一、缺血再灌注对在体兔窦房结细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响（论文文献综述）
朱安娜[1]（2021）在《基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制》文中指出目的:基于网络药理学研究方法,探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制。方法:（1）通过TCMSP数据库及查阅文献搜集整理麻黄附子细辛汤化学成分及相关潜在靶点信息,对未搜集到靶点的成分应用Swiss Target Prediction数据库预测补充,综合得到麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集;（2）于Gene Cards数据库筛选得到病态窦房结综合征相关靶点,整理得到病态窦房结综合征相关的疾病靶点数据集;（3）利用Cytoscape软件展示中药、化学成分和疾病靶点间的关系,构建“麻黄附子细辛汤药物-化学成分-靶点-病态窦房结综合征”生物网络,通过Cyto NCA拓扑分析,得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分及相关靶点;（4）应用Ledock软件进行分子对接验证关键化学成分与核心靶点结合的可靠性;（5）利用DAVID、Metascape数据库,分别对作用靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,预测麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的作用机制。结果:（1）通过对麻黄附子细辛汤作用于病态窦房结综合征相关靶点的生物网络进行分析,预测得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的199个显效成分,包括芦丁、去甲乌药碱、β-细辛醚等;（2）由拓扑分析得到网络中木犀草素、准葛尔乌头碱、山奈酚等10个关键化学成分及ADRB2、SCN5A、AR等10个核心靶点;（3）经分子对接证实了除外KCNH2的9个核心靶点与关键化学成分都具有较强结合活性,佐证了关键化学成分与核心靶点的可靠性;（4）通过GO功能注释和KEGG通路富集分析,推测麻黄附子细辛汤治疗SSS的作用机制可能为:（1）调节细胞因子活性,抑制甚逆转心肌纤维化,改善SSS发生的病理基础;（2）调节细胞对炎性刺激、缺氧、老化的反应,保护心肌细胞,减轻窦房结及其周围组织的功能单位损伤;（3）调控蛋白质活力和细胞对机械刺激的反应,诱导质膜受体表达,增强窦房结细胞“钙钟”“膜钟”活性,扩张血管,促进窦房结细胞电生理活动正常,改善心律失常和组织器官血流灌注不足症状;（4）影响可能导致SSS发生的相关疾病,限制多疾病对SSS发生的诱导、加重。结论:本研究通过对麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的网络药理学分析及分子对接验证,初步预测了麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制,为麻黄附子细辛汤的临床应用提供了分子生物学层面的理论支持,为其治疗SSS作用机制的深入研究和复方的二次开发提供了一定量的参考信息。
施建丽[2]（2020）在《Notch3通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α轴调节心脏成纤维细胞增殖、凋亡及向肌成纤维细胞转化》文中研究说明研究背景:心肌纤维化是多种心血管疾病的常见病理过程。心脏成纤维细胞活性异常是心肌纤维化发生发展过程中的关键事件。Notch信号通路在抗心肌纤维化中起着非常重要的作用,但其机制尚未阐明,需要进一步研究。Hif1α和RhoA/ROCK信号通路都已被证明参与心肌纤维化。同时也有研究发现在某些病理生理过程中RhoA/ROCK信号通路是Hif1α的上游途径。在本研究中,我们旨在确定Notch3对心脏成纤维细胞增殖、凋亡及向肌成纤维细胞转化的调控作用及其与RhoA/ROCK/Hif1α信号通路的关系。研究方法:实验分为3个部分。第一部分探讨Notch3对心脏成纤维细胞增殖、表型转化及凋亡的调控作用。分别应用Notch3 siRNA和过表达质粒进行Notch3敲减和过表达血清处理后的成纤维细胞。实验分组:control组,sc notch3组,si notch3组,vector组和ov-N3ICD组。RT-qPCR和western blot检测Notch3 siRNA和过表达质粒转染的效率;应用CCK8和Edu试剂盒检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测total caspase3,cleaved caspase3和Bcl2等凋亡相关蛋白及Col I,Col III和α-SMA等表型转化相关指标。第二部分研究Notch3对RhoA/ROCK/Hif1α轴的影响。实验分组为:NC组,2-ME+NC组,si notch3组,2-ME+si notch3组;Vector组,DMOG+vector组,ov-N3ICD组,DMOG+ov-N3ICD组。Western blot检测RhoA,ROCK1,ROCK2,Hif1α和细胞膜及细胞质RhoA。免疫荧光检测Hif1α表达。分别通过2-ME（Hif1α抑制剂）和DMOG（脯氨酸羟化酶抑制剂）预处理成纤维细胞并检测细胞增殖、凋亡及细胞表型转换相关的指标,明确RhoA/ROCK/Hif1α信号通路在Notch3调节心脏成纤维细胞活性中的作用。通过Y-27632（RhoA/ROCK通路抑制剂）预处理成纤维细胞,探讨Hif1α和RhoA/ROCK通路之间的关系。第三部分为动物实验。应用心肌梗死后心肌纤维化模型,通过N3ICD过表达腺病毒心肌注射实现心肌组织过表达Notch3。实验分为:sham组,Ad-GFP+MI组和Ad-N3ICD+MI组。通过RT-qPCR和western blot检测腺病毒注射后心肌组织中Notch3表达量;心脏彩超观察心功能指标（LVDEE和EF）的变化;心肌纤维化程度是通过Masson染色检测;Western blot检测心肌组织中α-SMA,RhoA,ROCK1,ROCK2,Hif1α和细胞膜及细胞质RhoA变化。研究结果:本实验结果部分分为三个部分。第一部分:ov-N3ICD质粒和si notch3成功过表达和干扰心脏成纤维细胞中Notch3的表达。与空白对照组和空载质粒组相比,Notch3过表达可以抑制心脏成纤维细胞增殖及表型转化,促进其凋亡。同时,Notch3过表达可以增加c-caspase3/t-caspase3比值,降低Bcl2表达。而Notch3敲减表现出完全相反的实验结果。第二部分:与对照组相比,Notch3过表达可以降低Hif1α,RhoA,ROCK1,ROCK2的表达,Notch3敲减升高Hif1α,RhoA,ROCK1和ROCK2。SiRNA转染前用2-ME预处理可以逆转由于Notch3敲除引起的细胞增殖增加以及Col I,Col III和α-SMA等表型转化相关指标水平上调。ov-N3ICD质粒转染前DMOG预处理心脏成纤维细胞可以逆转由于Notch3过表达引起的凋亡及凋亡相关蛋白变化。SiRNA转染前2h Y-27632预处理,可以逆转由于Notch3敲减引起的Hif1α水平上升。第三部分:与sham组和Ad-GFP组相比,Ad-N3ICD组心肌组织中Notch3蛋白表达上调。与Ad-GFP+MI组相比,Ad-N3ICD+MI组LVEDD降低,EF升高。Masson染色显示Ad-N3ICD+MI组中纤维化面积较Ad-GFP+MI组低。与Ad-GFP+MI组比,Ad-N3ICD+MI组中α-SMA,Hif1α,RhoA,ROCK1,ROCK2和细胞膜RhoA蛋白表达较低。研究结论:Notch3可以抑制心脏成纤维细胞增殖及向肌成纤维细胞转化,促进细胞凋亡;此作用发挥是通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α轴;Notch3通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α轴抑制心肌梗死后心肌纤维化,改善心功能。
孙野[3]（2019）在《三苦滴丸对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用及机制研究》文中认为目的:本研究建立大鼠心肌缺血再灌注模型,模拟急性心肌梗死后再灌注损伤的病理生理变化,在大鼠造模前三苦滴丸溶剂进行有效的干预,旨在观察三苦滴丸在保护心肌、抗细胞凋亡等方面的作用,并探讨三苦滴丸对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C以及caspase-3的影响,进一步探讨其作用机制。从而为中医药在临床上治疗心肌缺血再灌注损伤方面提供新方案。本实验共分为两部分:第一部分即证明三苦滴丸预处理是否对大鼠缺血再灌注有保护效果。第二部分即证明三苦滴丸预处理对心肌缺血再灌注的细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。方法:第一部分:对大鼠采用结扎缺血30 min后松解结扎线进行再灌注,再灌注2h的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型,78只大鼠,随机分为6组,分别为假手术组（n=13）、模型组对照组（n=13）、三苦低剂量组（SK0.8,n=13）、三苦中剂量组（SK1.6,n=13）、三苦高剂量组（SK3.2,n=13）及阳性药对照组（n=13）。三苦低、中、高剂量组分别每天灌胃给予受试药0.8、1.6、3.2 g/kg体重,阳性药对照组每天灌胃给予丹参滴丸0.4g/kg体重,假手术组及模型组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液,给药7天,末次给药后进行造模。应用配备15-MHz的现行传感器的M-型超声心动图机对大鼠心功能进行检测,利用Image-Pro Plus图像分析软件计算心肌梗死率（梗死面积与心脏切片总面积的比值）。HE染色观察心肌组织形态学变化。标本收集:实验结束时腹主动脉采血,然后将心脏取出,将左心室分成三部分,一部分用于SOD、MDA的检测;一部分用于心肌组织形态观察;剩下一部分放入-80℃冰箱中检测乳酸脱氢酶（LDH）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）的水平。第二部分:78只大鼠,随机分为6组,分别为假手术组（n=13）、模型组对照组（n=13）、三苦低剂量组（SK0.8,n=13）、三苦中剂量组（SK1.6,n=13）、三苦高剂量组（SK3.2,n=13）及阳性药对照组（n=13）,剩下步骤同实验一。以TUNEL法检测凋亡心肌细胞,计算细胞凋亡指数。应用Western bloting检测各组大鼠心肌Bcl-2、Bax的表达,采用免疫组织化学方法观察Cyt C表达,以及采用分光光度法检测caspase-3的活性。结果:第一部分:1.SK对心功能的影响:1.1 SK对射血分数的影响:于再灌注后2h,通过超声心动图计算大鼠左心室射血分数（LVEF）,以此来探讨大鼠左心室射血功能的变化。在灌注2h后,缺血再灌注明显降低了左心室射血分数。与Sham组比较Model组的射血分数显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）;与Model组对比,SK低剂量组（SK0.8）与SK中剂量组（SK1.6）的射血分数无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）;与Model组对比,SK高剂量组（SK3.2）的射血分数升高,差异有统计学意义（P<0.01）;与Model组对比,DSP组的射血分数升高,差异有统计学意义（P<0.01）。说明SK组抑制了因缺血再灌注损伤造成的LVEF下降,结果有明显差异（P<0.01）。1.2 SK对心率的影响:心率是反映心功能的一个指标,SK各组均可增快心率。与Sham组比较,Model组大鼠的心率显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）;与Model组对比,SK低剂量组（SK0.8）大鼠的心率无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）;与Model组对比,SK中剂量组（SK1.6）、SK高剂量组（SK3.2）大鼠的心率升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与Model组对比,DSP组大鼠的心率升高,差异有统计学意义（P<0.01）。说明SK缓解了因缺血再灌注损伤所造成的心率下降,结果有明显差异（P<0.05）。2.SK对缺血再灌注损伤后心肌梗死面积的影响:SK可明显地减少缺血再灌注心肌梗死的面积。与Sham组比较,Model组大鼠的心肌梗死率明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）;与Model组对比,SK中剂量组（SK1.6）、SK高剂量组（SK3.2）的心肌梗死率明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）;与Model组对比,DSP组的心肌梗死率明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）。说明SK组明显抑制了因缺血再灌注损伤造成的心肌梗死率,结果有明显差异（P<0.01）。3.大鼠心肌组织病理形态学:根据对HE染色在光镜下的观察结果表明,Sham组的心肌细胞形态规则、排列整齐,肌纤维完整,并未见到心肌细胞的水肿、变性以及坏死,且也无中性粒细胞浸润。Model组的心肌细胞形态不规则、排列发生紊乱,局部肌纤维横纹消失,可见心肌细胞发生水肿、且有少量的心肌细胞变性以及坏死,且伴有大量的中性粒细胞浸润。SK低剂量组（SK0.8）、SK中剂量组（SK1.6）、SK高剂量组（SK3.2）组的心肌细胞水肿减轻、中性粒细胞浸润的数量明显减少,表明SK可保护心肌受损程度的下降;而光镜下DSP组的心肌组织的病理形态与SK组相似。4.缺血再灌注对大鼠LDH、AST、CK-MB、SOD及MDA的影响:再灌注结束后检测各组LDH、AST、CK-MB、SOD及MDA值。结果显示,Model组、SK低剂量组（SK0.8）、SK中剂量组（SK1.6）、SK高剂量组（SK3.2）、DSP组的LDH、AST及CK-MB值均较Sham组明显增高（P<0.01）。Model组、SK低剂量组（SK0.8）、SK中剂量组（SK1.6）、SK高剂量组（SK3.2）、DSP组的SOD值明显降低,与Sham组比较有显着性差异（P<0.01）;Model组、SK低剂量组（SK0.8）、SK中剂量组（SK1.6）、SK高剂量组（SK3.2）、DSP组的MDA值明显增高,与Sham组相比有显着性差异（P<0.01）。以上结果表明缺血再灌注可造成心肌严重损伤,证实心肌缺血再灌注模型构建成功。5.SK对缺血再灌注大鼠LDH、AST、CK-MB、SOD及MDA的影响:经统计学检验,各组间LDH、AST、CK-MB、SOD及MDA的水平均有显着差异。根据结果可得,SK低剂量（SK0.8）、SK中剂量（SK1.6）、SK高剂量（SK3.2）、DSP对LDH、AST、CK以及MDA的升高有明显的抑制作用,且SK低剂量（SK0.8）、SK中剂量（SK1.6）、SK高剂量（SK3.2）、DSP对SOD的活性有明显的增加作用,与Model组比较有统计学意义（P<0.001）;对SK高剂量组（SK3.2）与DSP组的上述指标进行统计学分析（P>0.05）,表明两组无统计学差异。根据以上结果可表明SK与DSP具有抗氧化作用而减轻心肌缺血再灌注损伤。第二部分:1.各组心肌组织TUNEL检测结果:按试剂盒提供的TUNEL法原位检测凋亡细胞。正常心肌细胞核呈蓝色;凋亡心肌细胞核呈深浅不一红染。与Sham组比较Model组的心肌细胞凋亡指数明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）;与Model组对比,SK低剂量组（SK0.8）、SK中剂量组（SK1.6）、SK高剂量组（SK3.2）的心肌细胞凋亡指数明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）;与Model组对比,DSP组的心肌细胞凋亡指数明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）。说明SK组抑制了因缺血再灌注损伤造成的心肌细胞凋亡。2.Western bloting检测各组大鼠心肌Bcl-2、Bax的表达:通过分析目的条带的光密度值（IOD）发现,各组间Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax比值的表达均有显着差异。在Sham组中心肌组织有一定量的Bcl-2及Bax表达,Model组心肌Bcl-2蛋白表达显着减少,而Bax表达显着增加（P<0.01）,Bcl-2/Bax比值显着降低;SK中剂量（SK1.6）、SK高剂量组（SK3.2）和DSP组中Bax表达较Model组显着下降（P<0.01）,但Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax比值较Model组显着升高（P<0.01）。SK高剂量组（SK3.2）和DSP组中Bcl-2、Bax无显着性差异（P>0.05）;此两组中Bax表达与Sham组比较无显着性差异（P>0.05）。3.各组Cyt C的表达:根据免疫组织化学方法观察Cyt C表达。在Sham组中Cyt C的含量极少,但在Model组中可以看到Cyt C含量的显着增加,但在SK中剂量（SK1.6）、SK高剂量组（SK3.2）和DSP组中Cyt C表达较Model组显着下降（P<0.01）,对比SK高剂量组（SK3.2）和DSP组中Cyt C表达无明显差异（P>0.05）。4.各组caspase-3活性检测结果:caspase-3蛋白表达水平表达情况,各组间caspase-3蛋白表达水平差异显着。正常心肌细胞的caspase-3蛋白表达水平较低,Model组心肌caspase-3的蛋白表达水平明显升高;经过SK中剂量（SK1.6）、SK高剂量（SK3.2）及DSP预处理后心肌caspase-3的蛋白表达水平显着降低（P<0.01）,但SK及DSP组的caspase-3蛋白表达水平间无显着性差异。结论:1本实验通过对大鼠进行心肌缺血再灌注的造模,证实了心肌损伤可因心肌缺血再灌注导致,三苦滴丸预处理可以对心肌的损伤有显着的减轻,降低了LDH、AST、CK-MB以及MDA的值,提高SOD的活性,有效地减轻了心肌缺血再灌注损伤,减少了心肌梗死面积以及缓解心律下降,改善了心脏功能,其机制可能与通过增加机体清除氧自由基的能力,减少细胞膜脂质过氧化损伤有关。2三苦滴丸通过对心肌缺血再灌注诱发的细胞凋亡的抑制而保护缺血再灌注对心肌的损伤。3三苦滴丸预处理抑制细胞凋亡的机制可能与Bcl-2的蛋白表达的上调、Bax的蛋白表达的下调,Bcl-2/Bax比值的升高,抑制Cyt C从线粒体到胞浆中含量,以及减少心肌组织中caspase-3的活性有关。
滕林,曹春雨,周飞,姜玉蓉,陈万平,彭家芹,吴辉,李松,杨简,丁家望[4]（2018）在《缺血再灌注条件下乳兔窦房结细胞HCN4表达变化及对起搏电流的影响》文中进行了进一步梳理目的:观察乳兔窦房结细胞在缺血再灌注条件下HCN4的表达变化,探讨再灌注后HCN4的表达与窦房结功能的关系。方法:将原代培养的乳兔窦房结细胞分为正常对照组、单纯缺血组（缺血6h）及缺血再灌注组（1h,3h,6h）;采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中HCN4的表达;采用CCK-8检测细胞活力;采用流式细胞技术检测细胞凋亡;采用全细胞膜片钳记录单纯缺血组（缺血6h）及缺血再灌注组（1h,3h,6h）单个窦房结细胞的If电流。结果:与正常对照组相比,缺血后HCN4mRNA表达及蛋白水平明显下降,再灌注后,随着再灌注时间的延长（1h,3h,6h）,HCN4mRNA表达及蛋白水平逐渐升高。同时缺血导致细胞活力下降,再灌注后细胞活力明显增加。急性缺血处理显着抑制了窦房结细胞的电活动,而随着再灌注时间的延长,窦房结细胞的起搏电流If逐渐增加。结论:急性缺血可导致窦房结细胞HCN4表达下降从而抑制窦房结电活动,早期再灌注治疗可明显增加HCN4的表达,使得通道If电流密度增多而促进窦房结功能恢复。
魏嘉[5]（2018）在《猪心脏移植供心冷保存的研究及评价体系的建立》文中进行了进一步梳理心脏移植是挽救终末期心脏病患者生命和生活质量唯一有效的治疗手段。然而,心脏移植过程中缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury,IRI）和供心冷保存时限较短的问题,一直是困扰心脏移植推广应用的主要瓶颈。心脏移植过程中,供心必然经历缺血缺氧-再灌注重新获氧这一过程,导致组织损伤和炎症反应。IRI是供心术后急、慢性功能不全甚至功能衰竭,致使死亡率上升的主要因素。目前临床通常使用冷保存液灌注和保存离体供心,然而,在此低温条件下的心肌代谢并未停止,有害代谢产物的积聚最终会在再灌注阶段引起供心损伤。目前该法的心肌有效保存时限仅有46 h,进一步加剧了待移植患者与供心不足的矛盾。由此可见,研制可减轻IRI和延长供心冷保存时限的冷保存液,是心脏移植的重要技术关键和研究热点。IRI诱导多条信号通路的激活并调控一系列基因的表达,导致细胞凋亡坏死最终引起器官损伤,业已证明:细胞凋亡、补体激活和炎症皆为参与IRI的经典关键通路。研究发现将针对上述通路中关键基因的化学合成小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）加入器官保存液,可有效抑制IRI所致的器官损伤,然而,这些研究仅局限于小动物模型,很难客观模拟人类疾患过程。猪在解剖结构、生理生化和免疫反应等方面与人类极为相似,是学术界公认的最适合模拟人类心血管系统疾病的模型动物。有鉴于此,我们以小型猪为实验动物,根据RNA干扰理论,研制可减轻IRI和延长有效保存时限的含siRNA心肌保存液。在siRNA体内给药中,转染效率一直是个技术难点。小动物实验证明,大剂量裸siRNA分子加入保存液可有效减少IRI,但大剂量siRNA给药策略不适用于大动物或人医临床。而转染试剂（Transfection reagent,TR）广泛应用于siRNA的体内和体外转染中,可减少siRNA使用剂量,较适合临床给药。为此,我们选取IRI相关的4个基因:Complement component 3（C3）（补体激活）、Nuclear Factor kappa B-p65（p65）（炎症）、Caspase 8和Caspase 3（细胞凋亡）,设计并合成siRNA,用猪肾细胞（PK15）和猪睾丸细胞（ST）筛选出抑制效率最强的4对siRNA。再将不同剂量化学修饰的siRNA-TR混合物或单纯siRNA加入常规心脏保存液Celsior液中,灌注并冷保存离体猪心。研究发现含低剂量siRNA-TR的保存液（4 OD siRNA-TR）在抑制4个目的基因表达和减少细胞凋亡作用上均优于只含有高剂量单纯siRNA的保存液（16 OD siRNA）。为减少和降低供心离体冷保存和再灌注引起的组织损伤和功能障碍,我们研究发现含siRNA-TR的保存液可减少冷保存供心的凋亡细胞,但其对再灌注复跳心的作用尚不清楚。为此,我们设计和构建了大动物供心保存评价体系,在国内率先建立大动物离体心灌流系统,通过灌注温血灌流液可使各类大动物供心在离体情况下跳动,再与心脏原位移植模型结合,构成供心体内外各项主要生物学参数综合评价平台。保存后供心在连接于离体心灌流系统或原位移植到受体时,经监测复跳过程中左心室血流动力学参数、心肌生存率、组织结构改变、心肌坏死、氧化应激、免疫激活和炎症反应等一系列生物学参数,可全面客观评判不同保存方式保存后的供心质量,为大动物心功能监测和人医心血管疾病临床相关研究奠定了坚实的研究基础和技术平台。为检验含siRNA-TR的保存液对再灌注猪心的保护效果,使用500 ml含2、4、6 OD siRNA（siRNA组）或4 OD scramble siRNA（阴性对照组,Ctrl）与TR混合物的Celsior液,以及500 ml单纯Celsior液（常规保存组,CEL）,灌注并冷保存离体猪心12 h后再将供心连接于体外灌流系统,温血灌注供心以左心做功模式跳动3 h。结果发现:siRNA组供心做功血流动力学参数均好于对照组CEL和Ctrl;做功结束后,其组织细胞凋亡水平低;组织结构改变轻微;血浆中的心肌酶学标志物和组织中的氧化应激标志物水平低;心肌组织中促炎因子和4个靶蛋白表达下调;组织中TLR-7及其配体MyD88水平未见升高。3个siRNA组之间相比,4 OD组综合效果最好,与冷保存未复跳猪心试验结果一致。从而提示siRNA保存液具有保护心功能、抑制细胞凋亡、保护心肌正常组织结构、减轻心肌坏死和氧化应激、控制炎症反应的作用且具备良好的生物安全性。基于离体心试验结果,为证实4 OD-TR的siRNA保存液在原位移植中同样具有较好心肌保护效力,我们将6只成年雄性小型猪供心分为2组,常规保存组供心冷保存6 h,而灌注siRNA-TR保存液的供心冷保存时间延长到12 h。冷保存结束后全部原位移植到受体胸腔并开放主动脉使其复跳做功3 h,期间记录血流动力学参数。所有供心冷停跳后、检测与离体心复跳心相同的指标。结果发现,与常规冷保存6 h的供心相比,延长保存时间到12 h的供心在凋亡水平、组织结构变化、心肌坏死、炎症反应和先天免疫激活等方面都有所减轻,心功能参数良好。在延长一倍时间的基础上,仍具有比常规临床保存供心更好的质量参数。本研究证明:通过含抑制炎症和凋亡途径的siRNA心肌保存液冷保存猪供心,能有效提高供心质量和延长保存时限,为深入研发临床新型供心保存液提供了新思路和新途径,具有广阔的应用前景和潜在的开发价值。
刘宇[6]（2014）在《通阳活血方对受损兔窦房结细胞起搏电流电生理及信号转导机制研究》文中研究指明背景：流行病学调查表明,病态窦房结综合征（sick sinus syndrome,SSS,简称病窦）,是临床难治性的重大疑难心血管疾病,属慢性渐进性疾病,高发病率、高危险性已经引起人们的普遍关注。因此,病窦的治疗及研究成为亟待解决的医学疑难问题。SSS目前尚无根治措施,西医治疗以阿托品、肾上腺素、氨茶碱等药物提高心率为主,副作用大；安装及更换单腔起搏器大约为2.89万费用较贵,且存在严重的禁忌症和并发症。因此,寻求安全、有效、廉价的治疗方法成为一种迫切需要。窦房结是心脏自律性的发源地,其起搏功能的正常对维持心脏正常的泵血功能尤为重要。早在上个世纪50年代,细胞膜兴奋理论认为,细胞膜离子通道的综合作用是心脏起搏的主要机制（membrane clock,膜钟）,其中包括超极化激活的起搏电流（If）、内向整流钾电流（IK1）、SCN5A编码的钠电流（INa）、钙电流（ICa）等。窦房结细胞（SNC）超极化激活环核苷酸门控（HCN）通道（hyperpolarization-activated current,简称If通道）在维持SNC自律性方面具有举足轻重的作用,SSS的产生与SNC结构的破坏、活性和自律性的降低直接相关近年研究表明,大多数学者认为SSS临床表现以本虚标实为主,本虚以气虚、阳虚多见,提出从整体入手,通过多环节、多靶点缓解病情,提高患者生存率、改善生存质量。中国中医科学院广安门医院刘志明老中医临证70余年经验认为SSS的临证以阳虚血瘀为主,故提炼治疗SSS有效方剂—通阳活血方（THR）,为原创经验方。前期对该方进行了多中心临床研究表明该方治疗病窦疗效确切、安全性好；基础实验研究表明该方通过多靶点、多途径起作用。因此,深入挖掘名老中医治疗病窦的宝贵经验,探讨修复受损窦房结结构和功能的电生理机制,具有重要的临床意义和应用价值。目的：在以往用于细胞研究的乳兔窦房结细胞（SNC）分离方法基础上进行改良,成功分离、培养出适用于全细胞膜片钳技术的乳兔SNC,进一步探讨THR含药血清、中药原液以及主要有效成分对乳兔缺血再灌SNC动作电位（AP）相关参数、起搏电流的影响和信号转导机制,以揭示THR治疗SSS的细胞电生理机制,为名老中医经验方治疗病窦提供科学依据,为传承名老中医经验提供借鉴。方法：1.将采用“双酶解+差速贴壁”法分离的乳兔SNC分为正常组、模型组、100、200、300μl通阳活血含药血清组及100μl空白血清组,除正常组,其余各组细胞均模拟缺血-再灌注（I-R）法制备乳兔SNC损伤模型,并利用全细胞膜片钳技术观察空白血清及通阳活血方含药血清对各组SNC自发性搏动频率、作电位时程APD20、APD50、APD90、最大舒张电位（MDP）、动作电位幅值（APA）的影响。2.将采用“双酶解+差速贴壁”法分离的乳兔SNC分为正常组、模型组、100、200、300μl含药血清组及通阳活血中药原液组,除正常组,其余各组细胞模拟I-R法制备SNC损伤模型,并利用全细胞膜片钳技术观察THR中药原液及含药血清对各组SNC超极化环核苷酸门控阳离子通道电流起搏电流（If）电流-电压曲线及相关门控机制的影响。3.将采用“双酶解+差速贴壁”法分离的乳兔SNC分为正常组、模型组、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L人参Rb1、黄芪甲苷,除正常组,其余各组细胞模拟I-R法制备SNC损伤模型,并利用全细胞膜片钳技术观察人参Rb1、黄芪甲苷对各组SNC超极化环核苷酸门控阳离子通道电流起搏电流（If）电流-电压曲线及相关门控机制的影响。4.将采用“双酶解+差速贴壁”法分离的乳兔SNC分为正常组、模型组、1μmol/L激动剂Forskolin和100μmol/L选择性抑制剂H89,除正常组,其余各组细胞模拟I-R法制备SNC损伤模型,并利用全细胞膜片钳技术观察Forskolin、H89高中低剂量对各组SNC超极化环核苷酸门控阳离子通道电流起搏电流（If）电流-电压曲线及相关门控机制的影响。结果：1.“双酶解+差速贴壁”差速贴壁5d后细胞主要呈3种形态：梭形、蜘蛛形与多边形,梭形细胞数目最多（61.5±6.8）,搏动频率快,（136±12）次/min；蜘蛛形细胞胞体较大,多伸有伪足,搏动频率较梭形细胞慢（106±9）次/min；少量多边形细胞体积较大、少伪足且无搏动,细胞平坦、胞浆清亮。2.与正常组比较,模拟I-R造模后SNC的APD20由正常（25.7±4.8）ms延长至（82.6±5.3）ms,具有显着统计学差异（P<0.05）,于造模后细胞外液分别加入100、200、300μl通阳活血方含药血清后,APD20分别缩短至（42.7±6.7）ms.（53.3±6.5）ms.（41.5±6.4）ms,差别均具有统计学意义（P<0.05）,三个含药血清组之间比较则无统计学差异。与正常组比较,模拟I-R造模后SNC的APD5o由正常（78.79±5.3）ms延长至（152.5±5.6）ms,具有极显着统计学差异（P<0.01）,于造模后细胞外液分别加入100、200、300μl通阳活血方含药血清后,APD5o分别缩短至（98.2±6.4）ms.（123.9±4.9）ms.（114.2±4.9）ms,差别均具有统计学意义（P<0.01）,其中100μl含药血清组缩短比200、300μl含药血清组更明显（P<0.05）,但200lμl和300μl含药血清组比较无统计学意义。与正常组比较,模拟I-R造模后SNC的APD90虽有延长,但无统计学意义（P>0.05）。于造模后细胞外液分别加入100、200、300μ1通阳活血方含药血清后,APD90的改变无统计学意义（P>0.05）。3.与正常组比较,模拟I/R造模后SNC的MDP由正常的（-65.6±4.8）mV变为（-53.9±5.8）mV,APA则由正常的（85.2+3.8）mV降低至（73.7±4.9）mV,均具有显着性统计学差异（P<0.01）。分别加入100、200、300μl通阳活血方含药血清后,各组MDP值无明显改变（P>0.05）,100μl和300μl含药血清分别使APA升高至（84.3+4.8）mV和（83.4±6.3）mV,具有显着性统计学差异（P<0.01）,但两组间比较无统计学意义：与模型组比较,200μl含药血清对APA虽有升高,但无统计学差异。与模型组比较,100μl空白血清组MDP及APA均无明显改变（P>0.05）4.正常组窦房结细胞If峰值电流密度为（-43.48±1.08）pA/pF,模拟I/R后SNCIf峰值电流密度降至（-19.64±2.14）pA/pF,具有极显着性差异（P<0.01）分别加入100、200、300μl通阳活血方含药血清后If峰值电流密度有不同程度的增大,分别升高至（-94.90±0.66）pA/pF、（-115.37±1.62）pA/pF、（-122.54±1.11）pA/pF（P<0.01）.空白血清组与模型组比较,If峰值电流密度无明显变化。分别于正常细胞外液加入100μl通阳活血方含药血清及空白血清后,含药血清组If峰值电流密度较正常组有所升高（P<0.05）,空白血清组则无明显变化。模拟I/R后SNC在分别加入100、200、300μl通阳活血方原液后,If峰值电流密度亦有不同程度的增大,分别升高至（-60.27±1.47） pA/pF、（-69.70±1.67） pA/pF、（-76.03±1.59） pA/pF （P<0.01）。分别于正常细胞外液加入100μl通阳活血方中药原液后,If峰值电流密度有所升高（P<0.01）。5.正常组窦房结细胞If峰值电流密度为（-43.48±1.08） pA/pF,模拟I/R后SNC If峰值电流密度降至（-19.64±2.14）pA/pF,具有极显着性差异（P<0.01）。加入100、200、400μmol/L人参Rb1后,If峰值电流密度有不同程度的增大,分别升高至（-22.99±1.75）pA/pF（P<0.05）、（-24.39±2.38） pA/pF、（-40.55±1.33）pA/pF（P<0.01）。分别于正常细胞外液加入100μmol/L人参Rb1, If峰值电流密度较正常组有所升高,但无统计学意义（P>0.05）。模拟I/R后SNC在分别加入100、200、400μmol/L黄芪甲苷后,If峰值电流密度亦有不同程度的增大,分别升高至（-30.43±1.98） pA/pF、（-34.83±1.6） pA/pF、（-52.72±1.7） pA/pF （P<0.01）。分别于正常细胞外液加入100μmol/L黄芪甲苷后,If峰值电流密度有所升高（P<0.05）6.正常组窦房结细胞If峰值电流密度为（-43.48±1.08） pA/pF,模拟I/R后SNC If峰值电流密度降至（-19.64±2.14） pA/pF,具有极显着性差异（P<0.01）。参照文献,在浴液中加入10μmol/LH89后,If峰值电流密度有不同程度的减小,下降至（-11.56±2.34） pA/pF （P<0.01）。后于浴液中分别加入100μl的含药血清和中药原液,If峰值电流密度有不同程度的升高,分别升高至（-12.45±2.16） pA/pF （P>0.05）、（-11.84±1.75） pA/pF （P>0.05）。在浴液中加入1μmol/L Forskolin后,If峰值电流密度有不同程度的上升至（-25.82±1.53）pA/pF （P<0.05）。后于浴液中分别加入100μl的含药血清和中药原液,If峰值电流密度有不同程度的升高,分别升高至（-61.03±2.48） pA/pF （P<0.01）（-51.60±2.47） pA/pF （P<0.01）结论：1.通阳活血方含药血清可加快乳兔受损SNC自发性搏动频率,缩短作电位时程APD20、APD50,增大乳兔受损SNC的APA,同时可保护乳兔受损SNC形态结构,从而提高心率,2.通阳活血方含药血清及中药原液能电压依赖性增大受损乳兔SNC的If电流密度,加快If通道稳态激活,恢复降低的If电流密度,以缩短SNC动作电位的舒张去极,从而提高其自律性。3.人参Rb1、黄芪甲苷可电压依赖性增大受损乳兔SNC的If电流密度,加快If通道稳态激活,恢复降低的If电流密度,以缩短SNC动作电位的舒张去极。4.通阳活血方含药血清及中药原液作用于If受PKA信号转导的影响。5.通阳活血方可能是通过上述机制增强SNC If以缩短动作电位时程,改善SNC起搏功能,从而加快心率。
黄宜生[7]（2011）在《酸枣仁皂苷A对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用及机制研究》文中研究指明一、研究背景冠心病为内科常见病及多发病,是导致人类死亡的主要原因之一,全国每年约有110万人死于冠心病。溶栓治疗、经皮冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention, PCI）或冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft, CABG）是缩小急性心肌梗死梗塞范围和改善临床预后的最有效方法。但部分患者或动物心肌缺血后再灌注,使缺血所致的功能和代谢障碍及结构破坏进一步加重,这种现象称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI）,临床表现为在闭塞的冠状动脉再通、梗死区血液灌流重建后一段时间内,有的病例发生血压骤降、心功能不全、心律失常甚至猝死等病情恶化的现象。因此,MIRI的发生机制与防治越来越引起人们的关注,并一直试图寻找能对MIRI产生确切保护作用的药物。心肌缺血再灌注损伤的发生机制十分复杂,而细胞调亡是心肌缺血再灌注损伤发生的重要机制之一。与细胞坏死过程不同,细胞凋亡又称程序性细胞死亡是指有核细胞在一定条件下通过启动其内部机制,主要通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程。细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中的发生可能与以下因素有关：①活性氧大量生成：再灌注导致大量氧自由基释放,造成生物膜脂质过氧化、各种酶蛋白失活及DNA损伤；②细胞内钙超载：心肌缺血再灌注过程中,线粒体内Ca2+大量聚集,引起线粒体内膜上的通透性转换孔开放,释放细胞色素C入胞质内,进一步激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶诱致细胞凋亡。③线粒体损伤：在细胞凋亡期间,尽管线粒体能维持其超微结构的正常,但事实上其功能已经发生显着改变,如线粒体内膜通透性增大,线粒体内膜的跨膜电位下降,能量合成水平显着降低。上述因素并不能直接引起细胞凋亡,而是通过一定的信号传递方式激活生存或死亡相关基因,然后将信号传递到核内切酶,而执行死亡的功能。因此阻断心肌缺血再灌注损伤中心肌细胞凋亡的信号转导能够阻止凋亡程序的执行,减少心肌细胞凋亡,防治心肌缺血再灌注损伤。酸枣仁是鼠李科植物酸枣（Ziziphus psinosa Hu）的干燥成熟种子,具有敛汗,养肝,宁心安神等多种功效。酸枣仁主要含有多种酸枣仁皂苷类等化合物。酸枣仁皂苷是酸枣仁的水溶性成分,酸枣仁皂苷A是其中的主要有效成份之一。研究发现,酸枣仁提取物具有调脂、降压、抗动脉粥样硬化、抗心律失常、抗心肌缺血、抗心肌细胞缺氧-复氧损伤作用。酸枣仁皂甙A具有抑制血管平滑肌细胞过度增殖而抗动脉粥样硬化,同时对脑缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡有明显的抑制作用,但是目前对于其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制尚未报道。二、研究方法目的：在整体水平,我们采用建立大鼠在体心肌缺血再灌注模型模拟急性心肌梗死后再灌注损伤的病理生理变化,酸枣仁皂苷A于造模前腹腔注射给药干预,旨在观察其抗细胞凋亡、保护心肌等作用,并进一步探明其作用机制（主要是其对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-、Caspase-3和CytC的影响）；在细胞水平,采用过氧化氢损伤原代大鼠心肌细胞建立氧化损伤模型,酸枣仁皂苷A预处理后观察其对心肌细胞形态及细胞凋亡的影响,探明其抑制细胞凋亡的作用机制（主要是与PKCε信号转导通路的关系）,为临床上有效防治心肌缺血再灌注损伤提供新思路。本课题分三个部分进行：第一部分酸枣仁皂苷A预处理对大鼠缺血再灌注是否有保护作用,重点观察其抗氧化作用及其对心肌组织结构、心肌损伤标志物、再灌注心律失常及心功能的影响；第二部分酸枣仁皂苷A预处理对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响,从蛋白质水平观察酸枣仁皂苷A的抗凋亡作用,并探求其作用机制；第三部分观察酸枣仁皂苷A对过氧化氢诱导新生大鼠心肌细胞凋亡及PKCε表达的影响,进一步明确其作用机制。研究方法：第一部分：采用结扎（15 min）和松开（30 min）左冠状动脉前降支（LAD）的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型。44只雄性wistar大鼠随机分为4组,分别为假手术组（n=8）、模型组（n=12）、酸枣仁皂甙A组（n=12）及表没食子儿茶素没食子酸酯组（n=12）。酸枣仁皂苷A组及EGCG组的给药剂量均为20mg·kg-1·d-1,假手术组和模型组给予等体积的生理盐水,均为腹腔注射,连续用药3d,末次给药30min后进行造模。Ⅱ导联心电图观察再灌注30min期间心律失常的发生情况,根据Roringerova T方法进行室性心律失常（ventricular arrhythmias, VA）评分,Medlab6.0生物信号采集处理系统监测左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、收缩期左心室内压上升的最大变化速率（+dp/dtmax）、舒张期左心室内压下降的最大变化速率（-dp/dtmax）分别在缺血前、缺血15min、再灌注15、30min时的变化。标本收集：实验结束时腹主动脉采血,同时在心底部将心脏与大血管及组织离断,取出心脏,去除左右心房及右心室,心肌置入冰生理盐水中冲洗3次,将左心室分离为三部分,一部分用精密电子天平称取记录质量,剪碎匀浆,作为SOD、MDA检测用,一部分放入4%多聚甲醛中固定,作为组织切片备用,以观察心肌组织病理结构,另一部分放入-80℃冰箱中保存备；血液室温静放30min,在4℃离心后,取其上清置-80℃冰箱保存,检验肌酸磷酸激酶（CK）及乳酸脱氢酶（LDH）水平。第二部分：40只雄性wistar大鼠随机分为4组,每组10只,分别为假手术组、模型组、酸枣仁皂甙A组及表没食子儿茶素没食子酸酯组,其余同第（?）部分。以末端脱氧核昔酸转移酶（TdT酶）介导的脱氧三磷酸尿昔（dUTP）缺口末端标记法（TdT-mediated du Tpniekend labeling, TUNEL）检测凋亡心肌细胞,计算细胞凋亡指数（apoptotic index, AI）;取出-80℃冰箱中保存的部分心肌,提取蛋白及定量后,采用蛋白印迹法检测Bax、CytC及Bcl-2表达,采用分光光度法检测caspase-3的活性。第三部分：采用差速贴壁法分离培养Wistar新生乳鼠心肌细胞,以过氧化氢作用心肌细胞建立氧化损伤模型,将培养72 h的原代心肌细胞,选择搏动良好、生长密度无明显差异的细胞按孔随机分为以下4组：①对照组：细胞培养过程中不给予任何处理；②模型组：心肌细胞培养基中加终浓度为500μmol/L过氧化氢作用4h；③酸枣仁皂苷A治疗组：操作同模型组,但在给予H202前加入酸枣仁皂苷A至终浓度为20mg/l干预24小时；④PKC抑制剂组（JA+Chelerythrine）:操作同治疗组,但在给予H202前5min加入Chelerythrine至终浓度5umol/L。倒置显微镜观察心肌细胞形态学和搏动频率的变化；四唑盐（MTT）比色法检测心肌细胞活力；流式细胞仪检测细胞凋亡率；采用分光光度法检测caspase-3的活性；蛋白印迹检测CtyC及PKCε表达。统计分析：实验数据采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料数据以x±s表示。对数据进行方差齐性检验。多组数据间比较采用单因素方差分析处理,方差齐性时两两比较采用LSD法；方差不齐时,多组数据间比较采用Welch法,两两比较采用Games-Howell法。各实验组缺血前及缺血再灌注不同时间点心功能指标采用重复测量方差分析。检验显着性水准α=0.05。结果：第一部分：1、大鼠心肌组织病理形态学HE染色光镜下观察显示,假手术组大鼠心肌细胞形态规则、排列整齐,肌纤维完整,未见心肌细胞水肿、变性、坏死,未见中性粒细胞浸润。模型组心肌细胞排列紊乱,局部肌纤维横纹消失,肿胀明显,较多的中性粒细胞浸润。酸枣仁皂苷A治疗组可见心肌细胞水肿及中性粒细胞浸润,但都较模型组轻,心肌受损程度有所下降；EGCG组心肌组织病理形态学变化与酸枣仁皂苷A治疗组相似。2、缺血再灌注对大鼠LDH、CK、SOD及MDA的影响再灌注结束后检测各组LDH、CK、SOD及MDA值。结果显示,I/R组、JA组、EGCG组的LDH及CK值均较Sham组明显增高（P<0.01）；各组SOD值均显着降低,与Sham组比较有显着性差异（P<0.01）；各组MDA值均显着增高,与Sham组相比有显着性差异（P<0.01）。表明缺血再灌注可造成心肌严重损伤,证实心肌缺血再灌注模型构建成功。3、酸枣仁皂甙A对缺血再灌注大鼠LDH、CK、SOD及MDA的影响经统计学检验,各组间LDH、CK、SOD及MDA的水平均有显着差异（LDH:F=69.104, P=0.000; CK:F=143.320, P=0.000; SOD:F=101.844, P=0:000; MDA:F=212.780,P=0.000）。JA和EGCG均可明显抑制再灌注所导致的LDH、CK、MDA的升高,同时显着增加SOD的活性,与I/R组相比有显着性差异（P<0.01）；上述指标在JA组与EGCG组间无统计学差异（P>0.05）,表明JA和EGCG均具有抗氧化作用而减轻心肌缺血再灌注损伤。4、再灌注心律失常44只大鼠中12只被排除,剩余32只中26只发生心律失常,心律失常多出现于再灌注早期,包括室性早博、室性心动过速和心室纤颤等；假手术组仅有偶发室性早搏,未见其他类型心律失常。模型组均出现严重的心律失常,以频繁室速、室颤为主,伴有少量的房室传导阻滞,其中2只大鼠因为室颤而死亡。经统计学检验,各组间心律失常评分差异显着（F=44.699,P=0.000）。与假手术组比较,模型组心律失常评分显着上升,差异具有统计学意义（P=0.000）。酸枣仁皂苷A治疗组也出现了心律失常,以室早及室速为主,与模型组比较心律失常评分显着下降（P=0.005）。EGCG组的心律失常以室早及阵发室速为主,与酸枣仁皂苷A组比较,心律失常评分无显着性差异（P=0.080）。5、心功能指标各组缺血前的LVSP、LVEDP和±dp/dtmax差异无统计学意义（P>0.05）。缺血再灌注时各组间大鼠左室收缩末压（LVSP）由高到低依次为Sham组、EGCG组、酸枣仁皂苷A组及I/R组；等容收缩期左心室最大上升速率（+dp/dtmax）及等容舒张期左心室下降最大速率（-dp/dtmax）由高到低依次为Sham组、酸枣仁皂苷A组、EGCG组及I/R组；左室舒张末压（LVEDP）由低到高依次为Sham组、EGCG组、酸枣仁皂苷A组及I/R组。经统计学分析,缺血再灌注时个组间LVSP. +dp/dtmax、-dp/dtmax、LVEDP差异均有统计学意义（P<0.01）。不同缺血再灌注时间点检测结果表明,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax随着时间延长而降低,LVEDP随着时间延长而升高,差异有统计学意义（P<0.01）。各时间点与组别间有交互作用（P<0.01）。以上结果表明缺血再灌注可导致心脏收缩及舒张功能受损,酸枣仁皂苷A可改善大鼠收缩及舒张功能。第二部分：1、各组心肌组织TUNEL结果按试剂盒提供的脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法原位检测凋亡细胞。正常心肌细胞核呈蓝色；凋亡心肌细胞核呈深浅不一的棕褐色。经统计学检验,各组间AI差异显着（F=198.001,P=0.000）. I/R组AI为（18.14±2.22）%,JA和EGCG预处理后AI显着下降（P<0.01）；与Sham组比较,JA组和EGCG组中AI显着升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。2.Western bloting检测各组大鼠心肌Bcl-2、Bax及细胞色素C的表达通过分析目的条带的光密度值（IOD）发现,各组间Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax及细胞色素C的表达均有显着差异（Bcl-2:F=222.463,P=0.000；Bax:F=82.507,P=0.000；Bcl-2/Bax:F=231.350,P=0.000；细胞色素C：F=96.916,P=0.000）。在Sham组中心肌组织有一定量的Bcl-2及Bax表达,胞浆中细胞色素C的含量极少,I/R组心肌Bcl-2蛋白表达显着减少（P=0.000）,而Bax及胞浆中细胞色素C蛋白表达显着增加,Bcl-2/Bax比值显着降低（P<0.01）；JA组和EGCG组中Bax及胞浆中细胞色素C表达较I/R组显着下降（P<0.01）,但Bcl-2的表达较I/R组显着升高（P<0.01）, Bcl-2/Bax比值显着高于I/R组（P<0.01）。JA组与EGCG组中的Bcl-2、Bax、胞浆中CytC表达及Bcl-2/Bax比值无显着性差异（P>0.05）；此两组中Bax表达与Sham组比较无显着性差异（P>0.05）,Bcl-2、胞浆中CytC表达及Bcl-2/Bax比值与Sham组比较有显着性差异（P<0.01）。3、各组caspase-3活性检测结果caspase-3活性测定显示,各组间caspase-3活性差异显着（F=39.663,P=0.000）。正常心肌细胞的caspase-3活性水平很低,在体缺血15分钟,再灌注30分钟后心肌caspase-3的活性显着升高（P=0.000）；经过JA及EGCG预处理后心肌caspase-3的活性显着减少（P<0.01）,但JA组与EGCG组的caspase-3活性间无显着性差异（P=0.817）。第三部分：1、各组心肌细胞形态学观察倒置显微镜下观察,正常心肌细胞从72h起细胞成单层成簇生长,心肌细胞核折光性好,伪足饱满并相互连接,生长呈半融合状态,搏动明显,节律一致,60～80次/min；模型组细胞核暗淡,伪足显着变细,细胞间连接明显减少,搏动节律减慢,20～30次/min；与模型组比较,酸枣仁皂苷A治疗组心肌细胞形态明显改善,细胞核折光性较好,伪足略变细,搏动有力,节律一致,50～60次/min；与酸枣仁皂苷A治疗组比较,P.KC抑制剂组心肌细胞细胞核折光性较差,伪足变细,细胞间连接减少,搏动节律减慢,30～40次/min。2、各组心肌细胞活力与细胞凋亡的结果经统计学检验,各组间心肌细胞活力、细胞凋亡差异显着（心肌细胞活力：F=87.752,P=0.000；细胞凋亡：F=657.061,P=0.000）。与对照组比较,模型组心肌细胞活力显着降低（P=0.000）,细胞凋亡率则显着增加（P=0.000）；与模型组比较,JA组心肌细胞活力显着增加（P=0.000）,细胞凋亡率则显着降低（P=0.000）；与JA组比较,PKC抑制剂组心肌细胞活力显着降低（P=0.008）,细胞凋亡率则显着增加（P=0.000）。3、Western blot检测各组心肌细胞CtyC及PKCε的表达情况经统计学检验,各组间CtyC及PKCε的表达差异显着（CtyC:F=210.511,P=0.000; PKCε: F=42.589, P=0.000）。与对照组比较,模型组胞浆中细胞色素C显着增多（P=0.000）, PKCε表达无显着性差异（P=0.235）；JA预处理后,细胞色素C表达显着减少（P=0.000）, PKCε表达显着升高（P=0.000）；与JA组比较,PKC抑制剂组胞浆中细胞色素C显表达显着增多（P=0.000）, PKCε表达显着降低（P=0.000）。4、各组caspase-3活性检测经统计学检验,各组间caspase-3活性差异显着（F=663.629,P=0.000）。与对照组比较,模型组Caspase-3的活性显着增加（P=0.000）；与模型组比较,JA组的Caspase-3活性显着降低（P=0.000）; Chelerythrin干预后,Caspase-3活性显着升高（P=0.000）。结论：1、本实验通过在体大鼠心肌缺血/再灌注模型,证实了心肌缺血/再灌注可导致心肌损伤,酸枣仁皂苷A预处理可以减轻心肌的损伤,降低LDH、CK、MDA值,升高SOD值,减少再灌注心律失常,改善心功能。2.心肌缺血/再灌注和过氧化氢损伤可以引起心肌细胞凋亡,酸枣仁皂苷A预处理可以减少心肌细胞凋亡。因此酸枣仁皂苷A可减轻心肌缺血再灌注损伤,与其抑制心肌细胞凋亡有关。3.酸枣仁皂苷A预处理可以上调Bcl-2、下调Bax蛋白表达,升高Bcl-2/Bax比值,抑制细胞色素C从线粒体中的释放,减少caspase-3在心肌组织中活性从而减少心肌细胞凋亡。4.PKC是预适应机制的重要环节,酸枣仁皂苷A预处理可增强心肌细胞膜PKCε的蛋白表达,经Chelerythrine处理后,酸枣仁皂苷A预处理的保护作用显着减弱,因此PKCε的信号转导途径是酸枣仁皂苷A抑制心肌细胞凋亡的关键环节。
彭泽胄[8]（2010）在《不同时相力竭运动对大鼠心肌TNF-a、ICAM-1及ADAMTS-1的影响》文中提出研究目的:探讨力竭后心肌TNF-a、ICAM-1和ADAMTS-1表达的时相性变化特点及规律,试图揭示运动性心肌微损伤的病理过程与发生机制。研究方法:本研究采用大鼠力竭游泳运动建立的运动性心肌微损伤实验动物模型,100只健康成年雄性SD大鼠,分为一次力竭游泳运动组（n=40）、2周反复力竭游泳运动组（n=40）及相应对照组（n=20）,分别于力竭运动后0、6、12及24小时取材,应用免疫荧光技术和图像分析方法研究大鼠心肌TNF-a、ICAM-1、ADAMTS-1含量的变化。研究结果:1、两种力竭运动后,大鼠心肌TNF-a表达上升,运动后6小时后达到峰值,蛋白含量变化呈先上升后下降的趋势;各时相组大鼠心肌各部位TNF-a含量与对照组相比均存在显着性差异（p<0.01）;比较两种力竭运动后TNF-a表达趋势和含量发现,反复力竭后大鼠心肌TNF-a蛋白表达速率要快于一次力竭运动,但一次力竭后心肌TNF-a的表达量要高于反复力竭组（p<0.05）;比较不同部位TNF-a的蛋白含量发现,一次力竭后左心室TNF-a含量要高于室间隔和右心室（p>0.05）,反复力竭后右心室TNF-a含量高于左心室和室间隔（p>0.05）。2、两种力竭运动后,大鼠心肌ICAM-1表达上升,运动后6小时后达到峰值,蛋白含量变化呈先上升后下降的趋势;除反复力竭后24小时组室间隔和右心室ICAM-1蛋白含量与对照组无显着性差异（P>0.05）,其他各时相组与对照组相比均有不同程度的升高（P<0.01）;比较两种力竭运动后ICAM-1蛋白的表达趋势和含量发现,反复力竭运动组ICAM-1蛋白表达速率快于一次力竭组,一次力竭后左心室ICAM-1含量高于反复力竭组（P>0.05）,反复力竭组室间隔和右心室ICAM-1含量分别高于一次力竭组（P>0.05,p<0.01）。3、两种力竭运动后,大鼠心肌ADAMTS-1快速表达,运动后即刻达到峰值,随后一直呈下降趋势;除反复力竭后12小时组和24小时组与对照组无显着性差异（P>0.05）,其余各时相组均显着高于对照组（P<0.01）;比较两种力竭运动后ADAMTS-1蛋白的表达趋势和含量发现,一次力竭组ADAMTS-1蛋白表达速率快于反复力竭组,且一次力竭后心肌ADAMTS-1的表达量要显着高于反复力竭组（P<0.01）;比较不同部位ADAMTS-1的蛋白含量发现,两种力竭运动后左心室ADAMTS-1含量均显着高于室间隔和右心室（P<0.01）。结论:1、不同力竭运动后心肌TNF-a蛋白表达上调,反复性力竭运动后心肌TNF-a的时相性变化稍快于一次力竭运动,提示反复力竭运动造成的心机损伤程度要大于一次力竭运动。TNF-a作为炎症反应的起始因子,介导炎症细胞的浸润直接损害心肌细胞,还可以介导其他细胞因子加剧心肌细胞的损伤,这可能是炎症反应造成心肌损伤的始动因素。2、两种力竭运动后心肌ICAM-1蛋白表达有相似的变化规律,但反复力竭后心肌ICAM-1的时相性变化要提前于一次力竭运动,提示反复力竭后ICAM-1介导炎性细胞的黏附要快于一次力竭组;力竭运动后,ICAM-1的表达含量与TNF-a表达呈正比,提示在TNF-a的刺激下,ICAM-1快速表达,早期参与炎性因子与心肌细胞的粘附和浸润等炎症反应,构成运动性心肌微损伤的重要机制之一。3、不同力竭运动后心肌ADAMTS-1表达均在即刻快速表达并达到峰值,通过降解细胞外基质蛋白,使心肌纤维化;同时抑制血管生长,促进动脉粥样硬化的形成,同样构成运动性心肌微损伤发生的重要机制之一。4、不同力竭运动对大鼠心肌各部位的损伤程度不一,从三个因子的表达量来看,一次力竭运动后左心室的表达含量高于室间隔和右心室,可能是左室室壁较厚,心肌细胞数量大于右室和室间隔,相对表达量较高;而反复力竭运动后室间隔和右心室的表达量要高于左心室,认为右心室和室间隔壁较薄、细胞数量较少,重量较轻的结构特点,造成在同等容量负荷过重的条件下,右室较左室承受的应力大,更易受损。
张德重[9]（2008）在《缺血后处理对家兔窦房结功能及细胞凋亡的影响》文中研究表明自从1986年Murry等提出心肌缺血预处理（ischemic preconditioning,IPC）这一概念后,作为一种内源性心脏防御作用受到临床医生的关注。近年来,有学者提出缺血后处理（ischemic postconditioning）的概念,即在全面恢复再灌注前短暂多次预再灌、停灌处理,其心肌保护效应与IPC相似,且比IPC更具有临床可操作性,因此具有更广泛的临床应用价值。缺血后处理能明显减轻再灌注损伤（reperfusion injury,RI）,即再灌注过程中组织细胞功能代谢障碍及结构破坏。大量的实验表明缺血后处理的保护作用普遍存在于不同种属的不同组织和器官中。其中有关心肌细胞的研究主要集中在普通心肌,本实验将目光转向心脏传导系统中电生理冲动形成、发起单位—窦房结（sinoatrial node,SAN）,从电生理功能和组织形态学两方面探讨缺血后处理对窦房结的保护作用。目的在家兔急性右冠状动脉缺血再灌注模型中,观察缺血预处理与缺血后处理对窦房结传导时间、窦房结恢复时间及窦房结细胞凋亡和Bcl-2、Bax基因蛋白表达的影响。方法采用在体家兔右冠状动脉缺血再灌注模型。选用健康家兔32只,雌雄不拘,随机分为对照组、缺血再灌注组（IR组）、缺血预处理组（IPC组）、缺血后处理组,每组8只。在心肌缺血期及再灌注期不同时间点测定各组窦房结传导时间（sinoatrial node conduction time,SACT）、窦房结恢复时间（sinoatrial node recovery time,SNRT）。实验结束后剪取窦房结组织,采用原位末端标记法测定窦房结细胞凋亡数目,免疫组化检测Bcl-2基因蛋白和Bax基因蛋白的表达。结果1.窦房结功能测定与对照组比较,IR组、IPC组、缺血后处理组在心肌缺血期及再灌注期SACT、SNRT均显着延长（P<0.01）;IPC组在心肌缺血期及再灌注期SACT、SNRT较IR组均明显缩短（P<0.01）;缺血后处理组在心肌再灌注期SACT、SNRT较IR组明显缩短（P<0.01）;与IPC组比较,缺血后处理组心肌缺血期SACT、SNRT明显缩短（P<0.01）,而在心肌再灌注期两组SACT、SNRT无明显差异（P>0.05）。2.窦房结细胞凋亡和Bcl-2、Bax基因蛋白表达与对照组比较,IR组、IPC组、缺血后处理组窦房结细胞凋亡数目、Bcl-2和Bax基因蛋白表达均显着升高（P<0.01）;IPC组、缺血后处理组与IR组比较,窦房结细胞凋亡数目显着减少（P<0.01）,Bcl-2基因蛋白表达显着提高（P<0.01）,Bax基因蛋白表达显着降低（P<0.01）;IPC组与缺血后处理组比较,在窦房结细胞凋亡数目及Bcl-2、Bax基因蛋白表达均无显着性差异（P>0.05）。结论1.缺血后处理与缺血预处理对在体家兔窦房结电生理功能的恢复有益。2.缺血再灌注损伤可诱导窦房结细胞凋亡。3.缺血后处理、缺血预处理可通过提高Bcl-2基因蛋白表达同时下调Bax基因蛋白表达从而减少窦房结细胞凋亡。4.缺血后处理与缺血预处理对在体家兔窦房结均有保护作用。
谭双,刘如秀[10]（2008）在《窦房结缺血再灌注的细胞凋亡研究进展》文中认为病态窦房结综合征是临床常见病,其发病机制目前尚不完全清楚。鉴于该病常伴随缺血性心脏病而出现,故窦房结缺血再灌注诱导细胞凋亡可能为其原因之一。在窦房结的发育、成熟过程中,凋亡不足可留下引发心律失常的基础,凋亡过度可引起病态窦房结综合征等病变。采用抑制窦房结病理性细胞凋亡的措施,可望为临床防治病态窦房结综合征提供新的方法。中药具有效果明显,副作用小的优点,如何利用中药来诱导机体产生内源性心脏保护作用是现代中医面临的一个崭新课题。
二、缺血再灌注对在体兔窦房结细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、缺血再灌注对在体兔窦房结细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响（论文提纲范文）
（1）基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制（论文提纲范文）
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| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 病态窦房结综合征研究现状 |
| 1.1.1 病态窦房结综合征的发病机制研究 |
| 1.1.2 SSS的分型与临床表现 |
| 1.1.3 SSS的西医治疗 |
| 1.1.4 SSS的中医学研究现状 |
| 1.2 麻黄附子细辛汤研究现状 |
| 1.2.1 麻黄附子细辛汤的现代药理作用研究 |
| 1.2.2 麻黄附子细辛汤在SSS治疗中的应用 |
| 1.3 网络药理学简介及其在中医药研究中的应用 |
| 1.3.1 网络药理学概述 |
| 1.3.2 网络药理学常用数据库及研究方法 |
| 1.3.3 网络药理学与中医药研究 |
| 第二章 基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制 |
| 2.1 数据收集与研究方法 |
| 2.1.1 流程图 |
| 2.1.2 数据收集 |
| 2.1.3 网络构建与分析 |
| 2.1.4 分子对接验证 |
| 2.1.5 靶点通路注释分析 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.2.1 构建麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集 |
| 2.2.2 构建SSS相关的疾病靶点数据集 |
| 2.2.3 麻黄附子细辛汤化学成分潜在靶点与SSS相关靶点的交集基因 |
| 2.2.4 麻黄附子细辛汤-化学成分-靶点-SSS网络及显效成分 |
| 2.2.5 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键化学成分和核心靶点 |
| 2.2.6 分子对接结果 |
| 2.2.7 靶点通路注释分析 |
| 2.3 分析与结论 |
| 2.3.1 麻黄附子细辛汤治疗SSS的显效成分分析 |
| 2.3.2 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键成分和核心靶点分析 |
| 2.3.3 靶点通路注释分析 |
| 2.3.4 结论 |
| 2.3.5 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）Notch3通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α轴调节心脏成纤维细胞增殖、凋亡及向肌成纤维细胞转化（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验设计 |
| 1 原代乳鼠心脏成纤维细胞的提取及实验分组 |
| 2 Notch调节心脏成纤维细胞活性 |
| 3 Notch3 调节RhoA/ROCK/Hif1α信号轴的功能 |
| 4 Notch3 通过RhoA/ROCK/Hif1α信号轴调节心脏成纤维细胞活性 |
| 5 Notch3 通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α信号通路改善心肌梗死后心肌纤维化 |
| 实验材料与方法 |
| 1 实验准备 |
| 2 主要材料和仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1 心脏成纤维细胞鉴定结果 |
| 2 转染效率检测 |
| 3 Notch3抑制心脏成纤维细胞增殖 |
| 4 Notch3促进心脏成纤维细胞凋亡 |
| 5 Notch3抑制心脏成纤维细胞表型转化 |
| 6 Notch3 调节心脏成纤维细胞中Hif1α,RhoA/ROCK的表达 |
| 7 Hif1α抑制剂和稳定剂效果检测 |
| 8 Hif1α抑制剂可以逆转Notch3 干扰引起的效应 |
| 9 DMOG逆转Notch3 过表达诱导的细胞凋亡增加 |
| 10 Notch3 通过RhoA/ROCK/Hif1α发挥作用 |
| 11 Ad-N3ICD在心肌组织中成功过表达 |
| 12 Notch3抑制心肌梗死后心肌纤维化,改善心肌梗死后心功能 |
| 13 Notch3 通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α信号通路发挥抗纤维化作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 心血管系统的重要调控者:Notch信号通路 |
| 1 Notch与先天性心脏病 |
| 2 Notch与心血管系统发育 |
| 3 Notch与动脉粥样硬化 |
| 4 Notch与心肌缺血 |
| 5 Notch与心肌纤维化 |
| 6 Notch与钙化性主动脉瓣疾病 |
| 7 Notch与心律失常 |
| 8 Notch与高血压 |
| 参考文献 |
| Hif1α与心血管疾病的关系及其他信号通路相互作用 |
| 1 Hif1α与心血管疾病 |
| 2 Hif1α和其他信号通路的交叉 |
| 3 总结 |
| 参考文献 |
| 在读期间参与课题 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）三苦滴丸对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1 心肌缺血再灌注损伤的西医机制及治疗 |
| 1.1 MIRI的病因学 |
| 1.2 MIRI 的机制 |
| 1.3 MIRI的风险因素 |
| 1.4 当前和潜在的治疗方法 |
| 2 心肌缺血再灌注损伤的中医医治源流 |
| 2.1 概念及历史沿革 |
| 2.2 病因病机 |
| 2.3 辨证治疗 |
| 3 关于三七苦碟子的研究进展 |
| 3.1 三七 |
| 3.2 苦碟子 |
| 实验研究 |
| 第一部分 三苦滴丸预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物制备 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 灌胃药液的制备 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 动物模型制作及样本获取 |
| 2.4 大鼠心功能的监测 |
| 2.5 缺血再灌注后心肌梗死面积的测定 |
| 2.6 HE染色观察心肌组织形态学变化 |
| 2.7 LD-L微板法测定LDH水平 |
| 2.8 赖氏微板法检测AST水平 |
| 2.9 双抗体两步夹心酶联免疫吸附法测定CKMB水平 |
| 2.10 硫代巴比妥酸显色法测定MDA含量 |
| 2.11 黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定SOD活力 |
| 2.12 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般情况 |
| 3.2 SK对心功能的影响 |
| 3.3 SK对缺血再灌注损伤后心肌梗死面积的影响 |
| 3.4 大鼠心肌组织病理形态学 |
| 3.5 缺血再灌注模型构建及各组对大鼠LDH、AST、CKMB、SOD及MDA的影响 |
| 3.6 SK对缺血再灌注大鼠LDH、AST、CKMB、SOD及MDA的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 三苦滴丸预处理对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物制备 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型制作及样本获取 |
| 2.2 TUNEL法检测凋亡心肌细胞 |
| 2.3 Caspase-3活性的检测 |
| 2.4 心肌组织Bax、Bcl-2的western blot检测 |
| 2.5 免疫组织化学法检测CytC的表达 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般情况 |
| 3.2 各组心肌组织TUNEL检测结果 |
| 3.3 Western bloting检测各组大鼠心肌Bcl-2、Bax的表达 |
| 3.4 各组CytC的表达 |
| 3.5 各组caspase-3蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（4）缺血再灌注条件下乳兔窦房结细胞HCN4表达变化及对起搏电流的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 缺血、缺血再灌注损伤的窦房结细胞模型 |
| 1.3 窦房结细胞HCN4基因转录的RT-PCR/RT-qPCR检测 |
| 1.4 HCN4蛋白表达的Western blot检测 |
| 1.5 CCK-8检测窦房结细胞活力 |
| 1.6 流式细胞技术检测窦房结细胞凋亡 |
| 1.7 全细胞膜片钳记录 |
| 1.8 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺血再灌注对原代乳兔窦房结细胞HCN4表达的影响 |
| 2.2 缺血再灌注对窦房结细胞增殖活力的影响 |
| 2.3 缺血再灌注对窦房结细胞凋亡的影响 |
| 2.4 缺血再灌注对窦房结细胞If电流的影响 |
| 3 讨论 |
（5）猪心脏移植供心冷保存的研究及评价体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 缺血再灌注损伤 |
| 1.2 供心保存方法 |
| 1.2.1 单纯低温保存 |
| 1.2.2 连续灌注保存 |
| 1.2.3 间断灌注保存 |
| 1.2.4 高压混合气体干燥保存 |
| 1.3 RNA干扰与器官IRI |
| 1.3.1 RNAi的机理 |
| 1.3.2 介导基因沉默效应的其他手段 |
| 1.3.3 介导RNAi的方法 |
| 1.3.4 RNAi疗法面临的挑战 |
| 1.3.5 RNAi在不同器官抗IRI的应用 |
| 1.3.6 siRNA疗法在IRI的发展前景及应用中的难点 |
| 1.4 哺乳动物心脏模型 |
| 1.4.1 离体心脏模型 |
| 1.4.2 心脏移植模型 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第二章 靶基因SIRNA序列的设计及效果验证 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要软件 |
| 2.2.4 siRNA的设计与合成 |
| 2.2.5 溶液配制 |
| 2.2.6 细胞培养 |
| 2.2.7 细胞转染 |
| 2.2.8 总RNA提取及反转录 |
| 2.2.9 Real Time qPCR |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Real Time qPCR结果 |
| 2.3.2 siRNA序列筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 SIRNA心肌保存液的研制及其对冷保存猪心的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂与耗材 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要软件 |
| 3.2.4 试验动物及分组 |
| 3.2.5 溶液配制 |
| 3.2.6 动物麻醉及手术 |
| 3.2.7 蛋白提取及浓度测定 |
| 3.2.8 Western Blot |
| 3.2.9 石蜡切片制作 |
| 3.2.10 TUNEL |
| 3.2.11 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 含TR的 siRNA保存液对冷保存供心靶基因的抑制效率 |
| 3.3.2 含TR的 siRNA保存液对冷保存供心细胞凋亡的作用 |
| 3.3.3 含TR保存液中siRNA最佳剂量的探索 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 大动物供心保存评价体系的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂与耗材 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要软件 |
| 4.2.4 评价平台—大动物离体心灌流系统 |
| 4.2.5 评价平台—心脏原位移植模型 |
| 4.2.6 评价指标—左心室血流动力学 |
| 4.2.7 评价指标—心肌生存率 |
| 4.2.8 评价指标—心肌组织结构改变 |
| 4.2.9 评价指标—心肌坏死和氧化应激 |
| 4.2.10 评价指标—先天免疫激活和炎症水平 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 评价平台—大动物离体心灌流系统 |
| 4.3.2 评价平台—心脏原位移植模型 |
| 4.3.3 评价指标 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 SIRNA心肌保存液对离体复跳猪心的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与耗材 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 主要软件 |
| 5.2.4 试验动物及分组 |
| 5.2.5 溶液配制 |
| 5.2.6 动物麻醉及供心获取 |
| 5.2.7 离体供心的再灌注复跳 |
| 5.2.8 心肌坏死和氧化应激指标检测 |
| 5.2.9 蛋白提取 |
| 5.2.10 Western Blot |
| 5.2.11 石蜡切片制作 |
| 5.2.12 TUNEL |
| 5.2.13 HE染色 |
| 5.2.14 血流动力学监测 |
| 5.2.15 统计学方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 siRNA保存液对离体复跳心左心室血流动力学指标的影响 |
| 5.3.2 siRNA保存液对离体复跳心组织生存率的作用 |
| 5.3.3 siRNA保存液对离体复跳心心肌组织结构改变的影响 |
| 5.3.4 siRNA保存液对离体复跳心生化指标的影响 |
| 5.3.5 siRNA保存液对离体复跳心先天免疫及炎症反应的影响 |
| 5.3.6 siRNA保存液对离体复跳心靶基因的抑制效果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 siRNA保存液促进心功能的恢复 |
| 5.4.2 siRNA保存液抗凋亡效果显着 |
| 5.4.3 siRNA保存液减轻了心肌结构改变 |
| 5.4.4 siRNA保存液减少了心肌坏死和氧化应激 |
| 5.4.5 siRNA保存液的安全性和抗炎作用 |
| 5.4.6 离体灌流猪工作心 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 SIRNA心肌保存液对原位移植猪心的作用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试剂与耗材 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 主要软件 |
| 6.2.4 试验动物及分组 |
| 6.2.5 溶液配制 |
| 6.2.6 动物麻醉及供心获取 |
| 6.2.7 原位心脏移植 |
| 6.2.8 血流动力学监测及样品采集 |
| 6.2.9 心肌坏死和氧化应激生化指标检测 |
| 6.2.10 蛋白提取 |
| 6.2.11 Western Blot |
| 6.2.12 石蜡切片制作及HE染色 |
| 6.2.13 TUNEL |
| 6.2.14 统计学方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 siRNA保存液对移植心血流动力学的影响 |
| 6.3.2 siRNA保存液对移植心组织生存率的作用 |
| 6.3.3 siRNA保存液对移植心心肌组织结构改变的作用 |
| 6.3.4 siRNA保存液对移植心心肌坏死和氧化应激生化指标的影响 |
| 6.3.5 siRNA保存液对移植心先天免疫及炎症反应的影响 |
| 6.3.6 siRNA保存液对移植心靶基因的抑制效果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 全文总结 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
（6）通阳活血方对受损兔窦房结细胞起搏电流电生理及信号转导机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药治疗病态窦房结综合征的概况 |
| 1 病因病机研究 |
| 2 治则治法研究 |
| 3 古方运用 |
| 4 自拟中药制剂 |
| 5 讨论 |
| 综述二 HCN4基因与心脏节律的关系 |
| 1 超极化激活阳离子通道4基因的电生理特性 |
| 2 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因与心脏节律发生、病变及预后的关系 |
| 3 中药对超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因的作用 |
| 4 问题与展望 |
| 实验研究 |
| 实验一 通阳活血方含药血清及原液对受损乳兔窦房结细胞起搏电流的对比研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 人参Rb1、黄芪甲苷对起搏电流(I_f)的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 通阳活血方对受损乳兔窦房结细胞起搏电流影响信号转导机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）酸枣仁皂苷A对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 酸枣仁皂苷A预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、结论 |
| 5、参考文献 |
| 第二部分 酸枣仁皂苷A预处理对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、结论 |
| 5、参考文献 |
| 第三部分 酸枣仁皂苷A预处理对过氧化氢诱导新生大鼠心肌细胞凋亡、PKCε表达的影响及机制研究 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、结论 |
| 5、参考文献 |
| 全文总结 |
| 英文缩略词表 |
| 成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（8）不同时相力竭运动对大鼠心肌TNF-a、ICAM-1及ADAMTS-1的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 运动性心肌微损伤的研究现状 |
| 1.1 力竭运动对心脏的影响 |
| 1.1.1 心脏形态结构 |
| 1.1.2 心脏功能 |
| 1.1.3 心脏代谢 |
| 1.1.4 心肌炎性因子 |
| 1.2 心肌微损伤的病理与发生机制 |
| 1.2.1 钙超载和氧自由基 |
| 1.2.2 能量代谢障碍 |
| 1.2.3 炎症反应 |
| 1.2.4 细胞凋亡 |
| 1.2.5 细胞结构蛋白的降解 |
| 1.2.6 血管内皮细胞功能障碍 |
| 2 运动对心肌损伤的最新研究进展 |
| 2.1 肿瘤坏死因子a(TNF-a)与心肌损伤 |
| 2.1.1 肿瘤坏死因子-a的分布、结构与功能 |
| 2.1.2 肿瘤坏死因子-a与心肌损伤的研究进展 |
| 2.2 细胞间粘附因子-1(ICAM-1)与心肌损伤 |
| 2.2.1 细胞间粘附因子-1 的分布、结构与功能 |
| 2.2.2 细胞间粘附因子-1 与心肌损伤的研究进展 |
| 2.3 基质金属蛋白新家族(ADAMTS-1)与心肌损伤 |
| 2.3.1 基质金属蛋白新家族(ADAMTS-1)的分布、结构与功能 |
| 2.3.2 基质金属蛋白新家族(ADAMTS-1)与心肌损伤研究进展 |
| 5 小结 |
| 实验研究 |
| 1 试验设计 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验方案 |
| 1.2.1 实验动物分组 |
| 1.2.2 运动环境条件 |
| 1.2.3 运动负荷安排 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠心肌取材 |
| 2.2 心肌冰冻切片的免疫荧光染色 |
| 2.2.1 ICAM-1 的免疫荧光染色 |
| 2.2.2 TNF-a和 ADAMTS-1 的免疫荧光染色 |
| 2.3 免疫荧光图像的采集和分析 |
| 2.3.1 图像采集 |
| 2.3.2 图像分析 |
| 2.4 实验主要使用仪器 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大鼠心脏形态肉眼观察 |
| 3.2 心系数的变化 |
| 3.3 大鼠心肌TNF-a免疫荧光观察 |
| 3.3.1 大鼠心肌TNF-a免疫荧光图像 |
| 3.3.2 一次力竭运动后大鼠心肌细胞内TNF-a蛋白表达的变化 |
| 3.3.3 反复力竭运动后大鼠心肌细胞内TNF-a蛋白表达的变化 |
| 3.3.4 两种不同力竭运动后左心室TNF-a含量比较 |
| 3.3.5 两种不同力竭运动后室间隔TNF-a含量比较 |
| 3.3.6 两种不同力竭运动后右心室TNF-a含量比较 |
| 3.4 大鼠心肌ICAM-1 免疫荧光观察 |
| 3.4.1 大鼠心肌ICAM-1 免疫荧光图像 |
| 3.4.2 一次力竭运动后大鼠心肌细胞内ICAM-1 蛋白表达的变化 |
| 3.4.3 反复力竭运动后大鼠心肌细胞内ICAM-1 蛋白表达的变化 |
| 3.4.4 两种不同力竭运动后左心室ICAM-1 含量比较 |
| 3.4.5 两种不同力竭运动后室间隔ICAM-1 含量比较 |
| 3.4.6 两种不同力竭运动后右心室ICAM-1 含量比较 |
| 3.5 大鼠心肌ADAMTS-1 免疫荧光观察 |
| 3.5.1 大鼠心肌ADAMTS-1 免疫荧光图像 |
| 3.5.2 一次力竭运动后大鼠心肌细胞内ADAMTS-1 蛋白表达的变化 |
| 3.5.3 反复力竭运动后大鼠心肌细胞内ADAMTS-1 蛋白表达的变化 |
| 3.5.4 两种不同力竭运动后左心室ADAMTS-1 含量比较 |
| 3.5.5 两种不同力竭运动后室间隔ADAMTS-1 含量比较 |
| 3.5.6 两种不同力竭运动后右心室ADAMTS-1 含量比较 |
| 4 分析讨论 |
| 4.1 实验动物模型的建立和目标因子的选定 |
| 4.2 力竭运动后大鼠心系数的变化 |
| 4.3 力竭运动后心肌TNF-a的变化特点与规律 |
| 4.4 力竭运动后心肌ICAM-1 的变化特点及规律 |
| 4.5 力竭运动后ADAMTS-1 的变化特点与规律 |
| 4.6 力竭运动后心肌TNF-a、ADAMTS-1和ICAM-1 变化在心肌微损伤过程中的功能意义 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（9）缺血后处理对家兔窦房结功能及细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 正文 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 正文 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、缺血再灌注对在体兔窦房结细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响（论文参考文献）
- [1]基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制[D]. 朱安娜. 河北大学, 2021(11)
- [2]Notch3通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α轴调节心脏成纤维细胞增殖、凋亡及向肌成纤维细胞转化[D]. 施建丽. 重庆医科大学, 2020(01)
- [3]三苦滴丸对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用及机制研究[D]. 孙野. 长春中医药大学, 2019(01)
- [4]缺血再灌注条件下乳兔窦房结细胞HCN4表达变化及对起搏电流的影响[J]. 滕林,曹春雨,周飞,姜玉蓉,陈万平,彭家芹,吴辉,李松,杨简,丁家望. 巴楚医学, 2018(02)
- [5]猪心脏移植供心冷保存的研究及评价体系的建立[D]. 魏嘉. 上海交通大学, 2018(01)
- [6]通阳活血方对受损兔窦房结细胞起搏电流电生理及信号转导机制研究[D]. 刘宇. 中国中医科学院, 2014(07)
- [7]酸枣仁皂苷A对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用及机制研究[D]. 黄宜生. 南方医科大学, 2011(04)
- [8]不同时相力竭运动对大鼠心肌TNF-a、ICAM-1及ADAMTS-1的影响[D]. 彭泽胄. 国家体育总局体育科学研究所, 2010(02)
- [9]缺血后处理对家兔窦房结功能及细胞凋亡的影响[D]. 张德重. 山西医科大学, 2008(S2)
- [10]窦房结缺血再灌注的细胞凋亡研究进展[J]. 谭双,刘如秀. 医学综述, 2008(01)