仍然较高,核移植胚胎发育受阻。以上结果表明,山羊核移植胚胎合子基因组激活异常,且存在异常高水平的H3K4me3修饰;Kdm5b可促进体细胞核移植胚胎重编程。本试验为探究体细胞核移植胚胎重编程机制及提高山羊核移植胚胎体外发育能力提供了理论参考。试验三、LncRNA调控山羊核移植胚胎重编程的研究LncRNA参与调控哺乳动物早期胚胎发育,但其对核移植胚胎重编程的作用鲜有报道。因此,本试验旨在筛选影响山羊核移植胚胎合子基因组激活期重编程的lncRNA,并阐述其调控核移植胚胎重编程的潜在机制。首先,利用单细胞转录组测序技术筛选山羊核移植胚胎合子基因组激活过程中差异表达的lncRNA。其次,以Kdm5b作为靶基因筛选功能性lncRNA,并初步验证Kdm5b和靶基因关系。最后,利用显微注射技术研究lncRNA对山羊核移植胚胎早期发育的影响,并阐述其影响核移植胚胎重编程的机制。结果显示:（1）与4细胞期核移植胚胎相比,8细胞期核移植胚胎中共有159个lncRNA差异表达,其中131个lncRNA表达水平显着升高,28个lncRNA表达水平显着降低。（2）以Kdm5b作为靶基因,筛选得到18个候选lncRNA,其中lnc3712受Kdm5b影响最为显着,因此选择lnc3712进行后续研究。（3）干扰lnc3712的山羊核移植胚胎,囊胚率显着升高（45.94±1.3%Vs.17.67±3.1%,P<0.01）。（4）在干扰lnc3712的8细胞期山羊核移植胚胎中,700个mRNA表达水平升高,其中合子基因BTG3、UBE2M、UBE2S、EIF3G、BTG1和HSFl等表达水平显着升高（P<0.05）;同时,转录因子ABTB1、GATA2和TEAD4等表达水平显着升高（P<0.01）,而母源基因WEE2和GDF9表达水平显着降低（P<0.01）。（5）干扰lnc3712的8细胞期山羊核移植胚胎中,Kdm5b表达水平显着升高（P<0.05）,组蛋白甲基化修饰H3K4me3消失;同时,在干扰lnc3712的核移植胚胎囊胚期H3K27me3重新出现。以上结果表明,lncRNA在山羊核移植胚胎合子基因组激活过程中动态变化;干扰lnc 3712可促进合子基因表达和基因组转录,并促进Kdm5b表达,提高体细胞核移植胚胎重编程效率。本试验鉴定得到一个参与调控山羊核移植重编程的新lncRNA,丰富了 lncRNA调控核移植重编程的研究内容,同时为研究lncRNA调控核移植重编程提供了理论依据。试验四、核移植胚胎及克隆山羊Xist启动子甲基化状态的研究LncRNA Xist对XCI的建立极为重要,但山羊基因组中Xist序列未知,而且有关Xist的研究在克隆山羊中也鲜有报道。因此,本试验分析ZGA期核移植胚胎和克隆山羊耳、肺脏和脑组织中Xist表达水平及启动子甲基化状态的变化。首先,本研究扩增了山羊Xist基因的启动子序列,并利用MethPrimer预测其差异甲基化区域（Differentially methylated region,DMR）。其次,利用亚硫酸盐测序（Bisulfite sequencing PCR,BSP）分析ZGA期山羊核移植胚胎及死亡克隆山羊耳、肺脏和脑组织中Xist启动子甲基化水平并利用荧光定量PCR分析Xist及X染色体相关基因的表达水平。结果显示:（1）预测的XistDMR在精子、卵母细胞、雌性成纤维细胞和雄性肺脏组织中甲基化水平不同,是差异甲基化区域。（2）在山羊8细胞期核移植胚胎中,Xist甲基化水平显着高于ICSI同时期胚胎。（3）在雌性死亡克隆山羊耳、肺脏和脑组织中,Xist启动子甲基化水平显着升高（P<0.01）。但在雄性死亡克隆山羊耳、肺脏和脑组织中及存活克隆山羊耳组织中,Xist DMR甲基化水平无显着改变。（4）在山羊8细胞期核移植胚胎中,Xist表达水平无显着差异,但在雌性死亡克隆山羊耳、肺脏和脑组织中,Xist表达水平显着降低（P<0.01）。以上结果表明,山羊核移植胚胎ZGA期和雌性死亡克隆山羊中Xist甲基化水平异常升高。通过以上试验,本研究证实了山羊ZGA发生在8细胞期。在山羊胚胎ZGA过程中,800个mRNA和250个lncRNA差异表达,干扰lnc137影响山羊早期胚胎发育。在山羊核移植胚胎发育过程中,合子基因组激活异常。过表达Kdm5b或干扰lnc3712均显着提高核移植胚胎体外发育能力;特别是lnc3712可能通过Kdm5b调控山羊核移植胚胎重编程。本研究丰富了 lncRNA调控核移植重编程的研究内容,同时为探究体细胞核移植重编程机制及提高山羊核移植胚胎体外发育能力提供了理论参考。
殷玉鹏[4]（2012）在《梅花鹿体细胞克隆胚胎构建及Ercc6l基因表达的研究》文中认为近年来，体细胞核移植技术、转基因技术和干细胞技术等相关技术结合，陆续诞生了一批转基因克隆动物，使得哺乳动物细胞核质互作、重编程、细胞核全能性和可塑性、细胞分化和发育规律等分子机制的研究更加广泛和深入。但是体细胞核移植技术和操作程序仍不稳定，克隆动物成功率很低。普遍认为异常重编程是导致克隆效率低的主要原因之一。提高体细胞核移植效率需要从两个方面入手，一是优化体细胞核移植操作程序；二是从基因、分子和细胞水平研究核移植过程中的重编程机制，从而揭示生产克隆动物效率低的本质原因。梅花鹿基因组承受人类改造很少，是胚胎的体外生产、发育和检测一个极好的动物模型。本实验对梅花鹿体细胞克隆胚胎构建及Ercc6l基因表达进行了系统研究，其中包括梅花鹿卵母细胞的体外成熟培养条件的优化；卵母细胞的孤雌激活；转pEGFP-N1胎儿成纤维细胞系的建立；不同浓度TSA处理供核细胞H4K5蛋白信号的变化；TSA处理对克隆胚胎发育的影响；秋水酰胺和秋水仙素诱导化学性辅助去核构建克隆胚胎；发育相关Ercc6l基因的分子克隆并检测早期胚胎、胎儿和成体主要器官表达情况。结果表明：（1）繁殖季节卵母细胞的成熟率极显着高于非繁殖季节；（2）化学激活比电激活更适合梅花鹿孤雌胚胎的发育；（3）胎儿成纤维细胞比成体耳部成纤维细胞重塑潜力更大，更适合作核移植供体细胞；（4）50nMTSA处理体细胞24h作为供核细胞，再处理重构胚胎10h可以显着的提高囊胚率；（5）秋水酰胺和秋水仙素诱导化学性辅助去核比盲吸去核更加有利于胚胎的植入前发育；（6）首次克隆了梅花鹿发育相关Ercc6l基因的mRNA全序列；（7）克隆胚胎和孤雌胚胎早期不同发育阶段Ercc6l基因的表达水平没有显着差异，Ercc6l基因在胎儿、成体主要器官的表达水平随着年龄的增长而略有下降。总之，本实验对梅花鹿发育过程中Ercc6l表达量进行了检测，对梅花鹿体细胞核移植操作程序的优化进行了有益探讨和论述，为成功获得克隆梅花鹿奠定了坚实的基础。
黄雅琼[5]（2008）在《猪体细胞核移植相关技术研究》文中研究指明1.探讨了猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程和卵母细胞的发育潜力。（1）不同直径卵泡内的卵母细胞的成熟进程及各时相出现的时间存在差异。直径＞2mm的卵泡内的卵母细胞体外培养16 h,大部分发生GVBD（germinal vesicle breakdown）;卵母细胞GV期的比率由0h的68.00%下降到16h的15.38%;成熟培养20h时,终变期（diakinesis,DK）的比率达到峰值（27.06%）,而MⅠ的峰值（69.69%）出现在培养后28h;成熟培养32～44h时,Ana-Ⅰ/Tel-Ⅰ期的比率达到最高（53.33%）;成熟培养48h时,MⅡ期的比率达到最大值（63.64%）。（2）不同直径卵泡的卵母细胞体外成熟后的孤雌发育能力不同。直径＜2mm、直径2～6mm、直径＞6mm的卵泡的卵母细胞的成熟率分别为5.12%,66.63%和46.72%;分裂率分别为1.42%,72.19%和58.54%;囊胚率分别为0、28.76%和23.13%。直径＜2mm和＞6mm卵泡内的卵母细胞的卵裂率明显低于直径2～6mm卵泡的卵母细胞的卵裂率（P＜0.05）。直径2～6mm卵泡内的卵母细胞体外成熟较快,体外发育潜能较高。2.探讨了激素和生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果发现,在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母细胞成熟率显着高于添加0.01IU/mL人绝经期促性腺激素（hMG）的卵母细胞成熟率（P＜0.05）,但两组间的分裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。猪卵母细胞分别在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生长因子（EGF）的成熟液中成熟培养后进行孤雌激活,50ng/mL EGF组的成熟率达到66.89%,孤雌激活的分裂率达到84.90%,囊胚率达到30.20%,成熟率显着高于其余各组,分裂率和囊胚率高于对照组。在成熟液中添加10ng/mL胰岛素样生长因子（IGF-I）显着提高猪卵母细胞的第一极体排出率。在成熟液中同时添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I显着提高猪卵母细胞的孤雌发育能力（P＜0.05）。分别使用以TCM-199、NCSU-23（North Carolina State University-23,北卡大学胚胎培养液）和PZM-3为基础液的成熟液进行成熟培养猪卵母细胞,各组间在分裂率,成熟率和囊胚率方面差异不显着（P＞0.05）,表明均可用于猪卵母细胞的体外成熟和体外培养。3.系统探讨了孤雌激活方法对猪卵母细胞孤雌发育效果的影响。结果发现:（1）浓度为9%的乙醇（EH）激活处理10min效果好于15min;（2）用9%EH激活处理10min后,再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）培养处理3～4h的卵母细胞分裂率及囊胚率分别为82.86%和22.86%,显着高于再用10μg/mL放线菌酮（CHX）+10mmol/L SrCL2(Sr2+)、10 mmol/L Sr2++2μmol/L 6-DMAP、10μ/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10μg/mL CHX+2μmol/L 6-DMAP+10 mmol/L Sr2+培养处理3～4h的卵母细胞。（3）比较几种激活方法（5μmol/L Ion激活处理5min,9%乙醇激活处理10min,50 v/mm和50μs的电脉冲2次）的猪卵母细胞孤雌激活效果发现,离子霉素（Ion）的猪卵母细胞孤雌激活效果最好,囊胚率达到37.50%。（4）卵母细胞周围的卵丘细胞层数对其成熟后的孤雌发育有显着影响,4～6层和6层以上卵丘-卵母细胞复合体成熟后的孤雌激活分裂率（68.99%和75.36%）和囊胚率（32.56%和37.68%）显着高于其它组（p＜0.05）。4.对猪卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和睾丸间质细胞的分离和传代培养进行了系统研究。结果发现,猪卵丘细胞单层的生长需要5～6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。酶消化法和钢网过滤筛选法可获得猪睾丸间质细胞,猪睾丸间质细胞单层生长需要3～5d。猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后,复苏率为68.36%。通过培养和观察,猪胎儿成纤维细胞的生长形成有规则的生长曲线。5.对猪体细胞核移植的方法及影响因素进行了探索。（1）猪卵母细胞体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后,分别进行去核构建重构胚,结果发现,成熟44h和48h的卵母细胞核移植后的融合率（58.99%和56.51%）、卵裂率（67.52%和65.73%）和囊胚率（22.78%和15.96%）较高,其中卵龄为44h的分裂率与囊胚率显着高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞（P＜0.05）。卵龄为48h的融合率高于卵龄为52h的卵母细胞（P＜0.05）。（2）盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系统去核法的去核率分别为76.33%,100.00%,98.40%,前者低于后两者（P＜0.05）;三种去核方法去核的卵母细胞核移植后,分裂率以Hoechest染色法较低（P＜0.05）,但融合率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同注核方法（细胞质内注射法和透明带下注射法）的核移植效果研究结果显示,细胞质内注射和透明带下注射法的分裂率为（68.13%和60.37%）与囊胚率（6.44%和8.08%）差异均不显着（P＞0.05）。6.探讨了供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响。（1）比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现,胎儿成纤维细胞的融合率（64.74%）高于颗粒细胞（51.05%）和卵丘细胞（56.89%）,但三种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（2）不同代数的胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现,6～9代的融合率显着高于3～5代和＞10代的成纤维细胞（P＞0.05）,但卵裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同性别猪胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现:雄性胎儿成纤维细胞核移植的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞相比差异不显着（P＞0.05）,但囊胚率显着低于雌性胎儿成纤维细胞（P＜0.05）。（4）100%长满汇合的胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70～80%汇合的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,但囊胚率差异不显着。（5）猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后的核移植分裂率和囊胚率均显着低于新鲜和4℃冷藏的细胞（P＜0.05）,虽然融合率无显着差异（P＞0.05）,表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植。（6）表面光滑的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率均显着高于表面粗糙的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率（P＜0.05）,虽然融合率差异不显着（P＞0.05）。（7）直径＜15μm的供体细胞核移植后的融合率显着低于直径＞30μm的供体细胞（P＜0.05）,直径20～3μm供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率（63.73%和21.54%）较高。（8）组织块法和酶消化法分离得到的供体细胞所构建的重构胚在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显着差异（P＞0.05）。
丁向彬[6]（2008）在《牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究》文中认为体细胞核移植的成功说明了高度分化的细胞仍具有支持发育的全能性,卵母细胞胞质中存在着将分化体细胞重编程至多能胚胎细胞状态的全部因子。但是,体细胞核移植的成功率却非常低,而且克隆动物存在不同程度的发育缺陷。目前普遍认为,体细胞核移植的低成功率以及发育异常和供体细胞核的不完全表观遗传重编程有关。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是哺乳动物主要的表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段,在胚胎的正常发育过程中具有显着的调控作用。本文对牛体外受精（IVF）胚胎和体细胞核移植（SCNT）胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行分析,找出体细胞克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异,研究表观遗传状态对克隆胚体外发育能力的影响。1.研究卵母细胞成熟培养液中添加表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对其体外发育的影响,精子的不同处理方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响以及细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30 ng/mL EGF可以显着提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率;精子经上浮法处理后可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞共培养可以显着提高受精后的囊胚发育率,可以用于牛IVF胚胎的体外培养。2.探讨了不同激活方法对牛核移植胚胎激活效果和体外发育的影响,以及细胞共培养体系对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,5μmol/L离子霉素联合2mmol/L 6-DMAP激活牛核移植胚胎的效果比较好,可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞饲养层共培养可以显着提高重构胚的囊胚发育率,比较适合作为体细胞核移植胚胎发育的共培养体系。3.采用免疫荧光染色技术,对牛IVF胚胎和SCNT胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行检测,研究克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异。结果表明,克隆胚胎各个发育阶段DNA甲基化水平均高于体外受精胚胎,其中2-细胞到桑椹胚阶段甲基化水平显着高于IVF胚胎,从头甲基化时间提前;克隆胚胎4-细胞到囊胚阶段乙酰化水平低于体外受精胚胎,其中8-细胞阶段乙酰化水平显着低于体外受精胚胎。与体外受精胚胎相比,牛核移植胚胎附植前各阶段存在异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式。4.用DNA甲基化酶抑制剂（5-aza-dC）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨DNA甲基化水平变化与克隆胚胎体外发育之间的关系。结果表明,低浓度的5-aza-dC（20nM,72h）处理供体细胞或者重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对克隆胚的表观遗传状态没有明显影响;而供体细胞和重构胚均用低浓度5-aza-dC（20nM,72h）处理可以显着提高囊胚发育率和囊胚细胞数,2-细胞阶段DNA甲基化水平降低,8-细胞阶段的DNA甲基化水平显着降低且与IVF胚胎相比差异不再显着,但组蛋白乙酰化水平没有明显改变。说明克隆胚胎DNA甲基化水平影响其体外发育,降低2-细胞和8-细胞阶段的DNA甲基化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。5.用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨组蛋白乙酰化变化与克隆胚胎体外发育的关系。结果表明,供体细胞经50nM TSA处理12h可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,而且2-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平升高;TSA处理重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对重构胚的表观遗传状态没有显着影响;供体细胞和重构胚均用低浓度TSA（50nM,12h）处理可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,8-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平显着增加且与IVF胚胎相比差异不再显着,但TSA处理对DNA甲基化水平没有明显影响。说明克隆胚胎组蛋白乙酰化水平影响其体外发育,增加2-细胞和8-细胞阶段组蛋白乙酰化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。6.联合应用5-aza-dC和TSA处理牛供体细胞和重构胚,研究两种试剂联合处理对重构胚发育的影响,以及对重构胚甲基化水平和乙酰化水平的影响。结果表明,5-aza-dC（20nM, 72h）联合TSA（50nM, 12h）处理供体细胞和重构胚可以更明显的提高克隆胚胎的体外发育能力,联合处理不但显着降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且显着增加了组蛋白的乙酰化水平,从而使克隆胚附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近与体外受精胚胎。说明异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式不利于克隆胚的体外发育,消除这种异常可以提高克隆胚的体外发育能力。进一步的实验表明,5-aza-dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。
黄伟伟[7]（2007）在《牛体细胞核移植的研究》文中认为本研究以牛卵母细胞为材料,体外成熟培养牛卵母细胞,同时分离牛耳皮肤成纤维细胞和颗粒细胞为供核细胞,对牛卵母细胞体外成熟培养和核移植的影响因素进行了探讨,优化了牛体细胞核移植技术方案,为进一步进行转基因牛和分离牛ntESCs的研究奠定了基础。实验主要结果如下:1.供核细胞的准备从两头荷斯坦奶牛采取耳组织块,采用组织块法分离得2株成纤维细胞株BEF422和BEF274,并取第13代BFF422进行核型分析,核型正常（2n=60,XX）,证明细胞在传代培养过程中染色体数目未发生异常。可以作为供核细胞使用。利用成熟后的COCs的颗粒细胞,可以简单快速的分离得到颗粒细胞。2.牛卵母细胞体外成熟培养体系的建立从屠宰场采集牛卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:⑴在基础培养液(TCM-199+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/L HEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mL ITS+0.1 IU/mL hMG+1μg/mL E2+10 ng/mL EGF中分别添加FBS, NBS, BSA和PVA四种血清或血清替代物,其中添加10mg/ml BSA和10%FBS的成熟率无显着差异,但均显着高于10%NBS和1.0%PVA（P < 0.05）;激活后,添加10mg/ml BSA的分裂率显着高于其他三组（P < 0.05）, 10%FBS与1.0%PVA之间差异不显着,10%NBS分裂率最低。囊胚率1.0%PVA显着高于其他组,10mg/ml BSA和10%FBS之间囊胚率差异不显着,10%NBS囊胚率最低。表明添加10mg/ml BSA和10%FBS对牛卵母细胞成熟率和激活后胚胎发育率差异不大,二者可以相互代替用于牛卵母细胞体外成熟。⑵在无血清体外成熟培养体系中添加50μg/ml的尿嘧啶能提高牛卵母细胞的成熟率和囊胚率,与添加0,100,150μg/ml时的牛卵母细胞成熟率间存在差异显着（P < 0.05）,表明在成熟培养液中添加50μg/ml的尿嘧啶,既能促进牛卵母细胞的体外成熟,又能提高牛孤雌胚囊胚发育率。⑶在无血清体外成熟培养体系中添加不同浓度的ATP均不能提高牛卵母细胞的成熟率,但添加500,750μg/ml的ATP能提高牛卵母细胞激活后的囊胚发育率,与添加0,250μg/ml组相比存在差异显着（P <0.05）, 500,750μg/ml组间差异不显着（P >0.05）,但以添加500μg/ml时的囊胚发育率最高。表明在成熟培养液中添加ATP不能促进牛卵母细胞的体外成熟,但能提高牛孤雌胚囊胚发育率,尤其是添加500μg/mlATP的效果最佳。因此,使用TCM-199+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/L HEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mL ITS+0.1 IU/mL hMG+1μg/mL E2+10 ng/mL EGF+10mg/ml BSA+50μg/ml尿嘧啶的无血清体外成熟培养体系比较有利于牛卵母细胞体外成熟和激活后胚胎发育。3.牛体细胞核移植⑴比较不同融合方案对牛重构胚融合及胚胎发育的影响。方案③（1.9KV/cm,10μs,一次电脉冲）的融合率（70.05%vs 59.48%,59.24%,33.07%, P <0.05）和激活后囊胚率（37.6%vs 20.24%,32.53%,18.92%, P <0.05）显着高于其他三组,表明方案③的融合效果最好,并能够促进重构胚的发育,提高囊胚率。⑵筛选最佳融合电压和脉冲时间。以方案③为基础方案,对融合电压和脉冲时间进行优化。结果显示1.9KV/cm的融合率,分裂率,囊胚率均高于1.8KV/cm和2.0 KV/cm组（P < 0.05）;10μs和15μs组之间的融合率,分裂率及囊胚率均高于20μs组（P < 0.05）,但二者之间差异不显着（P>0.05）,15μs囊胚率稍高于10μs。表明1.9KV/cm和15μs是较为适宜的融合电压和脉冲时间。⑶筛选最佳激活方法。离子酶素+6-DMAP的分裂率（91.6%vs 88.04%,87.5%,89.91%, P <0.05）和囊胚率（37.61%vs 34.93%,26.37%,32.65%, P <0.05）显着高于其他三组,表明离子酶素+6-DMAP能显着提高牛重构胚地发育率,是一种良好的激活方法。⑷筛选最佳激活时间。重构胚经电融合后间隔3h激活的分裂率（90.75% vs 83.51%,86.27%, P <0.05）和囊胚率（32.41% vs 27.28%vs16.05%, P <0.05）显着高于间隔1h和2h,表明延迟3h激活对牛重构胚体外发育有利。⑸筛选最佳重构胚培养体系。牛重构胚在序贯培养液G-1/G-2中分裂率（90.91%vs85.95%vs73.50%,P<0.05）和囊胚发育率（36.67%vs 27.88%vs18.60%,P<0.05）要显着高与SOFaa和CR1aa,而CR1aa培养液也也显着高与SOFaa,表明在三种胚胎培养液中序贯培养液G-1/G-2能更好的支持牛重构胚的发育。⑹共培养效果比较。牛重构胚在序贯培养液G-1/G-2和牛颗粒细胞共培养体系中无论是分裂率,还是囊胚率均显着高于单独使用G-1/G-2序贯培养液（P<0.05）。表明在与牛颗粒细胞共培养条件下,G-1/G-2序贯培养液才能更好的支持牛重构胚的发育。⑺不同供核细胞对牛体细胞核移植的影响。三种牛体细胞（颗粒细胞、成年成纤维细胞BEF422和BEF274）中,颗粒细胞的融合率（70.35%）,分裂率（94.07%）和囊胚率（40.94%）均显着高于成年成纤维细胞BEF422和BEF274 （P<0.05）。不同个体来源的成年成纤维细胞BEF422和BEF274之间融合率和分裂率无显着差异（P>0.05）,但BEF422的囊胚率显着高于BEF274（P<0.05）。表明颗粒细胞重构胚发育率要高于成年成纤维细胞,而不同个体来源的成年成纤维细胞重构胚发育率也有差异。⑻不同代数供核细胞对牛体细胞核移植的影响。BEF422的P20～21的融合率低于P6～7细胞（68.02% vs 73.72%）,但是分裂率（92.86%）和囊胚率（38.46%）显着高于P6～7细胞（P<0.05）。表明高代数的细胞作供核的核移植效率高于低代数的细胞。⑼不同品种受体对牛体细胞重构胚妊娠率的影响。进行了23次胚胎移植试验,214枚重构桑椹胚或早期囊胚移植给43头自然发情7d的受体牛,其中荷斯坦奶牛32头,秦川牛11头。移植75d后直检34头,7头妊娠,妊娠率20.59%。荷斯坦奶牛细胞重构胚移植的荷斯坦奶牛和秦川牛受体中,妊娠率无显着差异（P>0.05）。表明胚胎移植受体的品种差异对牛核移植胚胎的妊娠率影响不大。
杨丽[8]（2007）在《山羊—绵羊异质体细胞克隆胚的构建及线粒体DNA的杂合性分析》文中研究指明本试验研究了山羊-绵羊异质体细胞克隆胚（以山羊胎儿成纤维细胞为核供体,以体外培养成熟的绵羊卵母细胞为核受体）的构建过程中促卵泡素（FSH）和发情牛血清（ECS）对绵羊卵母细胞体外成熟的影响以及电融合参数的确定;此外,在异质克隆胚早期发育的不同阶段（1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚）,采用PCR-限制性片段长度多态性法（PCR-RFLP）对线粒体DNA的来源及组成比例进行了研究。所得试验结果如下:1. FSH的浓度为0.2 IU/mL时,绵羊卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均高于对照组和其他实验组,分别为72.5 %和77.3 %,与对照组（不添加FSH）和其他实验组之间差异显着（ P < 0. 05）,且试验组与对照组之间均存在显着差异（ P < 0. 05）。该结果表明FSH在绵羊卵母细胞体外成熟过程中起着显着的促进作用,且FSH在卵母细胞体外成熟过程中的作用于其浓度成剂量依赖关系。2.在FSH浓度为0.2 IU/mL的基础上,添加10 %的发情第一天（D1）和第三天（D3）ECS时,绵羊卵母细胞的成熟率和卵裂率较高（分别为D1:79.1 %和76.5 %;D3:75.8 %和74.4 % ）,与对照组和发情第五天（D5）、第七天（D7）ECS组相比差异显着（ P < 0. 05）;实验天数范围内,添加5 %的D7的ECS的囊胚率最高,为44.4 %,与对照组和D1差异显着（ P < 0. 05）,但与D3和D5之间差异不显着（ P > 0. 05）。该结果表明,随着发情的发展,ECS在卵母细胞成熟和卵裂方面的促进作用有降低的趋势,而在囊胚形成方面的促进作用有增强的趋势。进一步研究表明,添加ECS浓度为10 %和15 %时,绵羊卵母细胞的成熟率和卵裂率无显着差异（ P > 0. 05）。3.在1次脉冲,脉冲时程20μs的条件下,电场强度为1.2 kv/cm和1.4 kv/cm时,重构胚的融合率、卵裂率及囊胚率之间无显着差异（P>0.05）;电场强度为1.2 kv/cm （58.82 %）和1.4 kv/cm （ 61.36 %）时的融合率虽然显着低于电场强度为1.6 kv/cm（73.68 %）和1.8 kv/cm （ 80.61 %）时（P<0.05）,但其卵裂率（1.2 kv/cm时为68.33 %,1.4 kv/cm时为72.22 %）却显着高于后两者（1.6 kv/cm时为47.14 %,1.8 kv/cm时为31.65 %）（P<0.05）,且囊胚率也略高。因此,对山羊-绵羊重组卵的理想电场强度为1.2 kv/cm 1.4 kv/cm。4.电脉冲强度为1.4 kv/cm,脉冲时程为20μs/次时,2次电脉冲（间隔1 s）的融合率和卵裂率均高于1次和3次电脉冲（间隔1 s）,且其囊胚发育率也略高,表明试验范围内2次电脉冲的效果较好。融合后将重构胚在成熟液中平衡60120 min都有利于卵裂,平衡90 min时,囊胚发育率可达到17.72 %。5.采用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymer -phism, PCR-RFLP）的方法分析以山羊（Capra hircus）胎儿成纤维细胞为核供体,以去核的绵羊（Ovis aries L）MⅡ期卵母细胞为核受体构建的异质克隆胚中线粒体的来源及组成比例。结果表明,8-细胞之前的异质克隆胚中供受体mtDNA的比例变化不大,1-细胞、2-细胞、4-细胞和8-细胞异质克隆胚中核供体细胞mtDNA占受体细胞mtDNA的比例分别为（2.5±0.8）%、（2.8±0.6）%、（1.9±0.4）%和（1.7±0.6）%,彼此之间差异不显着（P>0.05）;但异质克隆囊胚中核供体细胞mtDNA的比例下降为（0.3±0.1）%,与前四者相比差异显着（P<0.05）。据此,我们提出了一种核供体来源的线粒体选择性降解的机制,即由于核供体来源的线粒体生物学功能受到抑制,从而导致其退化并被选择性地降解。
赛务加甫[9]（2007）在《提高绵羊体细胞核移植效率的研究》文中研究指明本研究对绵羊卵母细胞体外成熟、卵母细胞冷冻保存、卵母细胞孤雌激活、绵羊同种和异种体细胞核移植及重构胚胎体外培养等关键技术进行了试验分析,以期提高绵羊体细胞核移植的效率,建立完善的核移植技术体系,为进一步获得体细胞克隆绵羊和异种克隆个体提供技术支撑。本研究内容包括以下几个方面:（1）在绵羊卵母细胞成熟培养液中添加孕酮等某些影响体外成熟的成份,确定绵羊卵母细胞的最佳成熟方案。（2）并通过对比不同冷冻保护剂对卵母细胞的冷冻保存效果,为核移植操作批量提供成熟的卵母细胞。（3）采用胞质注射法,建立精子提取物激活卵母细胞的方法,并且与离子霉素结合6-DMAP激活法和电激活法进行了比较,筛选出适宜激活方法。（4）体外分离培养得到道赛特绵羊和莎能奶山羊的耳皮肤成纤维样细胞,对绵羊皮肤成纤维细胞的生物学特性和不同细胞因子对其生长增殖的影响进行了研究,并对绵羊成纤维细胞和山羊成纤维细胞分别进行体外传代及冻存,为绵羊体细胞核移植和绵羊-山羊种间核移植试验提供了供体细胞。（5）绵羊孤雌激活胚、绵羊重构胚和绵羊-山羊种间重构胚分别置于不同的培养系统中培养,优化绵羊胚胎体外体系,增加胚胎的体外发育潜力。主要研究结果如下:1.绵羊卵母细胞体外成熟基础液中分别添加5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%发情牛血清（OCS）、5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%胎牛血清（FBS）、0.075 IU/mL HMG+OCS和0.075 IU/mL HMG+10% FBS,结果表明成熟液中添加OCS更有利于卵母细胞的成熟;添加5%～10%的BFF能够提高卵母细胞的成熟率,但20%BFF卵母细胞的体外成熟率下降;培养液中分别添加0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和2.0μg/mL孕酮,结果表明孕酮的最适添加剂量为0.5μg/mL。结果表明绵羊卵母细胞的体外成熟培养液组成为M199+10 mmol/L Hepes+0.38 mmol/L丙酮酸钠+ 25 mmol/L谷氨酰胺+1μg/mL 17β雌二醇（17β-E2）+5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%OCS+0.5μg/mL孕酮时其体外成熟培养效果最好。2.采用程序冷冻法对处于不同发育时期的绵羊卵母细胞进行冷冻保存,冷冻液Ⅰ～冷冻液Ⅳ对同一时期卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率、卵裂率和桑囊胚发育率均无显着影响,而冷冻液Ⅳ体外成熟24 h冷冻解冻后的卵母细胞发育率显着高于GV期和体外成熟10 h的卵母细胞,说明用乙二醇（EG）作为冷冻保护剂,添加0.1 mol/L海藻糖较合适对成熟培养24 h的绵羊卵母细胞进行冷冻保存;-6.5℃植冰时冷冻卵母细胞囊胚发育率显着高于其他组。采用玻璃化冷冻方法对绵羊GV期到体外成熟培养24 h卵母细胞进行冷冻保存试验证实,以玻璃化冷冻液Ⅱ作为冷冻剂,体外成熟培养24 h卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率最好,不经过成熟培养的卵母细胞玻璃化冷冻效果最差,认为添加0.1 mol/ L海藻糖来进行卵母细胞的玻璃化冷冻可以起到保护作用,卵母细胞冷冻解冻后可以用作受体胞质进行核移植,重构胚的发育能力受冷冻处理的影响不显着。3.对绵羊卵母细胞以连续3次120 v/mm的直流脉冲进行电激活获得最佳激活效果,囊胚发育率显着高于脉冲1次和2次（P<0.05）;用分别注射不同剂量的精子提取物,对绵羊卵母细胞进行孤雌激活,结果表明最佳注射剂量为向每个卵母细胞注入精子提取物3 pL;分别用电激活法,离子霉素联合6-DMAP法和精子提取物胞质内注射法对绵羊卵母细胞进行激活,结果表明电脉冲的激活效果显着低于后二者的效果,且差异显着,精子提取物和离子霉素联合6-DMAP法的囊胚率差异不显着,均可以用于绵羊卵母细胞的激活。4.高糖DMEM较适宜于绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养和继代培养。以DMEM+50% NCS（new - born calf serum）,添加10% DMSO为冻存保护剂,进行冷冻保存的无角道赛特绵羊皮肤成纤维细胞,解冻细胞经体外56次传代培养,细胞形态维持在初始状况,保持了良好的遗传特性;添加EGF和胰岛素对绵羊皮肤成纤维细胞的生长均有促生长作用。5.卵母细胞体外成熟培养时间分别为1517 h、1921 h与2325 h时,随着培养时间的增加成熟率也增加,卵母细胞去核成功率随着成熟时间的延长而下降,试验认为卵母细胞体外成熟1921 h,既可以保证高的去核成功率,又可以保证卵母细胞较高的成功率,有利于提供充足的卵源;不经血清饥饿处理的供体细胞采用胞质注射法构建克隆胚,其胚胎发育率略高于血清饥饿处理组,但差异不显着。试验认为体外成熟培养1921 h的卵母细胞可以作为核移植受体细胞,未经血清饥饿处理的成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,可以获得较高的重构胚胎发育率。6.采用胞质内注射法构建绵羊皮肤纤维细胞重组胚,胚胎经离子霉素联合6-DMAP激活后,其细胞融合率、卵裂率和囊胚发育率均高于电融合法,同时结果表明重构胚用离子霉素联合6-DMAP或精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率相近,其中精子提取物的激活效果优于离子霉素激活法;激活间隔时间研究结果证实,卵母细胞注核后经体外培养3～4 h后再激活,可以获得较高的激活率。7.用冷冻的山羊成纤维细胞可以成功构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,种间体细胞核移植胚能够进行正常的早期发育,种间重构胚经离子霉素联合6-DMAP或者胞质注射精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率差异不显着（P>0.05）;用电脉冲融合法构建异种核移植胚胎时,其融合率、卵裂率和囊胚发育率均低于胞质注射法;不同山羊供体细胞进行山羊-绵羊异种核移植胚胎构建时,血清饥饿处理与否对种间核移植囊胚率无显着影响,表明山羊皮肤成纤维细胞可以不经过血清饥饿处理直接进行核移植。8.联合使用培养液能改善绵羊同种和异种重构胚的发育。即使用CR1aa+BSA培养重构胚3 d,再用SOFaa+5%FBS继续培养,获得的重构胚囊胚发育率较高。在胚胎培养液中添加孕酮可在一定程度上提高重构胚的卵裂率和囊胚率。其中以2.0和4.0μg/mL孕酮组的囊胚率最高,与对照组和其他孕酮浓度组差异显着。发现共培养体系对绵羊同种核移植重构胚的发育有显着的影响,而且在3 d更换1次新的饲养细胞单层对重构胚的发育有明显的促进作用。
华松[10]（2007）在《体细胞核移植及线粒体命运的研究》文中研究说明体细胞核移植突破了物种之间的“生殖隔离”限制,涉及物种之间在分子、细胞和生理水平上的相互作用。因此,该技术为研究核质互作的规律和特征及拯救濒危动物提供了新的途径。同时异种体细胞核移植也许是再现某些已经灭绝动物的唯一途径。但是由于卵母细胞核外遗传物质即线粒体DNA常被带入核移植胚中,使得目前的“克隆”并非真正意义上的“克隆”,实际上是一种带有供体和受体两种细胞mtDNA的异质体。因此为了提高体细胞核移植效率,同时也为得到完全意义上的克隆动物,我们重点研究了线粒体移植对牛体外胚胎发育的影响及体细胞核移植过程中线粒体的变化。1.制备牛和绵羊mtDNA实时荧光定量PCR标准品。用Primer 5.0软件设计牛和绵羊mtDNA荧光定量PCR特异性引物,将牛、绵羊卵母细胞直接裂解后作为PCR模板,PCR扩增目的片段后连接到pMD18-T载体上,用大肠杆菌DH5-α增值。最后对提取的质粒进行纯化,再分别按照梯度稀释进行荧光定量PCR。结果表明构建的牛、绵羊mtDNA定量PCR标准曲线分别跨越100～106和100～105数量级,两种标准曲线的线性关系良好。2.确定牛卵母细胞内线粒体的量与卵母细胞质量及随后胚胎发育之间的关系。根据颗粒-卵母细胞复合体表面特征将卵母细胞分为好和差两类。采用定量PCR的方法对卵母细胞内线粒体DNA进行检测,同时进行孤雌激活观察各类胚胎的发育。结果表明1)质量好的卵母细胞平均mtDNA拷贝数极显着高于差卵母细胞组;2)卵裂了的好卵母细胞mtDNA平均拷贝数极显着高于卵裂了的差卵母细胞组;3)未卵裂的好卵母细胞mtDNA平均拷贝数极显着高于未卵裂的差卵母细胞组;4)好卵母细胞组中,卵裂了的卵母细胞mtDNA平均拷贝数极显着高于未卵裂的卵母细胞组。同时好卵母细胞48 h内卵裂率和第8 d的囊胚形成率及囊胚细胞数极显着高于差卵母细胞组。因此质量好的卵母细胞与差卵母细胞相比,前者含有更多的mtDNA,并且卵母细胞内mtDNA的量与卵母细胞的质量和随后胚胎的发育成正相关。3.研究颗粒细胞线粒体移植对牛体外胚胎发育的影响。采用分步离心法从颗粒细胞中提取线粒体,并分别注射到孤雌激活和ICSI胚内。结果表明无论是胞质内注射还是孤雌激活,注射了线粒体的差卵母细胞组在桑葚胚率、囊胚率及孵化囊胚率上与好卵母细胞组相比较,在统计学上无显着差异,但是显着高于未注射线粒体的差卵母细胞组;同样在囊胚细胞数上,好卵母细胞组和注射了线粒体的差卵母细胞组在统计学上无显着差异,但是他们都显着高于未注射线粒体的差卵母细胞组。因此,卵母细胞内线粒体的含量对于牛胚胎的早期发育非常重要,并且线粒体移植可以改善着床前胚胎的发育潜力。4.研究同种体细胞核移植胚内线粒体的变化。用线粒体特异性荧光探针对颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和成年成纤维细胞内线粒体进行标记,再与去核的牛卵母细胞构建成胚胎,同时以未标记的供体细胞所构建的重组胚为对照。结果表明1)由颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和成年成纤维细胞构建的重构胚在发育潜能上无差异;2)线粒体特异性荧光探针对重组胚的发育无影响;3)在16-细胞期前,各组能激发荧光的胚胎比率在统计学上无显着差异,而从桑葚胚开始,由颗粒细胞而来的胚胎能激发出荧光的比率要显着低于其他两类供体细胞构成的胚胎。说明核移植胚胎的发育潜能与供体细胞的类型无关,而颗粒细胞内线粒体在重组胚中被整合的效率要高于相应的胎儿成纤维细胞和成年成纤维细胞。5.构建牛-绵羊异种体细胞核移植胚。以牛卵母细胞为胞质受体,以绵羊胎儿成纤维细胞为供体细胞构建异种重构胚,并且对重构胚胎的染色体构成、胚胎形态及囊胚细胞进行了观察和分析。结果表明1)绵羊胎儿成纤维细胞在牛卵母细胞胞质的作用下能够去分化,构建的重构胚胎能够发育到囊胚阶段;2)66%的重构胚胎具有体细胞同样数目的染色体;3)重构胚胎的囊胚细胞数可以与绵羊孤雌激活胚胎的相比。说明绵羊胎儿成纤维细胞核能在去核的牛卵母细胞内进行去分化,并且构建的重构胚胎在核行和表型上比较正常。6.研究牛-绵羊异种体细胞核移植胚中线粒体的分配。采用荧光定量PCR的方式对牛-绵羊异种体细胞核移植早期胚胎及胚胎卵裂球中的mtDNA进行了定量分析。结果表明,从1-cell阶段到8-cell阶段,供体细胞mtDNA占受体胞质mtDNA的1%,而在16-cell阶段和囊胚阶段分别为0.6%和0.1%。说明随着异种重构胚的发育,两种来源的线粒体无论是在同一卵裂球内还是在同一胚胎内都是非均匀分配的。
二、哺乳动物细胞核移植(克隆)研究进展(下)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、哺乳动物细胞核移植(克隆)研究进展(下)（论文提纲范文）
（1）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
（2）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）LncRNA参与调控山羊合子基因组激活期核移植胚胎重编程的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 LncRNA调控早期胚胎发育的研究进展 |
| 1 LncRNA的特性 |
| 1.1 LncRNA的表达特性 |
| 1.2 LncRNA开放阅读框的长度 |
| 1.3 LncRNA的编码潜能 |
| 2 染色质相关lncRNA的作用方式 |
| 2.1 作为引导分子 |
| 2.2 作为支架平台 |
| 2.3 作为变构调节物 |
| 2.4 作为诱导分子 |
| 2.5 结合RNAP Ⅱ |
| 3 LncRNA与早期胚胎发育 |
| 3.1 卵母细胞成熟 |
| 3.2 精子发生 |
| 3.3 胚胎发育 |
| 3.4 胚胎干细胞多能性 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 哺乳动物合子基因组激活的调控 |
| 1 DNA甲基化 |
| 1.1 DNA甲基化 |
| 1.2 DNA羟甲基化 |
| 1.3 印记基因甲基化 |
| 2 组蛋白甲基化 |
| 2.1 H3K4甲基化 |
| 2.2 H3K9甲基化 |
| 2.3 H3K27甲基化 |
| 3 非编码RNA |
| 3.1 SncRNA |
| 3.2 LncRNA |
| 4 转录因子 |
| 4.1 调控转录必须转录物 |
| 4.2 调节染色质可塑性 |
| 4.3 调控母源物质降解和合子基因转录 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 影响体细胞核移植重编程的因素 |
| 1 供体细胞 |
| 1.1 细胞类型 |
| 1.2 细胞周期 |
| 1.3 细胞分化状态 |
| 2 DNA甲基化 |
| 2.1 DNA甲基化转移酶 |
| 2.2 DNA去甲基化 |
| 3 组蛋白乙酰化 |
| 3.1 TSA |
| 3.2 Scriptaid |
| 3.3 Oxamflatin和SAHA |
| 4 组蛋白甲基化 |
| 4.1 H3K4甲基化 |
| 4.2 H3K9甲基化 |
| 4.3 H3K27甲基化 |
| 4.4 H3K36甲基化 |
| 4.5 H3K79甲基化 |
| 5 非编码RNA |
| 5.1 miRNA |
| 5.2 LncRNA |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第四章 山羊ZGA期差异表达mRNA和lncRNA的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器用品 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊ZGA期的确定 |
| 2.2 山羊ZGA期mRNA的表达特性 |
| 2.3 差异表达mRNA的验证 |
| 2.4 山羊ZGA期lncRNA的表达变化 |
| 2.5 新lncRNA表达水平的验证 |
| 2.6 功能性lncRNA的筛选 |
| 2.7 干扰lnc_137对山羊胚胎体外发育能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 山羊ZGA期核移植胚胎差异表达mRNA的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器用品 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊核移植胚胎ZGA的状态 |
| 2.2 组蛋白甲基化相关基因的表达水平 |
| 2.3 山羊核移植胚胎H3K4me3的表达水平 |
| 2.4 Kdm5b蛋白保守性分析 |
| 2.5 Kdm5b对山羊核移植胚胎体外发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 LncRNA调控山羊核移植胚胎重编程的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器用品 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊ZGA期核移植胚胎lncRNA的表达特性 |
| 2.2 功能性lncRNA的筛选 |
| 2.3 功能性lncRNA的验证 |
| 2.4 干扰lnc_3712对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 2.5 干扰lnc_3712影响核移植胚胎发育的机制 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 核移植胚胎及克隆山羊Xist启动子甲基化状态的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器用品 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊Xist启动子序列分析 |
| 2.2 Xist DMR区域的验证 |
| 2.3 核移植胚胎ZGA期Xist甲基化状态 |
| 2.4 克隆山羊耳组织中Xist甲基化状态 |
| 2.5 死亡克隆山羊肺脏中Xist甲基化状态 |
| 2.6 死亡克隆山羊脑组织中Xist甲基化状态 |
| 2.7 Xist及X染色体相关基因表达变化 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的内容 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）梅花鹿体细胞克隆胚胎构建及Ercc6l基因表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 哺乳动物体细胞核移植的研究进展 |
| 1.1 细胞核移植技术的研究概况 |
| 1.2 哺乳动物体细胞核移植方法 |
| 1.3 核供体细胞类型研究 |
| 1.4 卵母细胞去核方法 |
| 1.5 体细胞核移植的意义和趋势 |
| 第2章 体细胞核移植的影响因素和存在的问题 |
| 2.1 体细胞核移植的影响因素 |
| 2.2 体细胞核移植技术当前面临的问题 |
| 第3章 如何提高体细胞核移植的克隆效率 |
| 3.1 克隆动物的异常表现 |
| 3.2 提高克隆效率的研究 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 梅花鹿卵母细胞体外成熟培养体系的优化 |
| 1.1 材料试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 梅花鹿卵母细胞的孤雌激活 |
| 2.1 材料试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 TSA 处理对梅花鹿克隆胚胎发育的影响 |
| 3.1 材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 秋水酰胺和秋水仙素诱导化学性辅助去核构建梅花鹿克隆胚胎 |
| 4.1 材料试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 发育相关Ercc6l基因的分子克隆和检测不同发育时期的表达 |
| 5.1 材料试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）猪体细胞核移植相关技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植技术研究进展 |
| 1.核移植研究历史回顾 |
| 2.核移植技术程序 |
| 3.核移植胚胎的发育机理 |
| 4.影响核移植效果的因素 |
| 5.不同动物的核移植发展现状 |
| 6.核移植技术当前面临的问题 |
| 7.体细胞核移植的发展前景 |
| 8.核移植技术所生产的转基因食品安全性 |
| 9.体细胞核移植技术展望 |
| 10.结束语 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第二章 猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪卵母细胞体外成熟培养体系建立与优化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 激活方法对猪卵母细胞孤雌发育的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 猪核移植供体细胞分离与传代培养 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第六章 猪体细胞核移植方法的摸索 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第七章 供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写—中文对照表 |
| 图片与说明 |
| 个人简历 |
| 文献发表情况 |
| 致谢 |
（6）牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳动物卵母细胞体外成熟与体外受精的研究进展 |
| 1.1 卵泡卵母细胞体外成熟 |
| 1.1.1 卵母细胞成熟的机理 |
| 1.1.2 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.1.3 卵母细胞成熟的判断 |
| 1.1.4 卵母细胞的获取与分级 |
| 1.1.5 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 精子的体外获能与体外受精 |
| 1.2.1 受精作用机制 |
| 1.2.2 精子体外获能 |
| 1.2.3 体外受精 |
| 1.2.4 体外受精的影响因素 |
| 1.3 受精卵的体外培养 |
| 1.3.1 受精卵体外发育阻断 |
| 1.3.2 受精卵体外培养系统 |
| 1.3.3 影响体外受精卵体外发育的因素 |
| 1.4 小结与展望 |
| 第二章 哺乳动物细胞核移植的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 2.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 2.3 哺乳动物异种细胞核移植研究进展 |
| 2.4 哺乳动物细胞核移植的方法和程序 |
| 2.4.1 受体细胞的选择与去核 |
| 2.4.2 供体细胞的选择 |
| 2.4.3 细胞核的移植 |
| 2.4.4 重组胚的激活 |
| 2.4.5 重构胚的培养 |
| 2.5 哺乳动物核移植相关机理的研究进展 |
| 2.5.1 MPF 与核移植的关系 |
| 2.5.2 体细胞供体核的表观遗传重编程 |
| 2.6 影响哺乳动物核移植成功率的因素 |
| 2.6.1 核受体胞质对核移植的影响 |
| 2.6.2 核供体对核移植的影响 |
| 2.6.3 融合-激活方案对核移植的影响 |
| 2.6.4 核移植胚胎的体外培养对发育的影响 |
| 2.7 细胞核移植技术存在的问题和应用前景 |
| 2.7.1 细胞核移植技术存在的问题 |
| 2.7.2 细胞核移植技术的应用前景 |
| 第三章 牛卵泡卵母细胞体外受精的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 成熟液中添加EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.2.2 不同精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.2.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.3.2 精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.3.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 激活方法和共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.2.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 牛体细胞克隆胚胎DNA 甲基化和组蛋白乙酰化分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 抗5－甲基胞嘧啶抗体和抗组蛋白H3(acetyl K18)抗体特异性检测 |
| 5.2.2 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核DNA 甲基化水平比较 |
| 5.2.3 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核组蛋白乙酰化水平比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 DNA 甲基转移酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 5-aza-dC 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.2 5-aza-dC 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.3 体细胞和重构胚均用5-aza-dC处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 组蛋白脱乙酰化酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 TSA 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.2 TSA 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.3 体细胞和重构胚均用TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 5-aza-dC 联合 TSA 对牛核移植胚胎体外发育 及其表观遗传状态的影响 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 5-aza-dC＋TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 8.2.2 不同个体来源成纤维细胞作核供体，供体细胞和重构胚均用5-aza-dC＋TSA 处理后对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）牛体细胞核移植的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植研究进展 |
| 1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.2 哺乳动物胚胎干细胞细胞核移植研究进展 |
| 1.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.3.1 牛体细胞核移植研究进展 |
| 1.3.2 其他动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4 哺乳动物异种体细胞核移植研究进展 |
| 1.5 哺乳动物体细胞核移植相关领域研究进展 |
| 1.5.1 利用体细胞核移植技术生产转基因动物的研究进展 |
| 1.5.2 治疗性克隆的研究进展 |
| 1.6 我国核移植研究进展 |
| 第二章 哺乳动物体细胞核移植理论基础 |
| 2.1 受体胞质 |
| 2.2 供体细胞 |
| 2.2.1 供体细胞类型对发育的影响 |
| 2.2.2 供体细胞周期对发育的影响 |
| 2.2.3 核供体细胞的传代次数和来源 |
| 2.3 核供体细胞与受体细胞之间的相互作用 |
| 2.4 核移植相关问题的研究进展 |
| 2.4.1 重构胚基因组的重编程 |
| 2.4.2 DNA 甲基化 |
| 2.4.3 组蛋白乙酰化 |
| 2.4.3 X 染色体失活 |
| 2.4.4 端粒 |
| 2.4.5 印记基因的表达 |
| 2.4.6 线粒体DNA 的命运 |
| 第三章 哺乳动物体细胞核移植研究存在的问题及应用前景 |
| 3.1 核移植研究中存在的问题 |
| 3.2 哺乳动物核移植的应用前景 |
| 3.2.1 体细胞核移植研究在基础科学研究中的作用 |
| 3.2.2 体细胞核移植研究在医学领域的作用 |
| 3.2.3 体细胞核移植研究与动物保护 |
| 3.2.4 体细胞核移植研究在畜牧生产的作用 |
| 试验研究 |
| 第四章 牛成纤维细胞和颗粒细胞的分离和培养 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 仪器和试剂 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 牛耳皮肤成纤维细胞（BEF）的准备 |
| 4.2.2 颗粒细胞的分离与培养 |
| 4.2.3 牛耳皮肤成纤维细胞核型分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛耳皮肤成纤维细胞的分离和培养 |
| 4.3.2 牛颗粒细胞的分离和培养 |
| 4.3.3 牛耳皮肤成纤维细胞核型分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 BEF 的分离与培养,核型分析 |
| 4.4.2 供体细胞类型对克隆效率的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛卵母细胞体外成熟的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 血清及血清替代物对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.2.2 尿嘧啶对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.2.3 ATP 对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 血清及血清替代物 |
| 5.3.2 尿嘧啶 |
| 5.3.3 ATP |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛体细胞核移植的研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 仪器和试剂 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同融合参数的融合效率 |
| 6.2.2 不同融合电压对融合效率的影响 |
| 6.2.3 不同融合时间对融合效率的影响 |
| 6.2.4 不同激活方法对牛重构胚发育的影响 |
| 6.2.5 不同激活时间对牛重构胚发育的影响 |
| 6.2.6 不同培养液对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.2.7 与牛颗粒细胞共培养对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.2.8 不同供体细胞对牛体细胞核移植的影响 |
| 6.2.9 不同代数供体细胞对牛体细胞核移植的影响（BEF422） |
| 6.2.10 不同品种受体对牛体细胞核移植妊娠率的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 关于电融合 |
| 6.3.2 关于重构胚激活 |
| 6.3.3 关于重构胚培养 |
| 6.3.4 关于供核细胞 |
| 6.3.5 不同品种受体对牛核移植妊娠率的影响 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究新见解 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）山羊—绵羊异质体细胞克隆胚的构建及线粒体DNA的杂合性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物体细胞克隆的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物同种体细胞核移植研究进展 |
| 1.2 哺乳动物异种体细胞核移植研究进展 |
| 1.2.1 哺乳动物异种核移植 |
| 1.2.2 哺乳动物异种妊娠 |
| 1.3 哺乳动物异种核移植技术路线及对核移植结果的影响 |
| 1.3.1 供体细胞的准备及其对核移植结果的影响 |
| 1.3.2 受体卵母细胞的准备及其对核移植结果的影响 |
| 1.3.3 核移植过程 |
| 1.3.4 重构胚的融合 |
| 1.3.5 重构胚的激活 |
| 1.3.6 融合到激活时间的影响 |
| 1.4 异种核移植中线粒体问题 |
| 1.4.1 线粒体的生物学功能 |
| 1.4.2 异种核移植中线粒体的杂合性 |
| 1.4.3 分析异种核移植胚线粒体杂合性的方法 |
| 1.5 异种动物核移植研究存在的问题 |
| 1.5.1 体细胞的选择和传代 |
| 1.5.2 核质相容性 |
| 1.5.3 供体核重新编程 |
| 1.5.4 供体细胞端粒长度 |
| 1.5.5 重组胚胎移植受体的选择 |
| 1.6 异种核移植研究应用及展望 |
| 1.6.1 治疗性克隆 |
| 1.6.2 保护濒危动物中的应用 |
| 1.6.3 生产转基因动物 |
| 1.6.4 促进基础学科的发展 |
| 试验研究 |
| 第二章 FSH 及不同发情天数牛血清对绵羊卵母细胞体外成熟 及孤雌胚发育的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 发情牛血清（ECS）的制备 |
| 2.1.4 绵羊卵巢的采集 |
| 2.1.5 绵羊卵巢卵母细胞的采集及体外成熟培养 |
| 2.1.6 成熟卵母细胞的孤雌激活和孤雌胚的体外培养 |
| 2.1.7 试验设计 |
| 2.1.8 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同浓度的 FSH 对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响 |
| 2.2.2 添加不同发情天数的 ECS 对绵羊卵母细胞体外成熟和孤雌胚体外发育的影响 |
| 2.2.3 不同浓度 ECS 对绵羊卵母细胞体外成熟和孤雌激活的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 FSH 对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响 |
| 2.3.2 发情牛血清（ECS）对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 山羊-绵羊核移植重构胚的构建及电融合参数的确定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂、用品与仪器 |
| 3.1.2 绵羊卵母细胞的采集和成熟培养` |
| 3.1.3 体细胞核移植胚胎的获得 |
| 3.1.4 电融合试验设计及统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同电场强度对山羊-绵羊重构胚电融合率和早期发育的影响 |
| 3.2.2 不同电脉冲次数对山羊-绵羊重构胚电融合率和早期发育的影响 |
| 3.2.3 不同平衡时间对山羊-绵羊重构胚早期发育的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 山羊-绵羊异质体细胞克隆胚中线粒体DNA 的杂合性分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 山羊-绵羊异质克隆胚的构建 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.1.4 模板 DNA 的制备 |
| 4.1.5 PCR 扩增及酶切反应鉴定 |
| 4.1.6 特异性酶切片段的定量分析 |
| 4.1.7 山羊-绵羊异质克隆胚中mtDNA 的杂合性分析 |
| 4.1.8 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 供受体细胞中mtDNA 的 PCR 扩增结果及酶切产物分析 |
| 4.2.2 酶切产物的定量分析 |
| 4.2.3 异质克隆胚中供受体mtDNA 的杂合性分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）提高绵羊体细胞核移植效率的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳类动物卵母细胞的体外利用开发 |
| 1.1 卵泡卵母细胞体外成熟 |
| 1.1.1 卵母细胞成熟概论 |
| 1.1.2 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.1.3 卵母细胞成熟的判断 |
| 1.1.4 卵母细胞的获取与分级 |
| 1.1.5 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 卵母细胞冷冻保存的研究进展 |
| 1.2.1 卵母细胞冷冻保存原理 |
| 1.2.2 冷冻保护剂的种类 |
| 1.2.3 卵母细胞的冷冻方法 |
| 1.2.4 影响卵母细胞冷冻的因素 |
| 第二章 哺乳类动物核移植的研究进展 |
| 2.1 哺乳类动物胚胎细胞及干细胞核移植研究进展 |
| 2.2 哺乳类动物同种体细胞核移植研究进展 |
| 2.2.1 国外哺乳类动物同种体细胞核移植研究概况 |
| 2.2.2 国内哺乳类动物同种体细胞核移植研究概况 |
| 2.3 异种动物细胞核移植研究进展 |
| 2.3.1 国外异种动物细胞核移植研究历史概况 |
| 2.3.2 国内异种动物细胞核移植研究历史概况 |
| 2.3.3 异种动物细胞核移植相关问题的研究概况 |
| 2.3.4 提高动物细胞异种核移植尚待解决的问题 |
| 2.4 哺乳动物核移植相关机制的研究进展 |
| 2.4.1 MPF 与核移植的关系 |
| 2.4.2 卵母细胞激活 |
| 2.4.3 核的重编程 |
| 2.4.4 端粒及端粒酶问题 |
| 2.4.5 基因印迹问题 |
| 2.5 影响哺乳动物核移植的因素 |
| 2.5.1 核受体胞质的准备及其对核移植的影响 |
| 2.5.2 核供体的准备及其对核移植的影响 |
| 2.5.3 卵母细胞去核方法对核移植的影响 |
| 2.5.4 融合-激活方案对核移植的影响 |
| 2.6 体细胞核移植技术的应用前景和存在问题 |
| 2.6.1 体细胞核移植技术的应用前景 |
| 2.6.2 体细胞核移植存在的问题 |
| 前言 |
| 第三章 绵羊卵母细胞的体外成熟培养 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料及仪器 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同类型血清和促性腺激素对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.2 添加不同浓度BFF 对绵羊母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.3 不同浓度的孕酮添加对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 不同类型血清对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.2 不同来源促性腺激素对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.3 添加不同浓度BFF 对绵羊母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.4 不同浓度的孕酮对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 绵羊卵母细胞的冷冻保存试验研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料及仪器设备 |
| 4.1.2 冷冻液的配制及试验设计 |
| 4.1.3 绵羊卵母细胞的采集 |
| 4.1.4 卵母细胞的体外成熟 |
| 4.1.5 卵母细胞的程序化冷冻 |
| 4.1.6 卵母细胞的玻璃化冷冻 |
| 4.1.7 卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.1.8 卵母细胞冷冻效果的评定与数据的统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 在程序冷冻中不同冷冻液对绵羊卵母细胞冷冻效果的影响 |
| 4.2.2 不同植冰温度对绵羊卵母细胞程序化冷冻的效果 |
| 4.2.3 不同玻璃化冷冻液对绵羊卵母细胞的冷冻效果分析 |
| 4.2.4 不同发育时期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后的发育能力 |
| 4.2.5 不同浓度海藻糖对卵母细胞的冷冻效果的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 卵母细胞冷冻效果的评判标准 |
| 4.3.2 不同冷冻方法对卵母细胞冷冻效果的影响 |
| 4.3.3 不同发育时期对卵母细胞冷冻效果的影响 |
| 4.3.4 非渗透性保护剂与渗透性保护剂配合使用对卵母细胞冷冻效果的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 不同激活方法对卵母细胞的孤雌激活效果 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 数据统计方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 不同参数的电激活对卵母细胞孤雌激活的效果 |
| 5.2.2 绵羊精子提取物对卵母细胞的激活效果 |
| 5.2.3 不同激活方法对绵羊卵母细胞的激活效果的比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 不同参数的电激活对卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 5.3.2 精子提取物对卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 5.3.3 离子霉素的对卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 绵羊体细胞核移植的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 绵羊皮肤成纤维细胞的体外分离培养 |
| 6.1.3 绵羊同种体细胞核移植 |
| 6.1.4 统计方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 培养液对原代成纤维细胞培养结果的影响 |
| 6.2.2 消化传代对细胞纯化及生长的影响 |
| 6.2.3 培养液对传代细胞培养结果的影响 |
| 6.2.4 EGF 和胰岛素对细胞生长的影响 |
| 6.2.5 冻存对皮肤成纤维细胞形态及生物学特性的影响 |
| 6.2.6 去核时间与去核率对体细胞核移植结果的影响 |
| 6.2.7 不同核移植重构胚构建方法对体细胞核移植结果的影响 |
| 6.2.8 不同供体细胞的处理方法对体细胞核移植结果的影响 |
| 6.2.9 不同激活方法对体细胞核移植效果的影响 |
| 6.2.10 成纤维细胞注核后不同间隔时间激活对移植胚发育的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的生长特性 |
| 6.3.2 核移植重构胚的构建方法对体细胞核移植效率的影响 |
| 6.3.3 不同激活方法对体细胞核移植胚胎发育的影响 |
| 6.3.4 注核后激活间隔时间对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 山羊－绵羊异种体细胞核移植的研究 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 山羊皮肤成纤维细胞的体外分离培养及颗粒细胞的准备 |
| 7.1.3 山羊-绵羊种间体细胞核移植 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 组织块的保存和细胞培养 |
| 7.2.2 莎能山羊皮肤细胞冻存 |
| 7.2.3 不同激活方法对山羊-绵羊异种核移植胚胎发育的影响 |
| 7.2.4 不同核移植胚构建方法对山羊-绵羊异种体细胞核移植的影响 |
| 7.2.5 供体细胞不同处理方法对核移植结果的影响 |
| 7.2.6 受体细胞冷冻对异种体细胞核移植结果的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 培养液对皮肤成纤维细胞生长的影响 |
| 7.3.2 成纤维细胞的不同处理方法对异种体细胞核移植结果的影响 |
| 7.3.3 不同类型供体细胞对异种体细胞核移植胚效率的影响 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 提高体细胞核移植胚体外发育能力的研究 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 试验材料及仪器设备 |
| 8.1.2 培养液 |
| 8.1.3 绵羊卵母细胞的采集与体外成熟 |
| 8.1.4 共培养单层细胞的制备 |
| 8.1.5 体细胞核移植胚胎的获得 |
| 8.1.6 核移植胚激活 |
| 8.1.7 胚胎的体外培养 |
| 8.1.8 试验设计及统计分析 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 不同培养液组合对重构胚发育的影响 |
| 8.2.2 添加孕酮对胚胎发育的影响 |
| 8.2.3 不同共培养体细胞对绵羊核移植胚胎早期发育的影响 |
| 8.2.4 不同蛋白质添加物对颗粒细胞与核移植胚共培养的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 不同培养液组合对重构胚发育的影响 |
| 8.3.2 孕酮对重构胚发育的影响 |
| 8.3.3 共培养体系对重构胚发育的影响 |
| 8.3.4 蛋白添加物对胚胎发育的影响 |
| 8.4 小结 |
| 论文总结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）体细胞核移植及线粒体命运的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 哺乳动物异种体细胞核移植的研究进展 |
| 1.1 异种核移植技术的发展史 |
| 1.1.1 自然界的种间杂交 |
| 1.1.2 低等脊椎动物的异种间核移植 |
| 1.1.3 哺乳动物的异种受精和胚胎移植 |
| 1.1.4 哺乳动物异种间的胚胎移植 |
| 1.1.5 异种胚胎细胞核移植 |
| 1.1.6 异种体细胞核移植 |
| 1.2 异种核移植的理论背景 |
| 1.3 异种核移植的研究机理 |
| 1.3.1 细胞周期 |
| 1.3.2 MPF 的调控 |
| 1.3.3 Ca~(2+)启动核的再程序化 |
| 1.3.4 线粒体问题 |
| 1.3.5 卵胞质对供体核的再程序化作用 |
| 1.3.6 DNA 甲基/去甲基化 |
| 1.3.7 X 染色体失活 |
| 1.3.8 核质运输 |
| 1.4 影响异种核移植效率的因素 |
| 1.4.1 供体细胞周期 |
| 1.4.2 不同胞质受体或核供体 |
| 1.4.3 重构胚的性别 |
| 1.5 异种核移植遗传物质的检测 |
| 1.5.1 染色体分析 |
| 1.5.2 核DNA 分析 |
| 1.5.3 线粒体DNA 分析 |
| 1.5.4 端粒DNA 分析 |
| 1.6 异种核移植技术的应用前景 |
| 1.6.1 在医学领域中的应用 |
| 1.6.2 在畜牧业生产上的应用 |
| 1.6.3 拯救濒危动物 |
| 1.7 异种核移植存在的问题和解决办法 |
| 1.7.1 存在的问题 |
| 1.7.2 解决方法 |
| 1.8 展望 |
| 第二章 哺乳动物线粒体的研究进展 |
| 2.1 动物线粒体结构和功能 |
| 2.1.1 线粒体的D-loop 结构 |
| 2.1.2 线粒体功能 |
| 2.2 MTDNA |
| 2.2.1 mtDNA 拷贝数 |
| 2.2.2 mtDNA 的复制 |
| 2.2.3 mtDNA 的转录 |
| 2.2.4 线粒体蛋白质基因的翻译 |
| 2.3 线粒体基因与核基因相互作用 |
| 2.4 动物线粒体遗传学特点 |
| 2.4.1 母性遗传 |
| 2.4.2 父性遗传 |
| 2.5 核移植中线粒体的命运 |
| 2.5.1 胚胎细胞核移植中线粒体的命运 |
| 2.5.2 同种体细胞核移植中线粒体的命运 |
| 2.5.3 异种核移植中线粒体的命运 |
| 2.6 线粒体的分布与功能的关系 |
| 2.7 线粒体移植 |
| 2.8 研究前景 |
| 第三章 牛、绵羊MTDNA RQ-PCR 检测标准的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 质粒和菌种 |
| 3.1.2 试剂和仪器 |
| 3.1.3 PCR 模板的制备 |
| 3.1.4 特异性引物设计 |
| 3.1.5 PCR 扩增 |
| 3.1.6 目的片段的克隆、鉴定 |
| 3.1.7 荧光定量PCR |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 特异性引物扩增结果 |
| 3.2.2 转化后鉴定结果 |
| 3.2.3 OD 值测定及质粒浓度换算 |
| 3.2.4 荧光定量PCR 扩增后标准曲线的形成 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 牛卵母细胞内线粒体的量与质量的关系 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.1.3 卵母细胞的采集与培养 |
| 4.1.4 牛mtDNA 定量PCR 标准曲线的制备 |
| 4.1.5 孤雌激活 |
| 4.1.6 模板的制备 |
| 4.1.7 mtDNA 定量PCR |
| 4.1.8 数据统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 mtDNA 定量 |
| 4.2.2 孤雌激活胚胎的发育 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 线粒体移植对牛孤雌胚和ICSI 胚发育的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 卵母细胞的采集 |
| 5.1.3 显微注射用玻璃针的制备 |
| 5.1.4 线粒体分离 |
| 5.1.5 线粒体染色 |
| 5.1.6 线粒体移植和ICSI |
| 5.1.7 线粒体移植和孤雌激活 |
| 5.1.8 胚胎培养和囊胚细胞计数 |
| 5.1.9 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 线粒体注射对ICSI 胚的影响 |
| 5.2.2 线粒体注射对孤雌激活胚的影响 |
| 5.2.3 胚胎发育过程中线粒体荧光变化 |
| 5.2.4 囊胚细胞数 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛体细胞核移植胚中线粒体命运 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试剂与材料 |
| 6.1.2 卵母细胞培养 |
| 6.1.3 供体细胞的准备 |
| 6.1.4 核移植和胚胎培养 |
| 6.1.5 统计分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 供体细胞培养 |
| 6.2.2 供体细胞类型对核移植胚的影响 |
| 6.2.3 荧光探针对胚胎发育的影响 |
| 6.2.4 荧光探针的检测 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 牛-绵羊异种核移植早期胚胎的发育 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试剂与仪器 |
| 7.1.2 绵羊胎儿成纤维细胞培养 |
| 7.1.3 卵母细胞成熟培养 |
| 7.1.4 核移植和胚胎培养 |
| 7.1.5 胚胎质量分析 |
| 7.1.6 染色体分析 |
| 7.1.7 统计分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 胚胎发育潜力 |
| 7.2.2 胚胎形态学特点 |
| 7.2.3 染色体数目 |
| 7.2.4 囊胚细胞数 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 牛-绵羊异种核移植胚中线粒体的命运 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料与试剂 |
| 8.1.2 核移植 |
| 8.1.3 牛、绵羊特异性引物设计和RQ-PCR 标准品制备 |
| 8.1.4 分离卵裂球 |
| 8.1.5 mtDNA 模板的制备 |
| 8.1.6 RQ-PCR 分析 |
| 8.1.7 统计分析 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 两种线粒体的分配 |
| 8.2.2 同一胚胎中mtDNA 的变化 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、哺乳动物细胞核移植(克隆)研究进展(下)（论文参考文献）
- [1]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)
- [2]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [3]LncRNA参与调控山羊合子基因组激活期核移植胚胎重编程的研究[D]. 邓明田. 南京农业大学, 2018(07)
- [4]梅花鹿体细胞克隆胚胎构建及Ercc6l基因表达的研究[D]. 殷玉鹏. 吉林大学, 2012(10)
- [5]猪体细胞核移植相关技术研究[D]. 黄雅琼. 广西大学, 2008(12)
- [6]牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究[D]. 丁向彬. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [7]牛体细胞核移植的研究[D]. 黄伟伟. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [8]山羊—绵羊异质体细胞克隆胚的构建及线粒体DNA的杂合性分析[D]. 杨丽. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [9]提高绵羊体细胞核移植效率的研究[D]. 赛务加甫. 西北农林科技大学, 2007(01)
- [10]体细胞核移植及线粒体命运的研究[D]. 华松. 西北农林科技大学, 2007(06)