一、膜片钳技术在动脉粥样硬化研究中的应用（论文文献综述）
裴可[1]（2021）在《黄芪丹参及其组分配伍干预动脉粥样硬化的实验效应及其对周细胞炎症损伤的影响》文中提出目的:本课题构建动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型,观察黄芪丹参及组分配伍对各组小鼠主动脉斑块面积、血清血脂和炎性因子的表达及周细胞数量的影响,探讨黄芪丹参及其组分配伍对动脉粥样硬化的治疗作用。体外建立周细胞炎症损伤模型,研究Piezo1对YAP/JNK及炎性因子的调节作用和黄芪丹参组分配伍对炎性反应的缓解作用,以揭示黄芪丹参及其组分配伍通过抑制炎症反应拮抗动脉粥样硬化的内在作用机制和作用靶点。方法:1.黄芪丹参及其组分配伍对动脉粥样硬化ApoE-/-鼠血管斑块和炎性反应的影响采用高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠,构建动脉粥样硬化小鼠模型,运用黄芪丹参及其组分配伍干预ApoE-/-小鼠,具体分组为对照组（0.9%Na Cl）、模型组（0.9%Na Cl）、丹酚酸B组（Sal-B 30mg/kg）、黄芪甲苷组（AS-Ⅳ 20mg/kg）、黄芪丹参组分配伍组（Sal-B 30mg/kg+AS-Ⅳ 20mg/kg）、黄芪丹参免煎颗粒组（黄芪颗粒1.56g/kg+丹参颗粒0.78g/kg）和瑞舒伐他汀组（瑞舒伐他汀0.41g/kg）。利用大体油红O染色、HE染色和油红染色判定小鼠主动脉的动脉粥样硬化斑块面积,采用酶联免疫吸附测定法对小鼠血清进行炎性因子检测,采用免疫荧光双标染色周细胞,观察周细胞的数量。2.基于Piezo1/YAP/JNK信号轴探讨周细胞炎性反应的机制研究利用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导建立周细胞炎症损伤模型,将周细胞分为对照组（不加特殊处理因素）、模型组（50μg/m L ox-LDL）、si RNA组（25n M of si RNA+0.5 n M of lipo3000）和阴性对照组（25 n M negative control si RNA（NC si RNA）+0.5 n M lipo3000）。通过PCR和免疫荧光实验检测Piezo1在周细胞中的表达,观察Piezo1在对照组和模型组表达的差异。运用PCR、免疫荧光、钙内流实验和膜片钳技术检测周细胞中的Piezo1能否被成功敲减。细胞划痕实验、Transwell迁移实验检测不同组别周细胞的迁移能力。PCR、WB和免疫荧光技术测定不同组别周细胞Piezo1、YAP/TAZ及炎性因子（JNK、NF-κB、TNF-α）的表达水平。3.药物治疗对周细胞生物学功能和炎性反应及信号通路的影响利用黄芪丹参组分及其配伍干预周细胞炎症模型,将周细胞分为对照组（不加特殊处理因素）、模型组（50μg/m L ox-LDL）、si RNA组（50μg/m L ox-LDL+25 n M si RNA+0.5 n M lipo3000）、丹酚酸B组（50μg/m L ox-LDL+25μg/m L Sal-B）、黄芪甲苷组（50μg/m L ox-LDL+15μg/m L AS-Ⅳ）和黄芪丹参组分配伍组（50μg/m L ox-LDL+25μg/m L Sal-B+15μg/m L AS-Ⅳ）。细胞划痕实验、Transwell迁移实验观察黄芪丹参组分及其配伍对周细胞迁移能力的影响。结合PCR、WB和免疫荧光实验研究黄芪丹参组分及其配伍对Piezo1、YAP/TAZ和炎性相关标志物（JNK、NF-κB、TNF-α）的m RNA和蛋白表达的作用。以钙内流实验观测黄芪丹参组分及其配伍对钙离子内流的影响。并且在PCR、WB和免疫荧光实验中,检测黄芪丹参组分配伍结合Piezo1敲减的方法对于周细胞YAP/TAZ和炎性相关标志物表达水平的影响。结果:1.动物实验证实,黄芪丹参及组分配伍、黄芪丹参免煎颗粒组和瑞舒伐他汀组均能有效减少小鼠主动脉的动脉粥样硬化斑块面积,调节血脂水平,减轻炎性因子表达,其中黄芪丹参组分配伍的作用最为明显,能够显着拮抗动脉粥样硬化。对照组周细胞数量较多,模型组中周细胞的数量降低,而黄芪丹参及其组分配伍能够有效促进周细胞的增殖,因此本课题决定以周细胞作为细胞实验的研究对象。2.PCR和免疫荧光实验均证实了Piezo1可以在周细胞中表达,并且与对照组相比,模型组中Piezo1的表达升高。此外,通过PCR、免疫荧光、膜片钳技术和钙内流实验验证了周细胞中的Piezo1可以被成功敲减。Piezo1蛋白敲减后,细胞划痕实验、Transwell迁移实验证实,周细胞的迁移能力受损。PCR、WB和免疫荧光实验证实,与对照组相比,模型组YAP/TAZ及炎性因子的表达升高,而敲减Piezo1后,与模型组相比,Piezo1-si RNA组中Piezo1、YAP/TAZ及炎性因子的表达水平均见下降。3.细胞划痕实验、Transwell迁移实验证实黄芪丹参组分及其配伍能够提高周细胞的迁移能力,改善周细胞的生物学功能。PCR、WB和免疫荧光实验证实,与模型组相比,黄芪丹参组分配伍组能够显着降低Piezo1、YAP/TAZ和炎性相关标志物的m RNA和蛋白表达。并且钙内流实验证实,黄芪丹参组分配伍能够抑制钙离子内流。而在PCR、WB和免疫荧光实验中,采用黄芪丹参组分配伍结合Piezo1敲减的方法干预周细胞,发现黄芪丹参组分配伍结合Piezo1的蛋白敲除,能够进一步降低YAP/TAZ和炎性相关标志物的表达。结论:黄芪丹参及组分配伍通过干预周细胞Piezo1/YAP/JNK信号轴改善炎性反应,发挥抗动脉粥样硬化效应,从而为动脉粥样硬化药物的开发提供了新的方向。
李佳鑫[2]（2021）在《运动预适应对力竭大鼠心室肌钠离子流的作用及机制研究》文中认为目的:力竭运动造成心肌损伤,使心律失常发生率增加;运动预适应可增强心肌抗缺血缺氧的能力,从而产生对心脏的保护效应,并且可降低心律失常的发生率。故本研究通过构建力竭运动模型和运动预适应模型,比较运动预适应对大鼠心室肌细胞钠电流、NaV1.5通道蛋白门控效应及其相关调控蛋白的影响,探讨运动预适应降低心律失常发生的可能机制。方法:以健康雄性SD大鼠作为研究对象,并将其随机分为4组,分别为对照组（Ctrl）、运动预适应组（EP）、运动预适应+力竭组（EP+EE）、力竭组（EE）。其中EP组和EP+EE组大鼠以尾部负重3%体质量的方式进行3周的间歇性游泳运动;Ctrl组和EE组大鼠常规进食饲养3周,3周后,EP+EE组大鼠在最后一次运动预适应游泳后与EE组一样进行一次性负重3%体质量的力竭游泳运动。模型制备完成后,分别记录各组大鼠的心电图、采用ELISA法检测各组大鼠血清CK-MB和c Tn I浓度、采用膜片钳技术记录大鼠心室肌细胞钠通道电流并进一步分析NaV1.5门控效应、采用Western blot法检测各组大鼠心室肌细胞HIF-1α、SIRT1和钠通道蛋白NaV1.5的表达水平。结果:1.大鼠一般情况比较,Ctrl组大鼠皮毛顺滑有光泽,两目炯炯有神,体重自然增长;进行运动预适应的大鼠与Ctrl组相似,但体重增长较慢。每次运动预适应后会出现眼周充血,游泳结束后随即消失。2.与Ctrl组相比,EP+EE组及EE组的血清CK-MB和c Tn-I的浓度均显着升高（P<0.05）,差异有统计学意义;与EE组比较,EP+EE组和EP组大鼠血清CK-MB和c Tn-I浓度均显着降低（P<0.05）,差异有统计学意义;与EP组比较,EP+EE组大鼠CKMB和c Tn-I浓度均显着升高（P<0.05）,差异有统计学意义。3.在动物整体水平观察各组大鼠心电图变化。与Ctrl组相比,EP+EE组的大鼠QRS间期延长、PR间期延长、ST段抬高（P<0.05）;与Ctrl组相比,EE组QRS间期延长（22.23±0.86 vs 15.78±0.65）、PR间期延长（56.53±0.95 vs 40.57±1.27）、ST段抬高（0.045±0.007 vs 0.022±0.006,P<0.05）;与EE组比较,EP+EE组大鼠QRS间期缩短（19.82±1.87 vs 22.23±0.86）、PR间期缩短（52.49±1.82 vs 56.53±0.95）、ST段降低（0.036±0.003 vs 0.045±0.007,P<0.05）;与Ctrl组相比,EP组大鼠QRS间期延长（17.01±0.78 vs 15.78±0.65）、PR间期延长（43.91±2.49 vs 40.57±1.27,P<0.05）。4.在细胞水平记录大鼠心室肌细胞动作电位和钠电流变化。采用全细胞膜片钳技术检测大鼠心室肌细胞动作电位和钠电流,进一步分析稳态失活曲线、中间态失活曲线等钠通道门控特性差异。与Ctrl组相比,EE组大鼠心肌细胞动作电位0相上升相减缓并且2、3相复极延长;EP+EE组的上升幅值和最大上升速率等参数较EE组有显着差异（P<0.05）;与Ctrl组相比,EE组钠电流幅值和钠电流密度明显降低;与EE组相比,EP+EE组峰电流增加,差异有统计学意义（P<0.05）;EE组的钠通道稳态失活曲线较Ctrl组显着左移（P<0.05）,提示钠电流变化与稳态失活过程相关,且主要取决于失活电压,即力竭运动时钠离子通道更容易失活,导致开放通道减少,钠电流减低;各组大鼠心室肌钠电流关闭态和中间失活时间常数（τ）明显不同,EE组较Ctrl组τ缩短（P<0.05）,EP组较EP+EE组,τ值延长（P<0.05）;与Ctrl组相比,EE组失活后恢复曲线右移,失活后恢复时间常数延长（P<0.05）,EP组较EP+EE组,失活后恢复时间常数缩短（P<0.05）。5.在分子水平检测HIF-1α、SIRT1和钠通道蛋白NaV1.5表达水平差异。采用Western blot检测HIF-1α、SIRT1和钠通道蛋白NaV1.5总表达及膜表达的差异,进一步推断钠电流改变的调控机制。与Ctrl组相比,EP组和EE组的大鼠心肌组织中HIF-1α表达明显升高,SIRT1表达水平下降（P<0.05）,差异有统计学意义;与EE组比较,EP+EE组HIF-1α表达明显降低,SIRT1表达水平升高（P<0.05）,差异有统计学意义;与EP组相比,EP+EE组HIF-1α表达明显升高,SIRT1表达水平明显下降（P<0.05）,差异有统计学意义;与Ctrl组相比,EP组和EE组的大鼠心室肌细胞中NaV1.5膜蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;与EE组比较,EP+EE组NaV1.5膜蛋白表达显着升高（P<0.05）;与EP组相比,EP+EE组NaV1.5膜蛋白表达显着降低（P<0.05）。结论:1.运动预适应通过增加力竭运动大鼠心室肌细胞钠电流及缩短动作电位的时长,降低心律失常的发生,减轻力竭运动对心室肌组织的损害;2.运动预适应通过影响NaV1.5门控特性,导致心室肌细胞钠电流增加;3.运动预适应通过正向调控SIRT1,使NaV1.5细胞膜的表达量增加;4.运动预适应通过调控HIF-1α的表达,减轻力竭运动对大鼠心室肌的损伤。
杨欣宇[3]（2021）在《稳心颗粒调控氧化应激和钙循环防治依鲁替尼诱发房颤的效应机制》文中认为背景近年来,随着肿瘤诊疗水平突飞猛进的提高、抗肿瘤药的不断涌现以及精准疗法的应用,肿瘤患者的生存期不断延长。然而,有研究显示,在带瘤生存者当中,约有1/3死于心血管疾病。因此,肿瘤心脏病学这一新兴交叉学科应运而生。依鲁替尼（ibrutinib）是一种布鲁顿酪氨酸激酶（Btk）抑制剂,用于临床治疗慢性淋巴细胞性白血病（CLL）,套细胞淋巴瘤和Waldenstrom巨球蛋白血症,可作为单一疗法或部分疗法联合应用。在既往的临床试验中,与用奥法木单抗治疗的患者相比,依鲁替尼显着提高了患者的生存率。尽管依鲁替尼相对于其他常规化疗显示出较小的毒性,但仍有证据表明,依鲁替尼可以增加出血风险以及心房颤动（AF）的发生率。据报道,接受依鲁替尼治疗的患者房颤发生率高达11%。因此,临床应用依鲁替尼治疗的患者面临巨大挑战。稳心颗粒（WXKL）是我国第一个抗心律失常中成药,其主要成分包括党参、黄精、三七、甘松和琥珀。多项研究表明,稳心颗粒对改善多种原因所致心律失常具有较好的临床疗效。稳心颗粒在改善p波离散度和维持阵发性房颤患者窦性心律方面似乎更有效,且可以降低室性早搏综合征（VPCs）的发生率,增加左室射血分数（LVEF）以及改善6分钟步行试验的结果。然而,其深层的机制尚不清楚。目的探索依鲁替尼增强小鼠房颤易感性的机制研究以及稳心颗粒治疗依鲁替尼诱发房颤小鼠氧化应激和钙循环信号通路的作用机制,为临床应用提供依据。方法1.采用食道Burst刺激,观察依鲁替尼诱发小鼠房颤的发生率和持续时间;超声心动图检测小鼠心房功能的指标;病理组织染色（Masson染色和天狼星红染色）观察心房组织纤维化程度,以及透射电子显微镜观察心房肌细胞的超微结构的变化。采用激光共聚焦显微镜和IonOptix系统检测细胞内Ca2+释放,观察依鲁替尼诱发房颤小鼠心房肌细胞钙火花、钙瞬变和线粒体活性氧簇生成的变化。2.采用蛋白质组学技术检测,观察依鲁替尼诱发房颤的心房肌蛋白表达情况,主要使用双向凝胶电泳技术对细胞的蛋白质进行高通量地分离和纯化,再用专业计算机软件进行图像分析,然后通过质谱技术及相关数据信息处理,对凝胶上的蛋白质点进行分析与鉴定,进而观察依鲁替尼诱发房颤小鼠心房肌的蛋白质组变化。3.采用蛋白印迹法（Western blot）进行验证,选取氧化应激信号通路相关蛋白NOX2、NOX4、XO和TGF-□作为对象,研究依鲁替尼诱发房颤小鼠心房肌氧化应激相关蛋白的影响。通过食道Burst刺激验证夹竹桃麻素通过减少心房肌细胞Ca2+释放以及抑制钙循环和氧化应激相关蛋白氧化的钙调蛋白激酶Ⅱ（ox-CaMKⅡ）和磷酸化的钙调蛋白激酶Ⅱ（p-CaMKⅡ,Ser286）的表达,从而减轻依鲁替尼诱发房颤小鼠的心房重构,进一步减少房颤的发生发展。4.采用构建化合物-靶点-疾病网络,筛选出在稳心颗粒调控的房颤的相关通路和靶标蛋白,进行GO富集分析以及KEGG通路分析。利用AutoDock Tools对活性氧（ROS）进行去水、加氢、计算电荷,然后运用AutoDock Vina对其进行分子对接。5.采用蛋白质组学技术检测稳心颗粒治疗依鲁替尼诱发房颤的心房肌蛋白表达情况,观察稳心颗粒治疗依鲁替尼诱发房颤小鼠心房肌差异蛋白的变化。结合分子靶点预测,筛选出稳心颗粒治疗房颤的共有靶标蛋白,然后对共有靶标进行富集分析。6.采用Western blot方法,选取氧化应激信号通路和钙循环通路相关蛋白,NOX2、NOX4、p22-phox、XO、ox-CaMKⅡ、p-CaMKII（Thr-286）和p-RyR2（Ser2814）作为对象,验证稳心颗粒对房颤小鼠心房肌氧化应激信号通路和钙循环信号通路相关蛋白的影响。结果1.食道Burst刺激心电图显示,模型组房颤的发生率较高,且持续时间明显延长。超声心动图测量心功能各项指标显示,模型组心房左右径较长,心房面积较大,E峰/A峰降低。光镜下模型组心肌细胞增大,排列紊乱,细胞间隙增宽,可见少量胶原纤维。透射镜下观察到房颤引起心肌超微结构改变,肌小节和肌质网少、线粒体肿胀及糖原沉积,闰盘分离。使用电生理相关技术检测,模型组的钙瞬变幅度明显增加,衰减时间延长。模型组的心房肌细胞内钙火花的发生频率明显增加。通过对线粒体ROS的检测,模型组心房肌细胞内线粒体ROS的产生是逐渐增加的,而DTT组的线粒体ROS产生的趋势减少。2.iTRAQ蛋白质组技术进行依鲁替尼诱发房颤后差异蛋白的鉴定及筛选。通过对差异蛋白的聚类分析、GO富集分析及KEGG通路分析信号通路的相关蛋白可能参与的病理生理过程。发现目前心律失常研究领域作为生物标记物的蛋白,如Xanthine dehydrogenase/oxidase,NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1,Deoxyguanosine kinase,NADH dehydrogenase[ubiquinone]1 beta subcomplex subunit 1 Biliverdin reductase B（Flavin reductase（NADPH））等。这些差异表达的蛋白质与ROS相关信号通路有关。3.Western blot检测结果显示,依鲁替尼治疗小鼠通过氧化应激增加ox-CaMK Ⅱ,p-CaMKⅡ（Ser286）,p-RyR2（Ser2814）和TGF-β的表达而引起钙超载和心房纤维化。夹竹桃麻素是一种NOX抑制剂,能够抑制氧化应激相关蛋白ox-CaMK Ⅱ和p-CaMKⅡ（Ser286）的表达,减轻了依鲁替尼诱发房颤小鼠的心房重构,进而减少房颤的发生发展。4.预测稳心颗粒治疗房颤的靶点,对“活性化合物—潜在靶点”网络进行分析得到64个关键靶点,进行靶点蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络图。结果表明,Cat、IL-6、MAPK14、Casp3等是稳心颗粒治疗房颤的关键靶点。采用分子对接方法观察稳心颗粒的主要成分与关键靶点的最佳嵌合结构。通过GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,氧化应激信号通路、钙离子信号通路,Toll样受体信号通路等。5.蛋白质组学方法鉴定稳心颗粒治疗依鲁替尼诱发房颤小鼠心房差异蛋白,筛选出336关键靶点,然后通过聚类分析、GO功能富集和KEGG通路富集分析。结合预测的分子靶点进行分析,筛选出25个共有关键靶点。通过GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,氧化应激相关信号通路、钙离子信号通路,Toll样受体信号通路等直接或者间接参与房颤的形成,明确关键靶点间的相互作用。6.Western blot进行验证,选择氧化应激信号通路和钙循环信号通路的相关蛋白,深入研究稳心颗粒对依鲁替尼诱发房颤小鼠氧化应激信号通路相关蛋白NOX2、NOX4、p22-phox、XO、ox-CaMK II、p-CaMKⅡ（Thr-286）和 p-RyR2（Ser2814）表达的变化。进一步明确稳心颗粒能够通过调控氧化应激和钙循环相关信号通路上的关键蛋白,而改善房颤的发生发展。结论1.依鲁替尼通过激活NOX以增加ROS,导致ox-CaMKⅡ中的蛋氨酸281/282氧化,从而增加RyR2上的丝氨酸2814,导致舒张期Ca2+泄漏增强,从而促进小鼠心房肌的电重构和结构重构。夹竹桃麻素是一种NOX抑制剂,通过抑制氧化应激相关蛋白ox-CaMKⅡ和p-CaMKⅡ（Ser286）的蛋白表达,减轻了依鲁替尼诱发房颤小鼠的心房重构。2.分子预测结合蛋白质组学筛选出25个靶点蛋白,这些标志物主要涉及氧化应激和钙循环信号通路相关蛋白。稳心颗粒能够通过调控这些通路相关的蛋白表达,而改善房颤的发生和发展,从信号与物质、结构变化的内在关系阐明其分子作用机制,为临床应用提供重要依据。
刘凯[4]（2021）在《青壮年猝死综合征心脏疾病相关基因变异及云南不明原因猝死高发区IRX4基因Y77C变异研究》文中提出[目的]1.筛查青壮年猝死综合征（Sudden manhood death syndrome,SMDS）病例心脏疾病相关基因变异,探寻SMDS相关的易感基因变异。2.检测云南不明原因猝死（Yunnan sudden unexplained death,YNSUD）易感致病基因变异IRX4-Y77C在YNSUD高发区人群中的等位基因分布,为YNSUD的病因研究和防治提供一定的理论依据。3.探究部分SMDS病例和YNSUD与心脏疾病（离子通道疾病和心肌病）相关基因变异的关系。[方法]1.收集昆明医科大学司法鉴定中心2017年至2018年间法医病理学鉴定的SMDS案件,提取猝死者心血基因组DNA进行全外显子测序,通过对测序数据进行注释、筛查与遗传性离子通道疾病和心肌病相关的基因变异位点,并利用生物信息学软件SIFT、MutationTaster和PolyPhen-2对筛查出的基因变异位点进行致病性预测。2.以大理州鹤庆县4个YNSUD高发区人群作为实验组,提取外周静脉血基因组DNA进行PCR扩增、Sanger测序,以千人基因组计划中中国西双版纳傣族人群和南方汉族人群作为对照组,探究本课题前期利用全外显子测序对25例YNSUD核心家系成员进行心脏疾病相关基因变异筛查中发现的IRX4-Y77C变异在YNSUD高发区人群中的分布情况,对实验组所有个体进行心电图和心脏彩超检查以了解实验组人群是否存在心脏心电异常改变和器质性病变。[结果]1.在昆明医科大学司法鉴定中心2017年至2018年鉴定案件中,共收集到3例保存较好可用于全外显子测序的SMDS病例血液样本,通过对全外显子测序结果进行数据筛查、致病性预测以及Sanger测序验证,发现3名猝死者分别携带TTN基因、CACNB2基因、SCN5A基因、KCNH2基因错义变异。其中,案例1猝死者检测到TTN基因V23610I变异,生物信息学软件SIFT和MutationTaster对其致病性预测结果分别为有害和致病。案例2猝死者检测到TTN基因 P1698L 和 I24875T 变异和 CACNB2 基因 S502L 变异,SIFT 和 MutationTaster对三个变异的致病性预测结果均为有害和致病。案例3猝死者检测到TTN基因R14571H 和 R24762H 变异、SCN5A 基因 R1193Q 变异、KCNH2 基因 K557T 变异,SIFT和MutationTaster对其致病性预测结果分别为:R14571H有害、致病,R24762H有害、致病。R1193Q无害、致病,另外PolyPhen-2对R1193Q预测结果为良性。K557T无害、良性。2.本次研究对4个YNSUD高发区112例村民进行的基因测序发现82例（73.2%）携带YNSUD易感致病基因变异IRX4-Y77C,该变异在研究人群中的等位基因频率均高于千人基因组计划中国西双版纳傣族人群和南方汉族人群,而且等位基因分布频率在实验组和对照组人群之间具有统计学差异。对1 12例村民进行的静息状态下心电图检查发现33例（约30%）IRX4-Y77C变异携带者检出不同程度的心电图异常改变,其中包括顺（逆）钟向转位7例、电轴左（右）偏9例、窦性心动过速（缓）9例、左前分支或完全性右束支传导阻滞8例、ST段和T波改变4例、QT间期延长2例等,表明4个YNSUD高发区村民存在一定程度的心脏电生理功能异常。心脏彩超发现2例心电图检见完全性右束支、左前分支传导阻滞的个体存在房间隔缺损伴血液左向右分流。未检见心室肥厚、心房明显扩张等心肌病典型病理改变。[结论]1.全外显子测序发现的 TTN-V23610I、TTN-P1698L、TTN-I24875T、CACNB2-S502L、TTN-R14571H、TTN-R24762H、SCN5A-R1193Q 可能是导致本研究中相应携带者发生SMDS的遗传易感因素。3例猝死者心脏重量增加,缺乏心肌病诊断依据但检见TTN致病基因变异,这提示法医工作中有必要对SMDS案件进行心脏疾病致病基因变异筛查。2.YNSUD易感致病基因变异IRX4-Y77C在4个YNSUD高发区人群中具有较高的等位基因频率,且与对照组人群差异具有统计学意义。结合IRX4-Y77C变异携带者检出不同程度的心电异常改变和心脏瓣膜返流、左心室增宽和房间隔缺损等异常,综合分析认为IRX4-Y77C变异可能与YNSUD在病区高发具有相关性。3.部分SMDS病例和YNSUD可能与心脏疾病（离子通道疾病和心肌病）相关基因变异有关。
缪玉影[5]（2021）在《基于胆固醇逆转运路径探讨PAP-1抗动脉粥样硬化的作用及机制研究》文中认为本文运用MTT法、油红O染色、胆固醇含量测定、免疫荧光、Western Blotting、ELISA、H&E染色、检测血清血脂及生化分析、麦胚凝集素（WGA）染色、Masson染色、免疫组化等相关技术,首先以Raw264.7巨噬源性泡沫细胞为研究对象,钾离子通道Kv1.3（Potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,member 3,Kv1.3）特异性抑制剂PAP-1为研究药物,发现并论证了:PAP-1能够降低巨噬细胞清道夫受体1（Recombinant macrophage scavenger receptor 1,MSR1）、血小板反应蛋白受体（Thrombospondin receptor,CD3 6）水平并上调 ATP 结合盒转运蛋白 A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）、三磷酸腺苷结合盒亚家族 G1 抗体（ATP-binding cassette,sub-family G member 1,ABCG1）蛋白表达抑制动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）体外模型Raw264.7巨噬源性细胞泡沫化;之后成功建立了 AS大鼠,发现PAP-1能够改善AS大鼠颈动脉病理形态、降低胆固醇相关血清血脂含量。进一步发现PAP-1对AS病理的改善与下调颈动脉CD36、MSR1和上调ABCA1、ABCG1蛋白表达有关;同时,我们发现PAP-1能够抑制并减轻AS造成的心脏损伤,具体包括心肌细胞肥大和心脏左心室室壁厚度增加、心肌纤维化和炎症反应。结果如下:1 PAP-1对Raw264.7巨噬源性泡沫细胞胆固醇逆转运的影响Raw264.7 巨噬细胞用 100 nM PAP-1 预处理 2 h,暴露 60 μg/mL ox-LDL（Oxidized low density lipoprotein）处理24 h。采用MTT法检测细胞活力、油红O染色法观察细胞内脂质积聚情况、酶学方法检测细胞总胆固醇（Total cholesterol,TC）和游离胆固醇（Free cholesterol,FC）的水平、Western Blotting 结合免疫荧光检测 CD36、MSR1、ABCA1 和ABCG1的蛋白表达。结果显示,ox-LDL以浓度依赖的方式诱导Raw264.7细胞活力的下降、增加脂质的摄入、上调CD36、MSR1并下调ABCA1、ABCG1的蛋白表达;PAP-1抑制巨噬源性泡沫细胞增殖活力下降,减少细胞内脂质的摄取及胆固醇含量。Western Blotting及免疫荧光实验表明PAP-1可以通过下调CD36、MSR1并上调ABCA1、ABCG1蛋白表达水平使Raw264.7细胞内的脂质转运平衡抑制巨噬细胞泡沫化。提示:PAP-1能够通过胆固醇逆转运途径促进泡沫细胞胆固醇外流,逆转泡沫细胞形成,改善AS体外泡沫细胞模型。2 PAP-1对AS大鼠胆固醇逆转运影响采用颈动脉球囊损伤术结合高脂喂养方法建立AS大鼠。20只大鼠在适应性喂养一周后,将大鼠随机分为空白对照组（4只）和造模组（16只）。期间空白对照组喂养普通饲料,造模组大鼠使用球囊受损结合高脂饲料喂养方法建立AS大鼠模型。造模组大鼠随机分为3组:Model组,PAP-1组和AV（阿托伐他汀,Atorvastatin）组作为阳性对照。术后连续3天腹腔注射抗生素,每日1次。之后开始给药PAP-1组:腹腔注射每日1次,浓度为3 mg/（kg·d）（溶于1%DMSO,99%玉米油）;AV组:灌胃给药每日1次,浓度为10 mg/（kg·d）,溶于玉米油。模型组与空白对照组大鼠使用相同体积玉米油灌胃或腹腔注射1次/d。观察实验大鼠一般状态（体重、精神、毛色等）。12周末,首先采用Vevo高分辨动物超声影像系统测量各组大鼠左心室超声参数、计算射血分数。之后收集各组大鼠血液样品和组织。采用H&E染色分析大鼠颈动脉损伤处病理、Western Blotting检测CD36、MSR1、ABCA1 和 ABCG1 蛋白表达、测定血清 TC、FC、甘油三酯（Triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）含量评价大鼠血脂变化、ELISA法检测血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。我们发现,PAP-1可以降低AS大鼠体重的迅速上升趋势并减轻颈动脉血管脂质沉积和增厚,抑制IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子水平,降低TC、FC、TG和LDL-C水平。Western Blotting实验表明,PAP-1对AS的大鼠保护作用与通过降低CD36、MSR1表达并增强ABCA1、ABCG1蛋白表达有关。提示:PAP-1通过促进胆固醇逆转运途径减轻AS大鼠颈动脉病理。3 PAP-1对AS的心脏保护作用进一步采用麦胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）染色测量心肌细胞横截面积,Masson染色、免疫组化染色方法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、IL-1β、IL-6、TNF-α含量评价心肌组织切片纤维化和炎症反应。我们发现PAP-1可以抑制AS大鼠造成的心肌细胞横截面积和心脏扩大现象、减轻AS大鼠心肌组织纤维化积累以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白蓄积。同时,PAP-1显着减轻了 AS大鼠心脏炎症反应,具体表现为心肌组织切片IL-1β和IL-6、TNF-α的表达降低。表明:PAP-1能够抑制心肌细胞肥大和心脏室壁厚度增加、减轻纤维化和炎症反应对AS大鼠心脏起保护作用。胆固醇逆转运是指高密度脂蛋白（High-density lipoprotein,HDL）将泡沫细胞和AS斑块中的胆固醇转运至肝脏进行分解代谢并排出体外的过程,是正常机体维持脂质代谢平衡的重要机制之一。胆固醇代谢紊乱是AS的最主要诱因之一,他汀类降脂药会导致肌肉酸痛、虚弱和肌肉炎症以及肝毒性等常见副作用。因此,如何通过胆固醇逆转运途径开发针对AS的治疗药物具有潜力。在基础研究中发现电压门控性钾离子通道Kv1.3特异性阻断抗体hKv1.3-E314可以通过胆固醇逆转运途径有效地逆转巨噬源性泡沫细胞的形成、体内研究发现Kv1.3阻断可以降低肥胖体征,这为我们将Kv1.3阻滞剂应用于防治AS提供了思路。PAP-1是一种对Kv1.3具有高度亲和性的新型的小分子,EC50仅2 nM,对Kv1.3的选择性是Kv1家族其他成员的33-125倍。目前,已有文献指出PAP-1具有体内和体外应用的安全性,能对AS大鼠颈动脉脂质沉积起一定的抑制作用,但确切的分子机制不明。因此本研究通过胆固醇逆转运途径探讨PAP-1对AS离体细胞与在体动物模型的影响,为PAP-1抗AS的机制提供依据,为PAP-1或其他K1.3抑制剂治疗AS的应用与开发提供思路。
张晓天[6]（2021）在《MicroRNA-217-5p靶向作用于CLIC4在动脉粥样硬化过程中对血管内皮细胞凋亡的影响》文中研究指明目的:目前,心脑血管疾病发病率逐年升高,而动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是众所周知的血管性疾病的重要病因,AS以富有脂质的斑块在大动脉壁聚集为特征,病理上可表现为血管内膜炎症细胞增殖,内皮功能障碍、管腔变窄及附壁血栓等。临床上常见的脑血管疾病,往往由AS为基础发展而来,在AS的血管壁病变的基础上,出现管腔狭窄、血流瘀滞、血栓形成,进而出现血管的闭塞或栓塞,出现脑部脑实质病变的相应症状及体征。目前,对AS发生机制的研究日益深入逐渐发现,血管内皮功能障碍可能是导致AS发生的重要始发事件之一。血管内皮细胞是位于血管内腔面的单层扁平细胞,是机体中一类非常重要的细胞群体,在血管通透性屏障、免疫防御和炎症反应中起着极为重要的作用。血管内皮细胞凋亡是AS发展的重要过程。一旦内皮细胞发生凋亡,血管内皮可能会失去调节脂质体内平衡及调节免疫和炎症的能力,继而导致脂质沉积,形成促进动脉斑块形成的环境。此外,管腔内不稳定斑块的出现可能也与血管内皮细胞的凋亡相关,斑块的脱落可能引起动脉到动脉的栓塞,导致急性冠状动脉堵塞和猝死。因此,调控血管内皮细胞凋亡是AS的潜在的预防和治疗途径。寻找血管内皮细胞凋亡的原因并探究其作用通路,对防治AS具有重要的理论价值及实践意义。细胞内氯离子通道蛋白4（Chloride Intracellular Channel4,CLIC4）又称为线粒体氯离子通道蛋白（Mitochondrial chloride channel protein,mt CLIC）,是细胞内氯通道蛋白（Cellular Chloride Channel Protein,CLIC）多种家族成员之一,分子量大小约为29KD。目前研究显示,其可以广泛表达于多种细胞中,包括肿瘤细胞、神经细胞及血管内皮细胞等,但其生物学功能尚不完全清楚。已报道的数据显示,CLIC4与多种细胞的凋亡相关,多种应激诱导剂均可导致CLIC4由细胞质转移到细胞核,核转位后启动细胞凋亡的发生。微小RNA（micro RNAs,miRNAs）是在生理和病理生理过程中负调节人类基因的18-22核苷酸非编码RNA,与多种疾病的发生发展密切相关。有报导表明,miR-217水平与动脉硬化内皮功能损伤有关,该miRNA被鉴定为衰老的人脐带内皮细胞中最深层的调控miRNA。在Target Scan、micro RNA.org、mir DB三个网站中,预测可能调控靶基因CLIC4的micro RNA均指向miR-217,但二者是否存在确实的标靶关系,还需要进一步验证。内皮细胞凋亡在血管动脉粥样硬化的发病机制中起着至关重要的作用。miRNAs和Cl ICs已经被证实参与了内皮细胞凋亡的过程,但其潜在的分子机制尚不完全清楚。本研究的主要目的是研究microrna-217-5p（miR-217-5p）和CLIC4的生物学效应,二者对AS中内皮细胞凋亡的影响及其相关机制,同时确定内皮细胞凋亡过程中,miR-217-5p与CLIC4的相互作用关系。研究方法:1.将载脂蛋白E基因敲除小鼠高脂饮食（High fat diet,HFD）喂养12周,构建AS小鼠模型。取主动脉后,采用HE染色方法观测主动脉硬化组织病理改变,oil red O染色法观察AS脂质沉积情况,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的表达情况,western blot、免疫荧光检测细胞中CLIC4蛋白水平。将氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL;50μg/m L）作用于人主动脉内皮细胞24h,建立体外AS模型。通过实时荧光定量PCR检测miR-217-5p的表达情况,采用Western blot,免疫荧光检测方法检测CLIC4蛋白水平。2.研究miR-217-5p及CLIC4对ox-LDL处理的主动脉内皮细胞的影响。人主动脉内皮细胞内转染miR-217-5p minics上调miR-217-5p水平,采用实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的水平以验证转染效果。采用流式细胞术及Hoechst染色法检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白水平,以及胞质和线粒体中细胞色素C的水平,JC-1法检测线粒体膜电位。细胞内转染CLIC4 siRNA下调CLIC4水平,Western blot检测细胞中CLIC4的水平,验证转染效果。流式细胞术及Hoechst染色法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9、Bax、Bcl-2水平,以及胞质和线粒体中细胞色素C的水平,JC-1法检测线粒体膜电位。3.研究miR-217-5p与CLIC4的标靶关系。人主动脉内皮细胞内转染miR-217-5p minics后,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞模型中CLIC4水平;通过荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性;同时过表达细胞内miR-217-5p及CLIC4水平,通过流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9水平,观察CLIC4过表达后是否可以逆转miR-217-5p的作用。结果:1.经苏丹染色、HE染色、油红染色证实小鼠动脉硬化模型建立成功,小鼠主动脉内皮细胞中,HFD组miR-217-5p表达水平较正常饮食（Normal diet,ND）组显着减少,HFD组CLIC4蛋白表达水平显着增加。免疫荧光染色显示,在HFD组中CLIC4的表达显着上调;体外人主动脉硬化模型中,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的水平,ox-LDL组miR-217-5p的水平较对照组显着减少;Western blot及免疫荧光检测结果显示,ox-LDL组CLIC4水平较对照组显着增加。2.人主动脉内皮细胞转染miR-217-5p minics后,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的水平,与ox-LDL+NC组比较,ox-LDL+miR-217-5p mimics组细胞中miR-217-5p表达水平显着增加,证实转染成功;流式细胞术检测细胞凋亡情况,过表达miR-217-5p后ox-LDL+miR-217-5p mimics组较ox-LDL+NC组凋亡细胞比例减少;JC-1法检测线粒体膜电位,ox-LDL处理后,线粒体膜电位降低,而miR-217-5p过表达后线粒体膜电位得到恢复;Hoechst染色法检测细胞凋亡,ox-LDL处理后,凋亡细胞数明显增多,而转染miR-217-5p mimics后,凋亡细胞数减少;Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况,结果显示,ox-LDL处理后,Bcl-2蛋白表达量显着降低,而Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达量显着升高,miR-217-5p过表达可逆转这一变化;Western blot检测线粒体中细胞色素C的水平,ox-LDL组细胞线粒体中细胞色素C表达量与对照组相比降低,ox-LDL+miR-217-5p mimics组细胞线粒体中细胞色素C表达量较对照组显着增加。通过siRNA技术沉默人主动脉内皮中CLIC4基因的表达,随后,通过Hoechst染色法观察细胞凋亡情况。结果显示,ox-LDL处理后,凋亡细胞明显增多,而转染CLIC4 siRNA后,凋亡细胞数减少;同时,流式细胞术对细胞凋亡检测也发现,转染CLIC4 siRNA后较ox-LDL+NC siRNA组凋亡细胞比例减少;JC-1法检测线粒体膜电位结果显示,ox-LDL处理后,线粒体膜电位降低,而miR-217-5p过表达后线粒体膜电位得到恢复;Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况,结果显示,ox-LDL处理后,Bcl-2蛋白表达量显着降低,而Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达量显着升高,CLIC4 siRNA可逆转上述变化;Western blot检测线粒体中细胞色素C的水平,与ox-LDL+NC siRNA组比较,转染CLIC4 siRNA组细胞线粒体中细胞色素C表达量显着增加。3.实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞模型中CLIC4水平,ox-LDL处理后,与NC mimics组比较,miR-217-5p mimics组细胞中CLIC4 m RNA和蛋白的表达量均显着降低;荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性,miR-217mimics+CLIC4-wt组较NC mimics+CLIC4-wt和miR-217 mimics+CLCI4-mut组相比荧光素酶活性均显着下降;流式细胞术测定每组中的细胞凋亡,过表达miR-217-5p后ox-LDL+miR-217-5p mimics组较ox-LDL+NC组凋亡细胞比例减少,miR-217mimics+CLIC4-wt组显示凋亡细胞数较过表达miR-217-5p组增多。Wstern blot检测cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达水平,miR-217-5p过表达组较单纯ox-LDL处理组cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达量降低,miR-217 mimics+CLIC4-wt组较miR-217-5p过表达组上述凋亡相关蛋白水平升高,证实CLIC4过表达可逆转miR-217-5p的作用。结论:1.通过AS小鼠模型及体外实验证实,AS的主动脉内皮细胞中,miR-217-5p的表达降低,CLIC4的表达增加。2.CLIC4可以通过线粒体途径诱导主动脉内皮细胞的凋亡,而miR-217-5p过表达可以抑制线粒体途径诱导的主动脉内皮细胞凋亡。3.miR-217-5p能靶向结合CLIC4,miR-217-5p过表达可以降低CLIC4的表达,CLIC4过表达可逆转miR-217-5p的作用,二者呈负调控相关,共同调节线粒体途径诱导的主动脉内皮细胞凋亡。
苏金玉[7]（2020）在《抗氧化型低密度脂蛋白的抗体通过调节单核巨噬细胞的Ca2+/K+通道抑制MCP-1的释放》文中认为动脉粥样硬化是一种由于脂质代谢不平衡,即高脂血症导致的慢性炎症疾病。氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）通过诱导巨噬细胞释放单核细胞趋化因子（MCP-1）和吞噬过多脂质导致泡沫细胞形成和脂质斑块在血管内膜的堆积。近几年来,研究发现oxLDL的疫苗及其抗体可以预防和治疗动脉粥样硬化,而且抗oxLDL的抗体（BI-204）在体外可以减少单核巨噬细胞释放致炎因子MCP-1。然而,目前并不清楚抗oxLDL的抗体（BI-204）抑制MCP-1释放的分子机制。本课题中,我们验证了 oxLDL通过TLR-4和MAPK信号通路诱导单核巨噬细胞释放MCP-1。用CD36、TLR-4、SR-AI和LOX-1的抑制性抗体作用于单核巨噬细胞,只有TLR-4的抑制性抗体才可以阻滞oxLDL诱导的MCP-1的释放。与此不同,分别抑制p38 MAPK、JNK和ERK信号通路均可抑制oxLDL诱导的MCP-1的释放。我们的结果还显示,MCP-1的释放受单核巨噬细胞膜上的钙离子通道和钾离子通道的调节。应用钙离子通道抑制剂硝苯地平和钾离子通道（钾离子外流）抑制剂格列本脲呈剂量依赖性地抑制oxLDL诱导的MCP-1的释放。而且在荧光共聚焦显微镜下,oxLDL显着地促进细胞外钙离子流入胞内,并导致细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）震荡增加。用膜片钳技术检测巨噬细胞膜上的离子通道电流,结果显示oxLDL明显抑制内向整流钾离子通道（Kir）活动。而且抑制JNK和ERK均阻滞oxLDL诱导的[Ca2+]i震荡和Kir通道的改变。而应用oxLDL的单克隆抗体BI-204显着地抑制oxLDL诱导的MCP-1的释放,并且恢复了Kir通道的活性,而且BI-204是通过与单核巨噬细胞膜上的FcγRIIB结合来介导的抑炎作用。值得注意的是,BI-204特异性地抑制oxLDL诱导的ERK的磷酸化,而对JNK和p38 MAPK没有影响。综上,oxLDL通过TLR-4激活单核巨噬细胞内MAPK信号通路,被激活的JNK或ERK抑制Kir通道活动并增加钙离子内流从而促进MCP-1释放到胞外。而抗oxLDL的抗体BI-204则通过与Fcγ RIIB结合,特异性地抑制细胞内的ERK信号通路,继而恢复Kir的活动和减少钙离子流入胞内,从而抑制oxLDL诱导的MCP-1的释放。所以我们的研究揭示了抗oxLDL的抗体BI-204在动脉粥样硬化动物模型中发挥抑炎作用的分子机制,为针对抗原的抗体治疗方法提供理论依据。
班努·库肯[8]（2020）在《新疆地区维吾尔族心房颤动患者单核苷酸基因多态性研究》文中研究指明目的:心房颤动（房颤）是临床最常见,危害最严重的心律失常之一,发病率逐年升高,国内外研究发现遗传基因单核苷酸多态性与房颤发生相关。本文拟探讨分析SCN5A、CETP、Cx40、AGT、eNOS基因多态性与新疆地区维吾尔族非瓣膜型心房颤动的相关性,为明确房颤的分子生物学发病机制提供依据。方法:采用病例对照研究方法,选取2013年2月-2015年8月在新疆医科大学第一附属医院综合心内科收治的新疆维吾尔族非瓣膜型心房颤动患者（实验组）及非房颤患者（对照组）各100例,采集外周静脉血提取DNA,采用聚合酶链式反应PCR技术对SCN5A基因多态性位点H558R、CETP基因多态性位点TaqIB、Cx40基因多态性位点（-44G/A及+71A/G）、AGT基因多态性位点M235-T、G-6A、T174M、eNOS基因多态性位点T-786C、G-894T进行多态性检测,对实验组和对照组之间基因多态性分布的差异进行比较,对突变位点定位,明确房颤易感基因多态位点与维吾尔族非瓣膜型房颤之间的相关性。结果:新疆维吾尔族非瓣膜型房颤患者年龄高于对照组（56.22±7.81（岁）vs52.98±9.03（岁）,P=0.007）;维吾尔族非瓣膜型房颤患者中总胆固醇（4.14±1.02（mmol/L）vs3.69±1.16（mmol/L）,P=0.004）及LDL-C（2.878±0.516（mmol/L）vs2.472±0.793（mmol/L）,P=0.009）、尿酸（347.68±130.51（umol/L）vs 292.62±102.63（umol/L）,P=0.022）均高于对照组,差异均有统计学意义;维吾尔族非瓣膜型房颤组患者和对照组比较,左心房内径（38.96±8.07（mm）vs34.12±4.66（mm）,P<0.001）、右心房内径（35.6±6.07（mm）vs33.14±3.15（mm）,P<0.001）均大于对照组,差异有统计学意义,左心射血分数、左室舒张末内径差异无统计学意义。SCN5A基因:基因测序SCN5A基因H558R位点以AA基因型为主,维吾尔族非瓣膜型房颤组基因型及等位基因的分布与非房颤组之间比较有显着差异（P<0.05）,logistic回归分析结果显示G等位基因可能是维吾尔族非瓣膜型房颤的一个易感基因（OR=2.189,95%CI:1.360-3.523,P=0.001）。CETP基因:CETPTaqIB基因位点两组基因型和等位基因分布差异有统计学意义（x2=6.574,P=0.0374;x2=6.91,P=0.0085）。Cx40基因:Cx40基因--44G/A及+71A/G多态性与维吾尔族非瓣膜型房颤发生相关联。连锁不平衡分析提示两个多态位点处于完全连锁不平衡（D,=1,r,=1）。房颤组-44AA基因型频率及A等位基因频率高于对照组（P<0.05）;基因模型基因型分析,Cx-44G/A显性模型（GGvs GA+AA）中A基因携带者可能增加房颤的患病风险（OR=2.357,95%CI:1.293-4.298,P=0.007）;多因素logistic回归分析,控制高血压、吸烟、饮酒等混杂因素,Cx40基因多态性在两组间差异有统计学意义（P<0.05）。AGT基因:AGTM235T基因位点在维吾尔族非瓣膜型房颤组和对照组的基因型频率和等位基因频率的差异有统计学意义（P<0.05）。新疆地区维吾尔族非瓣膜型房颤的发生与AGTG-6A、AGTM235T、AGTT174M位点均有关联性。eNOS基因:eNOSG-894T基因型分布在维吾尔族非瓣膜型房颤组和对照组差异有统计学意义（P<0.001）。T等位基因频率在房颤组（0.150）与对照组（0.050）比较差异有统计学意义（P<0.001）。此基因的遗传多态性可能增加维吾尔族非瓣膜型房颤的遗传易感性。房颤组T-786C基因TT、TC、CC基因型频率与对照组比较,差异无统计学意义（P=0.526）。结论:新疆地区维吾尔族非瓣膜型心房颤动的发生与SCN5A基因H558R、CETPTaq IB、Cx40基因--44G/A及+71A/G、AGTG-6A、AGTM235T、AGTT174M及eNOSG-894T位点基因多态性有相关性。SCN5A基因G等位基因是维吾尔族患者发生非瓣膜型房颤的一个潜在危险因素。eNOST-786C基因多态性和新疆地区维吾尔族非瓣膜型心房颤动的发生不具有相关性。
赵晓溪[9]（2019）在《二十二碳六烯酸对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道电生理作用及对细胞内钙离子浓度的影响》文中研究说明目的:二十二碳六烯酸（docosahexaenic acid,DHA）是n-3多不饱和脂肪酸的主要成分,可降低心血管疾病的发生。大电导钙激活钾离子通道（Large conductance Ca2+-activated K+channels,BK）是冠状动脉平滑肌细胞上重要的离子通道,参与血管张力调节。然而DHA对冠状动脉平滑肌细胞BK通道的电生理作用机制尚不完全清楚。本研究中拟通过使用膜片钳技术和细胞内钙离子浓度荧光测定技术来探讨不同浓度DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道电生理作用及细胞内钙离子浓度的影响,并研究不同浓度DHA对BK通道的激活作用机制,为临床合理使用DHA防治心血管疾病提供实验基础。方法:（1）正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞的分离:应用“三步”酶消化法,即依次将分离好的正常大鼠冠状动脉孵育在消化酶液Ⅰ（1 mg/ml牛血清白蛋白）,消化酶Ⅱ（1 mg/ml牛血清白蛋白,1.5 mg/ml木瓜蛋白酶,1 mg/ml二硫苏糖醇）,消化酶Ⅲ（1 mg/ml牛血清白蛋白,0.25 mg/ml弹性蛋白酶、1 mg/ml胰蛋白酶抑制剂）中进行消化8-10分钟,可分离到正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞。（2）酶消化法分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞后,应用全细胞膜片钳技术记录灌流DHA前后正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞钾离子流的变化,同时应用不同钾离子通道阻滞剂后观察DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞钾离子电流的影响。（3）采用全细胞膜片钳实验技术记录不同浓度DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞的BK通道电流影响及孵育SKF525A前后灌流不同浓度DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道电流影响,同时应用膜内向外型单通道膜片钳实验技术记录不同浓度DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道电流影响。（4）酶消化法分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞后,应用膜内向外型单通道膜片钳实验技术测定不同浓度钙离子对BK通道开放概率的影响,采用荧光探针Fura-2/AM测定不同浓度DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响;应用磷脂酶C（PLC）受体拮抗剂U73122和三磷酸肌醇（IP3）受体拮抗剂2-APB观察DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响。结果:（1）正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞分离:经三步酶消法可获得大量存活的单个冠状动脉平滑肌细胞,显微镜下观察可见冠状动脉平滑肌细胞呈长梭形、蚯蚓状、球状和杆状等形态,轮廓清晰,细胞膜完整光滑,细胞质均匀,折光性好,立体感强,细胞贴壁较快,存活细胞数量多。（2）正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞在维持电位-60 mV和刺激电位+100 mV下,加人5μmol/LDHA前后总钾离子通道电流密度分别为（69.8±6.9）pA/pF和（425.0±142.3）pA/pF（n=5,P<0.05）。分别灌流非特异性钾离子通道阻滞剂四乙胺（TEA）10 mmol/L、BK通道特异性阻滞剂ibritoxin（IBTX）100 nmol/L、中电导钙激活钾离子通道阻滞剂（TRAM-34）200 nmol/L、小电导钙激活钾离子通道阻滞剂apamin（APA）1μmol/L、电压依赖性钾离子通道阻滞剂4-aminopyridine（4AP）5 mmol/L、ATP依赖性钾离子通道阻滞剂glyburide（GLY）10μmol/L、BK通道特异性阻滞剂（IBTX）100 nmol/L+中电导钙激活钾离子通道阻滞剂（TRAM-34）200 nmol/L+小电导钙激活钾离子通道阻滞剂apamin（APA）10 μmol/L和BK通道特异性阻滞剂ibritoxin（IBTX）100 nmol/L+电压依赖性钾离子通道阻滞剂4-aminopyridine（4AP）5 μmol/L后,电流密度分别为（13.9±2.7）pA/pF、（25.1±5.6）pA/pF、（55.8±9.2）pA/pF、（35.3±9.9）pA/pF、（56.5±8.7）pA/pF、（68.6±6.8）pA/pF、（23.0±7.2）pA/pF和（20.9±3.8）pA/pF;同时灌流5μmol/L的DHA后记录电流密度分别为（14.1 ±3.2）pA/pF、（89.1.±29.2）pA/pF,（380.6± 125.5）pA/pF,（326.6±97.6）pA/pF、（345.6± 110.1）pA/pF、（349.6±115.9）pA/pF、（81.6±23.7）pA/pF和（73.9±21.9）pA/pF。（3）全细胞膜片钳模式下记录BK通道电流,DHA在0.1 μmol/L、0.3 μmol/L和1.0μmol/L时正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道激活,且DHA在3 μmol/L时BK通道电流增加（737 ±86）%,DHA在10μmol/L时,BK通道电流增加了（822±43）%（n=6,P<0.05）。SKF525A孵育后,DHA在（0.01-1μmol/1）时,冠状动脉平滑肌细胞BK电流无增加,在3μmol/L和10μmol/L时,SKF525A孵育后冠状动脉平滑肌细胞BK通道电流分别增加（327±81）%和（627±32）%（n=6,P<0.05）。单通道膜片钳记录BK通道电流,在含1μmol/L游离钙的细胞外液中,不加入和加入0.001μmol/L,0.1μmol/L、0.3 μmol/L及1μmol/L的DHA,钳制电位为+60mV时BK通道开放概率分别为0.075±0.019、0.071 ± 0.020、0.067±0.019、0.087±0.026和 0.098±0.023,与未加入DHA组相比无统计学差异（n=5,P>0.05）。在DHA为3 μmol/L、5 μmol/L和10μmol/L DHA时,BK通道开放概率分别为 0.232± 0.027、0.582±0.041 和 0.606 ±0.066,与未加入DHA组相比有统计学差异（n=5,P<0.05）。（4）单通道膜片钳记录模式下,刺激电位+60mV,电极外液钙离子浓度分别为0.001μmol/L、0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和50 μmol/L的条件下,记录到 BK 通道开放概率分别为 0.0006±0.0004、0.0010±0.0004、0.0013±0.0001、0.0100±0.0026、0.0510±0.0081、1.4563±0.0599、1.5935±0.0562 和 1.5444±0.1101。应用Fura-2/AM技术测定细胞内荧光信号强度,DHA在（0.001-0.01）μmol/L时,细胞内钙离子浓度无变化;但DHA在（0.01-10）μmol/L时,细胞内荧光信号强度增加,半数有效浓度为（0.037±0.01）μmol/L（n=5～8,P<0.05）。应用PLC抑制剂U-73122和IP3抑制剂2-APB孵育大鼠冠状动脉平滑肌细胞后再次加入DHA,与对照组相比细胞内荧光信号强度显着降低（n=5～8,P<0.05）。结论:（1）“三步”酶消化法可成功分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞。（2）DHA可激活正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞的钾离子通道,且主要激活BK通道,这可能是DHA扩张血管的机制之一。（3）不同浓度DHA对BK通道的激活机制不同,低浓度DHA激活冠状动脉平滑肌细胞BK通道是通过CYP450环氧化酶途径,高浓度DHA可直接激活正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道。（4）低浓度和高浓度DHA都可以通过PLC-IP3信号通路使冠状动脉平滑肌细胞内钙离子浓度增加,从而激活BK通道。
林红[10]（2016）在《CaN/NFAT抑制剂对SHR T淋巴细胞CaN/NFAT信号通路、钾通道及炎症因子的体内干预研究》文中进行了进一步梳理目的:已有研究发现CaN/NFAT抑制剂能够抑制高血压的发生,但具体的作用机制尚不清楚。本研究通过检测并分析SHR（自发高血压大鼠）经钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子（CaN-NFAT）信号通路抑制剂环孢素A（CsA）VIVIT体内干预后,T淋巴细胞Kv1.3通道电流变化以及T淋巴细胞Kv1.3通道（KCCN4）IL-6、TNF-α基因蛋白水平、CaN、NFAT活性变化的分析;从Ca/NFAT信号通路抑制剂体内药物干预水平,探讨钾通道-Ca N/NFAT信号通路-炎症-高血压病之间的关系,通过研究证实Kv通道通过CaN/NFAT信号通路激活淋巴细胞释放炎性细胞因子参与高血压病的发生发展的研究假设,为治疗高血压的炎症调节机制提供可能的研究证据。方法:1)自发性高血压大鼠（SHR）作为实验对象,分为5组:WKY组空白组、安慰剂组、CsA组、VIVIT组,每组6只,利用膜片钳方法测定经CsA、VIVIT体内干预前后Kv1.3通道电流变化,CsA、VIVIT处理不同条件下对其电流的影响;2)自发性高血压大鼠（SHR）作为实验对象,分为5组:空白正常大鼠WKY组、空白SHR组、安慰剂组、CsA组、VIVIT组,每组6只,经CSA、VIVIT体内干预前后分别测定:荧光免疫组化检测T淋巴细胞CaN和NFAT活性;Real-time PCR和Western blot技术检测T淋巴细胞Kv通道（KCCN4）IL-6、TNF-α基因和蛋白的表达。结果:1)CaN/NFAT抑制剂CsA、VIVIT作用下,SHR淋巴细胞的Kv1.3通道电流显着降低;2)空白SHR组、安慰剂组CaN和NFAT活性是增加的,CSA组、VIVIT组CaN和NFAT活性较空白SHR组、安慰剂组显着降低,差异有统计学意义;3)SHRT淋巴细胞Kv通道（KCCN4）IL-6、TNF-α基因和蛋白表达较WKY组增高;CsA组、VIVIT组Kv通道（KCCN4）IL-6、TNF-α基因和蛋白表达较空白SHR组、安慰剂组均显着降低,差异有统计学意义,且Kv通道（KCCN4）IL-6、TNF-α基因和蛋白水平呈正相关。结论:1)CaN/NFAT抑制剂CsA、VIVIT能够阻滞SHR淋巴细胞的Kv1.3通道电流;2)CsA、VIVIT会使CaN和NFAT活性降低;3)CsA、VIVIT能够显着降低SHRT淋巴细胞Kv通道（KCCN4）IL-6、TNF-α基因和蛋白表达水平。
二、膜片钳技术在动脉粥样硬化研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、膜片钳技术在动脉粥样硬化研究中的应用（论文提纲范文）
（1）黄芪丹参及其组分配伍干预动脉粥样硬化的实验效应及其对周细胞炎症损伤的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 动脉粥样硬化与炎性反应 |
| 1.1 动脉粥样硬化炎性反应的病理机制 |
| 1.2 动脉粥样硬化与炎性反应的相关通路研究 |
| 2 周细胞在动脉粥样硬化炎性反应中的作用 |
| 2.1 周细胞的定义、分布及形态 |
| 2.2 周细胞的标记分子 |
| 2.3 周细胞参与动脉粥样硬化的炎性损伤过程 |
| 3 动脉粥样硬化气滞血瘀证 |
| 3.1 动脉粥样硬化气虚血瘀证的认识 |
| 3.2 动脉粥样硬化气虚血瘀证的证治规律探讨 |
| 4 黄芪丹参及其组分配伍参与动脉粥样硬化的病理进程 |
| 4.1 黄芪丹参拮抗动脉粥样硬化的中药疗效及临床应用安全性 |
| 4.2 黄芪丹参拮抗动脉粥样硬化的现代药理研究 |
| 4.3 黄芪甲苷与丹酚酸B拮抗动脉粥样硬化的现代药理研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 黄芪丹参及其组分配伍对动脉粥样硬化ApoE~(-/-)鼠血管斑块和炎性反应的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及药物干预方法 |
| 2.2 标本采集及处理 |
| 2.3 检测指标与方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 各组小鼠的宏观行为学观察比较 |
| 3.2 各组小鼠主动脉斑块形态学与病理学的比较 |
| 3.3 各组小鼠血脂水平的比较 |
| 3.4 各组小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子表达水平的比较 |
| 3.5 各组小鼠主动脉根部周细胞数量变化情况 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于Piezo1/YAP/JNK信号轴探讨黄芪丹参及其组分配伍拮抗周细胞炎性反应的作用及机制研究 |
| 第一节 周细胞炎性反应与Piezo1蛋白表达相关 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞来源 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 周细胞复苏 |
| 2.2 周细胞传代 |
| 2.3 周细胞冻存 |
| 2.4 CCK-8法进行ox-LDL干预浓度和时间的选择 |
| 2.5 实验分组及药物干预方法 |
| 2.6 RT-PCR检测mRNA表达 |
| 2.7 Western blot检测蛋白表达 |
| 2.8 免疫荧光 |
| 2.9 敲减Piezo1蛋白 |
| 2.10 膜片钳实验 |
| 2.11 钙流检测 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 周细胞细胞生长状态 |
| 3.2 ox-LDL干预浓度和时间 |
| 3.3 炎性相关基因的表达 |
| 3.4 炎性相关蛋白的表达 |
| 3.5 ox-LDL对周细胞中Piezo1 mRNA水平的影响 |
| 3.6 ox-LDL对周细胞中Piezo1蛋白表达的影响 |
| 3.7 Piezo1敲减效果验证 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 第二节 Piezo1敲减对周细胞生物学功能和炎性反应及其信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞来源 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 敲减Piezo1蛋白 |
| 2.2 实验分组及药物干预方法 |
| 2.3 划痕实验 |
| 2.4 Transwell迁移实验 |
| 2.5 RT-PCR |
| 2.6 Western Blot |
| 2.7 免疫荧光 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 划痕实验评定周细胞的迁移能力 |
| 3.2 Transwell迁移实验评定周细胞的迁移能力 |
| 3.3 Piezo1 及炎性相关基因的表达 |
| 3.4 炎性相关蛋白的表达 |
| 3.5 敲减 Piezo1 对周细胞 YAP/TAZ/JNK 信号通路基因表达的影响 |
| 3.6 敲减 Piezo1 对周细胞 YAP/TAZ/JNK 信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.7 敲减Piezo1对ox-LDL干预的周细胞中Piezo1的荧光表达的影响 |
| 3.8 敲减Piezo1对ox-LDL干预的周细胞中YAP的荧光表达的影响 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 第三节 黄芪丹参组分及其配伍对周细胞生物学功能和炎性反应及信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞来源 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CCK-8 |
| 2.2 实验分组及药物干预方法 |
| 2.3 划痕实验 |
| 2.4 Transwell迁移实验 |
| 2.5 RT-PCR |
| 2.6 Western Blot |
| 2.7 免疫荧光 |
| 2.8 钙流检测 |
| 2.9 敲减 Piezo1 蛋白 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Sal-B和AS-Ⅳ的最佳干预浓度 |
| 3.2 药物治疗后不同组别周细胞的迁移能力 |
| 3.3 Transwell迁移实验检测不同组别周细胞的迁移能力 |
| 3.4 药物通过 YAP/TAZ 通路调节 Piezo1 表达并且缓解周细胞炎性反应 |
| 3.5 药物通过调节YAP/TAZ蛋白改善周细胞的炎性反应 |
| 3.6 药物对 Piezo1 钙内流的影响 |
| 3.7 药物干预对周细胞 Piezo1 荧光表达的影响 |
| 3.8 药物干预后周细胞中YAP蛋白的荧光表达 |
| 3.9 敲减 Piezo1 对黄芪丹参组分配伍干预下周细胞 YAP/TAZ/JNK 信号通路基因表达的影响 |
| 3.10 敲减 Piezo1 对黄芪丹参组分配伍干预下周细胞 YAP/TAZ/JNK 信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.11 Piezo1敲减及黄芪丹参组分配伍治疗对Piezo1蛋白表达的影响 |
| 3.12 Piezo1敲减及黄芪丹参组分配伍治疗对YAP蛋白表达的影响 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语英汉对照表 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
| 附件 |
（2）运动预适应对力竭大鼠心室肌钠离子流的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题来源及研究的目的和意义 |
| 1.2 国内外研究现状及分析 |
| 1.2.1 运动性心律失常与钠离子通道及钠离子电流的关系 |
| 1.2.2 运动与HIF-1α的关系 |
| 1.2.3 SIRT1 调节Na V1.5和HIF-1α |
| 1.2.4 运动预适应对心脏损伤的防护机制研究 |
| 1.3 研究内容与方法 |
| 1.4 研究创新点 |
| 第二章 实验研究 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验试剂与器材 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 各组大鼠一般情况比较 |
| 3.2 各组大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白-I(c Tn-I)浓度比较 |
| 3.3 各组大鼠心电图Ⅱ导联的变化 |
| 3.4 各组大鼠心室肌细胞动作电位及其参数的比较 |
| 3.5 各组大鼠心室肌细胞钠电流比较 |
| 3.6 运动预适应对Na V1.5 通道蛋白门控机制的作用 |
| 3.7 各组大鼠心室肌组织Na V1.5、HIF-1α、SIRT1 及膜蛋白NaV1.5 表达差异 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 运动预适应对体重的影响 |
| 3.2 运动预适应对心肌损伤标志物的影响 |
| 3.3 运动预适应对心电图的影响 |
| 3.4 运动预适应对钠电流的影响 |
| 3.5 运动预适应对HIF-1α、SIRT1和Na V1.5 蛋白表达的影响 |
| 3.6 全文总结 |
| 3.7 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 HIF-1α的作用机制及在心血管中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）稳心颗粒调控氧化应激和钙循环防治依鲁替尼诱发房颤的效应机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 化疗诱发心脏毒性易感基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 稳心颗粒及其主要成分对心肌的保护作用 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 一、依鲁替尼增强小鼠房颤易感性的机制研究 |
| (一) 依鲁替尼通过肌浆网上异常的钙释放和心肌纤维化增强小鼠房颤易感性 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| (二) 依鲁替尼诱发房颤小鼠心房组织的蛋白质组学分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| (三) 依鲁替尼诱发房颤小鼠心房组织的蛋白表达验证 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 二、稳心颗粒对依鲁替尼诱发房颤小鼠的分子机制研究 |
| (一) 稳心颗粒治疗房颤的分子靶点预测 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| (二) 稳心颗粒对依鲁替尼诱发房颤小鼠心房组织的蛋白质组学分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| (三) 稳心颗粒对依鲁替尼诱发房颤小鼠钙循环和氧化应激的分子机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）青壮年猝死综合征心脏疾病相关基因变异及云南不明原因猝死高发区IRX4基因Y77C变异研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 青壮年猝死综合征心脏疾病相关基因变异研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 云南不明原因猝死高发区IRX4基因Y77C变异研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 全细胞膜片钳技术在遗传性长QT综合征和不明原因猝死研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）基于胆固醇逆转运路径探讨PAP-1抗动脉粥样硬化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一章 文献研究 |
| 1 动脉粥样硬化的概述 |
| 1.1 动脉粥样硬化的特征 |
| 1.2 动脉粥样硬化的危害 |
| 2 动脉粥样硬化的发病机制 |
| 2.1 脂质代谢紊乱 |
| 2.2 炎性因子形成 |
| 2.3 氧化应激 |
| 2.4 自身免疫 |
| 2.5 细胞凋亡 |
| 3 动脉粥样硬化的治疗途径 |
| 3.1 改善自身生活方式 |
| 3.2 他汀类药物治疗 |
| 3.3 PCSK9抑制剂 |
| 3.4 电压门控性钾离子通道Kv1.3抑制剂 |
| 3.4.1 电压门控性钾离子通道Kv1.3与动脉粥样硬化 |
| 3.4.2 Kv1.3特异性抑制剂PAP-1 |
| 3.4.3 PAP-1与动脉粥样硬化的关系 |
| 参考文献 |
| 第二章 PAP-1对巨噬源性泡沫细胞胆固醇逆转运的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 溶液配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞活力检测 |
| 2.4 油红O染色实验 |
| 2.5 细胞总/游离胆固醇测定 |
| 2.6 免疫荧光 |
| 2.7 蛋白提取 |
| 2.8 免疫印迹(Western Blotting)分析 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ox-LDL诱导Raw264.7建立巨噬源性泡沫细胞模型 |
| 3.1.1 ox-LDL对Raw264.7巨噬细胞增殖活力影响 |
| 3.1.2 ox-LDL对Raw264.7巨噬细胞脂质蓄积影响 |
| 3.1.3 ox-LDL对Raw264.7巨噬细胞总/游离胆固醇含量影响 |
| 3.1.4 ox-LDL对Raw264.7巨噬细胞内脂质转运相关蛋白(CD36/MSR1/ABCA1/ABCG1)表达影响 |
| 3.2 PAP-1对ox-LDL诱导的巨噬源性泡沫细胞的影响 |
| 3.2.1 PAP-1对Raw264.7巨噬细胞活力影响 |
| 3.2.2 PAP-1对巨噬源性泡沫细胞活力影响 |
| 3.2.3 PAP-1降低巨噬源性泡沫细胞脂质蓄积 |
| 3.2.4 PAP-1降低巨噬源性泡沫细胞总/游离胆固醇含量 |
| 3.2.5 PAP-1下调巨噬源性泡沫细胞CD36/MSR1并上调ABCA1/ABCG1蛋白表达 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 PAP-1对动脉粥样硬化大鼠胆固醇逆转运的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂与材料 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型准备 |
| 2.2 动物分组与给药 |
| 2.3 标本与取材 |
| 2.4 血脂水平及生化分析 |
| 2.5 血清炎症因子水平测定 |
| 2.6 H&E染色分析 |
| 2.7 免疫印迹(Western Blotting)分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PAP-1对动脉粥样硬化大鼠一般状态影响 |
| 3.2 PAP-1降低动脉粥样硬化大鼠血清血脂(TC/FC/TG/LDL-C)水平 |
| 3.3 PAP-1降低动脉粥样硬化大鼠炎症因子(IL-1β/IL-6/TNF-α)水平 |
| 3.4 PAP-1减轻动脉粥样硬化大鼠颈动脉病理 |
| 3.5 PAP-1下调动脉粥样硬化大鼠颈动脉CD36/MSR1并上调ABCA1/ABCG1蛋白表达 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 PAP-1对动脉粥样硬化大鼠的心脏保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂与材料 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型建立与给药 |
| 2.2 高分辨小动物超声影像 |
| 2.3 标本组织取材 |
| 2.4 心肌细胞麦胚凝集素(WGA)染色 |
| 2.5 心肌组织Masson染色 |
| 2.6 心肌组织免疫组化实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 PAP-1对动脉粥样硬化大鼠心脏形态与功能的影响 |
| 3.2 PAP-1抑制动脉粥样硬化大鼠心肌细胞肥大 |
| 3.3 PAP-1减轻动脉粥样硬化大鼠心肌纤维化 |
| 3.4 PAP-1降低动脉粥样硬化大鼠心肌(IL-1β/IL-6/TNF-α)炎症水平 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附录 Abbreviations:英文缩略词 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）MicroRNA-217-5p靶向作用于CLIC4在动脉粥样硬化过程中对血管内皮细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:研究动脉粥样硬化中CLIC4及miR-217-5p在动脉内皮细胞中的表达情况 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和生产公司 |
| 2.2 主要配制试剂及配制方法 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法及步骤 |
| 2.4.1 动物模型建立及分组 |
| 2.4.2 小鼠主动脉内皮细胞分离 |
| 2.4.3 HE染色 |
| 2.4.4 油红0色 |
| 2.4.5 人主动脉内皮细胞培养及分组处理 |
| 2.4.6 实时荧光定量PCR |
| 2.4.7 Western blot检测蛋白表达 |
| 2.4.8 免疫荧光染色检测 |
| 2.4.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠主动脉苏丹Ⅳ染色结果 |
| 3.2 小鼠主动脉HE染色结果 |
| 3.3 小鼠主动脉油红O染色结果 |
| 3.4 实时荧光定量PCR结果 |
| 3.5 Western blot结果 |
| 3.6 免疫荧光染色检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 过表达miR-217-5p及敲低CLIC4对ox-LDL处理的主动脉内皮细胞的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及生产公司 |
| 2.2 主要配制试剂及配制方法 |
| 2.3 主要仪器与设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实验分组 |
| 2.4.2 人主动脉内皮细胞转染 |
| 2.4.3 实时荧光定量PCR检测miR-217-5p的水平 |
| 2.4.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.4.5 Hoechst染色检测细胞凋亡 |
| 2.4.6 Western blot测定蛋白含量 |
| 2.4.7 JC-1 测定线粒体膜电位 |
| 2.4.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 过表达miR-217-5p后的相关实验结果 |
| 3.1.1 过表达miR-217-5p后荧光定量PCR检测miR-217-5p结果 |
| 3.1.2 过表达miR-217-5p后细胞凋亡检测结果 |
| 3.1.3 过表达miR-217-5p后JC-1 检测线粒体膜电位结果 |
| 3.1.4 miR-217-5p过表达后Hoechst染色检测细胞凋亡结果 |
| 3.1.5 过表达miR-217-5p后Westernblot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况 |
| 3.1.6 miR-217-5p过表达后线粒体及胞质中细胞色素C水平Western lot检测结果 |
| 3.2 敲低CLIC4 后的相关实验结果 |
| 3.2.1 Western blot检测验证转染效果 |
| 3.2.2 敲低CLIC4后细胞凋亡检测结果 |
| 3.2.3 敲低CLIC4后JC-1 检测线粒体膜电位结果 |
| 3.2.4 敲低CLIC4后Hoechst染色检测细胞凋亡结果 |
| 3.2.5 敲低CLIC4后Western lot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况 |
| 3.2.6 CLIC4敲低后线粒体及胞质中细胞色素C水平Western blot检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 miR-217-5p与CLIC4的靶向关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂及生产公司 |
| 2.2 主要配制试剂及其配制方法 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 过表达miR-217-5p后测定人主动脉内皮细胞中CLIC4 水平 |
| 2.4.1.1 细胞转染 |
| 2.4.1.2 荧光定量PCR检测细胞模型中CLIC4水平 |
| 2.4.1.3 Western blot检测细胞模型中CLIC4水平 |
| 2.4.2 荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性 |
| 2.4.2.1 双荧光素酶检测 |
| 2.4.3 miR-217-5p、CLIC4共转染 |
| 2.4.3.1 细胞培养及转染 |
| 2.4.3.2 实时荧光定量PCR检测CLIC4转染效果 |
| 2.4.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.4.3.4 Western blot检测 |
| 2.4.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 实时荧光定量PCR检测细胞模型中CLIC4水平 |
| 3.2 Western blot检测细胞模型中CLIC4水平 |
| 3.3 荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性 |
| 3.4 实时荧光定量PCR及Western lot验证CLIC4过表达转染效果 |
| 3.5 流式细胞术测定细胞凋亡 |
| 3.6 Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞内氯离子通道蛋白 4(CLIC4)的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）抗氧化型低密度脂蛋白的抗体通过调节单核巨噬细胞的Ca2+/K+通道抑制MCP-1的释放（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 动脉粥样硬化 |
| 1.2 氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)与动脉粥样硬化 |
| 1.3 抗oxLDL抗体与动脉粥样硬化 |
| 1.3.1 抗oxLDL抗体 |
| 1.3.2 抗oxLDL抗体的致病性 |
| 1.3.3 抗oxLDL抗体保护动脉粥样硬化 |
| 1.4 单核细胞趋化因子-1(MCP-1)与动脉粥样硬化 |
| 1.5 单核细胞、巨噬细胞与动脉粥样硬化 |
| 1.5.1 单核细胞 |
| 1.5.2 巨噬细胞 |
| 1.6 清道夫受体与动脉粥样硬化 |
| 1.6.1 清道夫受体(SR) |
| 1.6.1.1 SR-A1 |
| 1.6.1.2 CD36 |
| 1.6.1.3 LOX-1 |
| 1.7 Toll样受体4(TLR-4)与动脉粥样硬化 |
| 1.8 FcγR与动脉粥样硬化 |
| 1.9 MAPK信号通路与动脉粥样硬化 |
| 1.10 离子通道与动脉粥样硬化 |
| 1.10.1 离子通道 |
| 1.10.1.1 钙离子通道 |
| 1.10.1.2 钾离子通道 |
| 1.11 研究目的 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 细胞 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 从PBMCs分离CD14~+人单核细胞 |
| 2.2.1.1 从人的外周血(PBMCs)分离单个核细胞 |
| 2.2.1.2 用CD14 MicroBeads标记细胞 |
| 2.2.1.3 使用LS柱子和人工操作的分MACS分选器分离CD14阳性细胞 |
| 2.2.2 准备oxLDL和不含oxLDL的血清 |
| 2.2.3 BCA法蛋白定量 |
| 2.2.4 细胞复苏、传代及冻存 |
| 2.2.5 细胞内钙离子成像 |
| 2.2.6 离子通道电生理学的记录 |
| 2.2.7 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.8 MCP-1酶联免疫吸附测定实验 |
| 2.2.9 oxLDL酶联免疫吸附测定实验 |
| 2.2.10 统计分析方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 OxLDL通过TLR-4和依赖MAPK的信号通路诱导单核巨噬细胞释放MCP-1 |
| 3.2 OxLDL通过钾离子通道和钙离子通道诱导单核巨噬细胞MCP-1的释放 |
| 3.3 OxLDL抑制RAW264.7细胞内向整流钾离子通道(K_(ir))的活动 |
| 3.4 OxLDL通过TLR-4、ERK-和JNK抑制K_(ir)通道的活动 |
| 3.4.1 OxLDL通过TLR-4抑制K_(ir)通道的活性 |
| 3.4.2 OxLDL通过ERK和JNK抑制K_(ir)通道的活动 |
| 3.5 oxLDL通过ERK和JNK信号通路诱导巨噬细胞内的钙离子浓度震荡 |
| 3.6 抗oxLDL抗体(BI-204)通过FcγRIIB抑制MCP-1释放 |
| 3.7 抗oxLDL抗体(BI-204)通过结合FcγRIIB逆转oxLDL诱导的Kir通道关闭 |
| 3.8 OxLDL通过TLR-R激活ERK |
| 3.8.1 OxLDL呈剂量依赖性地激活MAPK信号通路 |
| 3.8.2 OxLDL通过TLR-4激活MAPKs |
| 3.9 抗OxLDL抗体(BI204)拮抗oxLDL诱导的ERK的激活 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读学位期间发表学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（8）新疆地区维吾尔族心房颤动患者单核苷酸基因多态性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 新疆维吾尔族心房颤动患者临床特点分析 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 新疆维吾尔族心房颤动患者SCN5A基因、CETP基因多态性关联研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 新疆维吾尔族心房颤动患者Cx40 基因、AGT基因及eNOS基因多态性关联研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 心房颤动患者易感基因单核苷酸多态性研究 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（9）二十二碳六烯酸对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道电生理作用及对细胞内钙离子浓度的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 正常大鼠冠状动脉平滑细胞的分离 |
| 一、材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 1. 实验大鼠的选择及饲养环境 |
| 2. 正常大鼠冠状动脉的分离 |
| 3. 冠状动脉平滑肌细胞分离 |
| 四、参考文献 |
| 第二章 DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞钾离子通道的激活作用 |
| 一、材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 二、结果 |
| 1. DHA使用前后大鼠冠状动脉平滑肌细胞钾离子电流的变化 |
| 2. DHA对冠状动脉平滑肌细胞不同钾离子电流的影响 |
| 三、讨论 |
| 1. DHA对冠状动脉平滑肌细胞钾离子通道的激活作用 |
| 2. DHA主要激活冠状动脉平滑肌细胞的BK通道 |
| 四、参考文献 |
| 第三章 DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道激活的电生理机制 |
| 一、材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 二、结果 |
| 1. 全细胞膜片钳模式下不同浓度DHA对BK通道电流的影响 |
| 2. 单通道膜片钳模式下不同浓度DHA对BK通道开放概率的影响 |
| 三、讨论 |
| 1. DHA对血管平滑肌细胞BK通道的激活作用 |
| 2. 不同浓度DHA对BK通道的激活机制 |
| 四、参考文献 |
| 第四章 DHA对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道激活的钙离子信号通路机制 |
| 一、材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 二、结果 |
| 1. 不同钙离子浓度对BK通道开放概率的影响 |
| 2. DHA对细胞内钙离子浓度的影响 |
| 3. 应用PLC-IP3信号通路抑制剂后DHA对细胞内钙离子浓度影响 |
| 4. 应用PLC-IP3信号通路抑制剂后DHA对BK通道电流影响 |
| 三、讨论 |
| 1. 细胞内钙离子浓度测定的方法及意义 |
| 2. 不同钙离子浓度对BK通道开放概率影响 |
| 3. 不同浓度DHA对细胞内钙离子浓度的影响 |
| 4. DHA通过PLC-IP3途径增加细胞内钙离子浓度 |
| 5. DHA通过PLC-IP3-Ca~(2+)途径激活冠状动脉平滑肌细胞的BK通道 |
| 四、参考文献 |
| 论文总结 |
| 综述1 正常冠状动脉平滑肌细胞离子通道的分布和特点 |
| 参考文献 |
| 综述2 N-3多不饱和脂肪酸对正常冠状动脉平滑肌细胞离子通道的影响 |
| 参考文献 |
| 综述3 N-3多不饱和脂肪酸与心房颤动 |
| 参考文献 |
| 附录1 英文缩写词 |
| 附录2 三年学习期间发表在核心和/或统计源期刊以上论文 |
| 致谢 |
（10）CaN/NFAT抑制剂对SHR T淋巴细胞CaN/NFAT信号通路、钾通道及炎症因子的体内干预研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 CaN/NFAT抑制剂对SHR的T淋巴细胞活化增殖后Kv1.3 钾通道电流的阻滞作用 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 CaN/NFAT抑制剂对SHR的T淋巴细胞CaN/NFAT信号通路的影响 |
| 1 实验内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计分析 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 CaN/NFAT抑制剂对SHR的T淋巴细胞中Kv1.3 和炎症因子的表达的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析方法 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述一 炎症因子与高血压的关系 |
| 参考文献 |
| 综述二 钾通道与CaN/NFAT信号通路 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简介 |
| 导师评阅表 |
四、膜片钳技术在动脉粥样硬化研究中的应用（论文参考文献）
- [1]黄芪丹参及其组分配伍干预动脉粥样硬化的实验效应及其对周细胞炎症损伤的影响[D]. 裴可. 山东中医药大学, 2021
- [2]运动预适应对力竭大鼠心室肌钠离子流的作用及机制研究[D]. 李佳鑫. 河北大学, 2021(11)
- [3]稳心颗粒调控氧化应激和钙循环防治依鲁替尼诱发房颤的效应机制[D]. 杨欣宇. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]青壮年猝死综合征心脏疾病相关基因变异及云南不明原因猝死高发区IRX4基因Y77C变异研究[D]. 刘凯. 昆明医科大学, 2021
- [5]基于胆固醇逆转运路径探讨PAP-1抗动脉粥样硬化的作用及机制研究[D]. 缪玉影. 南京中医药大学, 2021(02)
- [6]MicroRNA-217-5p靶向作用于CLIC4在动脉粥样硬化过程中对血管内皮细胞凋亡的影响[D]. 张晓天. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]抗氧化型低密度脂蛋白的抗体通过调节单核巨噬细胞的Ca2+/K+通道抑制MCP-1的释放[D]. 苏金玉. 南方医科大学, 2020
- [8]新疆地区维吾尔族心房颤动患者单核苷酸基因多态性研究[D]. 班努·库肯. 新疆医科大学, 2020(08)
- [9]二十二碳六烯酸对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道电生理作用及对细胞内钙离子浓度的影响[D]. 赵晓溪. 苏州大学, 2019(06)
- [10]CaN/NFAT抑制剂对SHR T淋巴细胞CaN/NFAT信号通路、钾通道及炎症因子的体内干预研究[D]. 林红. 新疆医科大学, 2016(03)