一、母牛分支杆菌菌苗对结核病小鼠Th1/Th2细胞动力学及诱导型一氧化氮合酶表达影响的研究（论文文献综述）
吴雪琼,范琳[1]（2022）在《活动性结核病患者免疫功能状态评估和免疫治疗专家共识（2021年版）》文中研究说明结核病不仅是一种细菌感染性疾病,也是一种免疫性疾病,它的发生、发展及转归与患者的抗结核免疫功能密切相关。结核病患者通常在固有免疫和适应性免疫功能方面存在异常,检测其免疫细胞数量和免疫功能可评价其免疫功能状态,为临床施行免疫干预提供依据。对活动性结核病患者应用免疫制剂进行免疫干预,可增强其免疫功能,从而提高治愈率、缩短疗程,同时,可清除持留菌而降低复发率。尽管目前结核病免疫辅助诊断在临床应用广泛,然而,对结核病的抗结核免疫和免疫异常机制及其在结核病中的作用尚认识不足、缺乏深入的研究;对活动性结核病患者免疫功能状态评估的指征、评估指标的应用及其临床意义尚未达成一致意见;而免疫制剂的应用受到政策的限制,对活动性结核病患者免疫干预与否、免疫治疗的指征、免疫制剂的选择也未达成一致意见,临床应用不规范。为此,中国人民解放军总医院第八医学中心、《中国防痨杂志》编辑委员会、中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础和临床学部联合组织专家拟定《活动性结核病患者免疫功能状态评估和免疫治疗专家共识（2021年版）》。本共识概述了抗结核免疫及结核病患者免疫异常机制,介绍了我国临床常用的结核病患者免疫相关检测方法,提出了活动性结核病患者免疫功能状态评估的指征、方法及策略;系统介绍了我国临床可用的免疫治疗制剂,确定了活动性结核病患者免疫治疗的适应证和禁忌证,以帮助临床医师对活动性结核病患者适时、合理地进行免疫治疗。
牟宇泽[2]（2020）在《2型糖尿病并发肺结核患者血糖管理及营养状况与转归预后的关联研究》文中研究说明背景及目的:有研究表明,2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,DM）患者患活动性肺结核（Pulmonary tuberculosis,PTB）的风险是非糖尿病患者的3.59倍。与单纯PTB患者相比,糖尿病并发肺结核（DM-PTB）患者的结核特征性症状,包括咳嗽、盗汗、咯血等更为严重;治疗过程中体重恢复困难,病程延长;且更易发展为耐多药肺结核,导致治疗失败、复发、死亡的风险增高。血糖管理对糖尿病转归预后是至关重要的,血糖管理可分为血糖控制水平与血糖波动水平两方面。而结核作为一种感染性疾病可以通过引起应激性高血糖、影响降糖药物效果以及增加胰岛素需求量而导致糖尿病并发肺结核患者的血糖管理不良,引起并促进糖尿病病情恶化。已有的研究发现血糖控制不良与肺结核合并糖尿病患者就诊时的症状严重程度及肺部空洞率呈正相关,但对于治疗转归及预后的影响,目前的报道尚不多见且结论并不一致。同时,结核患者大多存在营养不良,营养状况与疾病转归存在显着关联,已有研究发现营养不良与结核患者治疗前两个月体重恢复较慢的风险增加有关,且营养不良患者复治及结核死亡的风险均要显着升高。DM-PTB患者的营养状况更加复杂,其对疾病转归的影响尚鲜见报道。因此,本研究的主要目的是探讨血糖管理情况及营养状况对糖尿病并发初治肺结核患者治疗转归预后的影响,并对DM-PTB患者抗结核治疗2个月（强化期治疗）痰转阴失败及抗结核治疗不理想结局,包括抗结核治疗失败及死亡等的影响因素进行探究,以期优化DM-PTB患者的抗结核治疗策略、改善转归预后提供科学依据。方法:本研究分为两章,第一章探讨血糖管理与DM-PTB患者转归预后的关联,血糖管理包括基于糖化血红蛋白（HbA1c）指标评价的血糖控制水平和根据指尖血糖变异程度及波动幅度评价的血糖波动情况。第一章中血糖控制对DM-PTB患者转归预后的影响采用前瞻性队列研究的方法。根据基线糖化血红蛋白水平将患者分为血糖控制良好（糖化血红蛋白<8.0%）和血糖控制不良（糖化血红蛋白8.0%）两组,比较两组患者的一般人口学特征、生活行为习惯及抗结核治疗过程中的结核特征症状、痰细菌学结果、影像学结果的变化。血糖波动采用纵向研究方法,根据血糖波动幅度将患者分为血糖正常波动组及血糖异常波动组;根据血糖变异系数将患者分为血糖低变异及血糖高变异两组。分别在基线、一个月时观察分析平均血糖波动幅度、血糖变异系数与结核特征性症状、痰菌转阴、肺部影像学特征等的关联。第一章纳入的患者为2017年12月至2019年12月期间,就诊于青岛市胸科医院,经临床诊断确诊为2型糖尿病并发初治肺结核的住院治疗患者,且需满足在入院时进行了糖化血红蛋白（HbA1c）指标的检测,或抗结核治疗开始后至少测量了2天（每天至少3次）日间不同时段指尖血糖值的患者。第二章采用前瞻性队列研究的方法,探讨营养状况对DM-PTB患者转归预后的影响。根据患者基线时的营养状况进行分组,比较两组患者的一般人口学特征、生活行为习惯及治疗过程中的结核特征症状、痰细菌学结果、影像学结果的变化。纳入自2018年3月至2019年3月期间,就诊于青岛市胸科医院,经临床诊断为2型糖尿病并发初治肺结核的住院治疗患者,且收集到抗结核治疗开始时（即基线）血液样本的患者,按患者基线是否患有低蛋白血症、淋巴细胞减少症、贫血以及体质指数（BMI）进行分组。采用单因素及多因素Cox回归模型判断2个月痰转阴失败及抗结核治疗不良结局的相关危险因素,用风险比（Hazard Ratio,HR）对影响因素与转归预后的关联强度进行评估,使用95%置信区间（95%CI）对总体参数的范围进行估计。结果:在血糖管理与DM-PTB患者转归预后的关联分析中（第一章）,在基线时共纳入404例DM-PTB患者。研究发现DM-PTB患者中基线血糖控制不良的患者占54.70%、血糖异常波动的患者占52.17%、血糖高变异的患者占55.28%。血糖管理不良与患者基线结核症状及指征相关。且发现血糖控制不良的患者2个月痰转阴率更低,但并未发现最终治疗结局间存在差异。在对混杂因素（性别、年龄及糖尿病病程）进行调整后发现基线血糖控制不良（HR=2.01,95%CI:1.10-3.67）、吸烟者（HR=2.29,95%CI:1.07-4.02）及基线淋巴细胞减少症（HR=1.80,95%CI:1.01-3.19）会增加2个月痰转阴失败的风险。在对年龄、糖尿病病程、基线痰细菌学检查呈阳性以及基线糖化血红蛋白水平进行调整后发现,吸烟者（HR=2.11,95%CI:1.02-4.37）及基线低蛋白血症（HR=2.34,95%CI:1.18-4.61）是在接受抗结核治疗后,最终呈现不理想结局的独立危险因素。在营养状况对DM-PTB患者转归预后影响的研究中（第二章）,基线时共纳入245例DM-PTB患者。发现DM-PTB患者基线合并低蛋白血症的比例为24.49%、合并淋巴细胞减少症的患者占23.27%、合并贫血的患者占25.71%、BMI 24.0kg/m2的患者占34.04%。无论抗结核治疗强化期还是巩固期,合并低蛋白血症的患者痰转阴率均下降,并且抗结核治疗不理想结局的风险升高。在对性别、年龄、糖尿病病程及吸烟情况进行调整后,发现基线患有低蛋白血症（HR=1.86,95%CI:1.08-3.20）是2个月痰转阴失败的独立危险因素;并在对混杂因素进行调整后发现,低蛋白血症（HR=1.85,95%CI:1.08-3.15）还增加了抗结核治疗后呈现不理想结局的风险。结论:基线血糖控制不良及营养不良的糖尿病并发肺结核患者抗结核治疗期间痰转阴率降低,且基线营养不良的患者在抗结核治疗后呈现不理想结局的可能性升高。基线血糖控制不良、淋巴细胞减少症、低蛋白血症、吸烟者会增加患者抗结核治疗2个月痰转阴失败的风险;基线合并低蛋白血症、吸烟者会增加抗结核治疗不理想结局的风险。故此应加强DM-PTB患者的血糖管理,严格的血糖管理可能会在一定程度上改变基线血糖管理不良对治疗结局的影响;同时加强烟草的管控力度以及改善患者健康状况,扭转营养不良,这能够改善肺结核转归过程,降低DM-PTB患者抗结核治疗不理想结局的风险。
黄珊[3]（2020）在《二甲基精氨酸二甲胺水解酶DDAH2抑制先天免疫抗病毒信号通路传导》文中研究表明研究目的:先天性免疫系统是机体防御病原体感染的第一道防线,其中RLR-MAVS信号通路是先天性免疫系统抵抗病毒入侵的关键信号通路。RNA病毒感染后,可以激活RLR-MAVS信号通路,从而调控一型干扰素以及促炎症因子的表达,此信号通路的失调或者过度活化将引起多种疾病。因此,探究这一信号通路的精细调控机制具有十分重要的意义。此外,我们还希冀借由RLR-MAVS抗病毒信号通路调节机制的研究,明确一些未在先天性免疫系统中被探究过的蛋白的功能。研究内容:作为一种二甲基精氨酸二甲胺水解酶,DDAH2主要在血管化组织和免疫组织中表达,其在血管化组织中的作用已经被广泛报道,而其在免疫组织中的作用鲜为人知。我们开启了DDAH2在免疫系统中的研究工作,首先,研究其在抗病毒信号通路RLR-MAVS的活化过程中起到的具体调控作用,以及其对于抗病毒反应的调控作用;其次,研究其调控抗病毒信号通路RLR-MAVS活化的具体机制及靶点;最后,以DDAH2作为媒介,研究一氧化氮信号通路和RLR-MAVS抗病毒信号通路之间的相互调节作用。研究方法:1.利用蛋白免疫共沉淀实验分离得到与MAVS具有相互作用的蛋白质;2.利用蛋白质谱方法鉴定与MAVS具有相互作用的蛋白质;3.提取野生型或者Ddah2-/-小鼠的骨髓来源巨噬细胞和胚胎成纤维细胞来确定DDAH2对于RLR-MAVS信号通路的调控作用;4.通过过表达和敲低实验确定DDAH2对于RLR-MAVS信号通路的调控作用;5.通过免疫荧光实验确定DDAH2的亚细胞定位,Drp1磷酸化水平以及定位,线粒体形态;6.通过细胞组分分离实验确定DDAH2的亚细胞定位;7.通过流式细胞术检测一氧化氮的产生;8.通过格里斯实验检测细胞培养基上清中的一氧化氮含量;9.通过半变性琼脂糖凝胶电泳实验检测MAVS聚集体形成情况;10.通过蛋白质磷酸化质谱检测DDAH2被TBK1磷酸化的具体氨基酸残基位点;11.通过构建DDAH2点突变体,探究DDAH2被TBK1磷酸化之后,在促进一氧化氮产生,线粒体移位,调控线粒体形态以及调控RLR-MAVS信号通路活化上的作用。研究结果:1.通过蛋白质免疫共沉淀以及蛋白质谱检测发现DDAH2与MAVS存在相互作用;2.通过DDAH2的过表达和敲降实验检测发现DDAH2负调控RLR-MAVS信号通路的活化,并负调控RLR-MAVS信号通路激活的抗病毒免疫反应;3.通过免疫荧光实验发现DDAH2在RNA病毒感染或RLR-MAVS信号通路激活后会转移到线粒体上,发现在RNA病毒感染后,Drp1磷酸化水平升高并与线粒体共定位,此外,发现RNA病毒感染或RLR-MAVS信号通路激活后,DDAH2的存在会造成线粒体的分裂;4.通过细胞组分分离实验检测发现DDAH2在RNA病毒感染或RLR-MAVS信号通路激活后转移到线粒体上;5.通过流式细胞术发现敲低DDAH2后,RNA病毒感染诱导的一氧化氮的生成量明显降低,也发现过表达DDAH2点突变体之后无法增加病毒诱导的一氧化氮的生成量;6.通过格里斯实验发现DDAH2敲除之后,病毒诱导的一氧化氮的生成量明显降低;7,通过半变性琼脂糖凝胶电泳实验发现DDAH2抑制病毒诱导的MAVS聚集体的产生;8.通过蛋白质磷酸化质谱找到TBK1磷酸化DDAH2的位点;9.通过过表达DDAH2的点突变体,发现DDAH2在被TBK1磷酸化之后无法转位到线粒体上,无法促进一氧化氮的产生以及造成线粒体的分裂,从而无法抑制RLR-MAVS信号通路的活化。研究结论:在RLR-MAVS信号通路激活时,DDAH2转位到线粒体以促进一氧化氮在线粒体微环境中的富集,进而,富集的一氧化氮有效地促进Drp1诱导的线粒体裂变以抑制MAVS聚集体的形成以及下游信号的转导。此外,TBK1可以磷酸化DDAH2,从而抑制DDAH2的转位和一氧化氮的产生。由此确定DDAH2为RLR-MAVS信号通路活化的负调控因子,并揭示DDAH2是RLR-MAVS信号通路与一氧化氮信号通路之间互相调节的重要中介因子。最后,我们的研究还证实了TBK1在一氧化氮信号通路中的新调节功能。
庞慧[4]（2020）在《耐药分枝杆菌SNP突变及对巨噬细胞极化的影响》文中进行了进一步梳理目的:结核病（Tuberculosis,TB）仍然属于公共卫生危机,近10余年,由于耐药菌株的出现,全球TB形势恶化,病患每年都呈大幅增长。耐药是TB无法得到很好控制的重要因素。2018年流行病学资料显示,印度（27%）、中国（14%）和俄罗斯联邦（9%）是全球耐药TB负担最大的三个国家。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）的治疗主要依靠化学药物,然而由于用药不规范、药物诱导细菌基因突变等原因,使得MTB对于多种抗结核药物产生耐药,甚至出现耐多药、广泛耐药MTB。随着近年来诊疗技术的提高,发现以往鉴定为MTB,实际上是非结核分支杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM）,引起类似TB的临床症状及影像学表现,然而NTM对常规一线抗结核药物天然耐药。因而,寻找快速有效的诊疗手段刻不容缓。从分枝杆菌自身而言,已有大量研究表明单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）突变是造成MTB耐药的重要原因,而SNP突变能否造成NTM耐药?肺脏是分枝杆菌感染的主要部位,而肺脏中存在的巨噬细胞既是分枝杆菌的宿主,也是分枝杆菌入侵肺部后最主要的吞噬细胞。巨噬细胞在功能上具有连续性,这一连续性的两个极端是M1型即经典活化的巨噬细胞和M2型即选择性活化的巨噬细胞。进一步根据分泌细胞因子不同将M2分为M2a、M2b、M2c以及M2d四种亚型,其中M2c由于高分泌抑制性细胞因子又被称作失活型巨噬细胞。分枝杆菌也可能改变已激活状态的巨噬细胞,从而导致其细胞因子及代谢产物诱导型一氧化氮合酶、乳酸等产生。STATs是影响M1和M2型巨噬细胞极化的重要因素,STAT1与M1型巨噬细胞极化有关,而STAT3与M2型巨噬细胞激活相关,两者是巨噬细胞极化潜在调节的临界点。分枝杆菌感染对巨噬细胞极化的不同状态、功能发挥以及细菌感染转归有关键作用。本研究旨在了解临床分离分枝杆菌耐药及SNP突变耐药机制;耐药分枝杆菌感染巨噬细胞的极化特征;通过构建耐药分枝杆菌,体外作用于巨噬细胞,研究耐药分枝杆菌感染后,对巨噬细胞极化微环境的影响,为筛选耐药分枝杆菌诊疗靶点提供理论依据。因此,采用了以下实验策略:1.分枝杆菌的分离培养、药敏试验及SNP耐药机制研究,了解分枝杆菌的耐药状况以及SNP突变引起耐药的具体机制;2.了解M1/M2巨噬细胞及其分泌细胞因子在不同组别临床样本中的表达水平,特别是敏感与耐药分枝杆菌感染患者外周血巨噬细胞水平及极化特征;3.构建SNP突变耐药分枝杆菌,用于体外感染巨噬细胞,研究SNP突变耐药分枝杆菌对巨噬细胞极化微环境的作用;4.小干扰RNA（Small interfering RNA）敲低IL-10,研究抑炎性细胞因子在SNP突变耐药分枝杆菌对巨噬细胞极化微环境中作用机制。方法:1.比例法药物敏感性试验:用于临床MTB分离株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素、对氨基水杨酸、左氧氟沙星以及丙硫异烟胺的药物敏感性测定。2.微量肉汤稀释法:用于临床鸟分枝杆菌分离株对于氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物敏感性检测;用于耐药BCG株诱导,以最终耐药BCG的MIC值>敏感BCG MIC值的8倍为诱导成功标准。3.细胞培养:用于Thp1细胞的培养,继而由PMA刺激Thp1细胞,分化为M0巨噬细胞（PMA-Thp1）,用于细胞模型实验中。4.流式细胞术:检测临床样本外周血单个核细胞表面以及用于体外检测BCG感染M0巨噬细胞后CD11b、CD86、CD206表达水平。采用FITC-CD11b、APC-CD86、PE-CD206流式抗体对细胞进行标记染色,作为M1/M2型巨噬细胞表达水平的标志。5.流式细胞因子微球测定法:采用巨噬细胞流式细胞因子微球法,利用PE标记的微球上抗体与巨噬细胞分泌细胞因子的一端结合,而APC标记荧光抗体显色的方法,用于分析临床样本外周血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、、IL-12、IL-10、TGF-β1、精氨酸酶-1等的表达情况,作为M1/M2型巨噬细胞亚型区分的重要指征。6.CCK检测:选取不同菌量（MOI=5、10、20、40）的敏感BCG或耐药BCG感染M0巨噬细胞,了解BCG感染对巨噬细胞活性的影响,以确定合适的实验菌浓度。7.q RT-PCR:用于检测BCG感染M0巨噬细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10、TGF-β1等表达水平。8.Western blot:用于检测BCG感染M0巨噬细胞后细胞中STAT1、STAT3蛋白表达水平。9.比色法:通过诱导型一氧化氮合酶及乳酸测定试剂盒,用于分析BCG感染M0巨噬细胞模型培养上清中乳酸及诱导型一氧化氮合酶的检测。10.转染:在M0巨噬细胞中,通过小干扰RNA敲低IL-10,分析IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10、TGF-β1、诱导型一氧化氮合酶、乳酸、STAT1、STAT3等表达水平。结果:1.研究的132株结核分枝杆菌中,耐多药结核菌20（15.15%）株,广泛耐药结核菌1（0.76%）株,敏感菌111株。其中耐异烟肼菌株32（24.24%）株,耐利福平菌株23（17.42%）株,耐乙胺丁醇菌株13（9.85%）株,耐链霉素菌株35（26.52%）株,耐卡那霉素菌株2（1.52%）株,耐对氨基水杨酸菌株5（3.79%）株,耐左氧氟沙星菌株8（6.06%）株,无丙硫异烟胺耐药菌株。2.研究的95株鸟分枝杆菌中,对氧氟沙星（89/95,93.68%）和环丙沙星（88/95,92.63%）显示出较高耐药性,莫西沙星（18/95,18.95%）在实验菌株中显示出良好活性。阿米卡星（2/95,2.11%）显示出对临床分离菌株的较好活性,而链霉素（62/95,65.26%）对于菌株的抗性较差。3.耐药鸟分枝杆菌对于氟喹诺酮类药物最常见gyr A的SNP是T→C（71/95,74.74%）,氨基酸突变主要发生在Gly2444Asp（GGT→GAT）（20/95,21.05%）。gyr B的SNP最主要是A→C（69/95,72.63%）,及其相应的氨基酸替换为Ile2160Val（ATT→GTT）（21/95,22.11%）。对于氨基糖苷类抗生素的SNP最常见于在rps L的G→A位置（73/95,76.84%）发生突变,氨基酸突变主要涉及Ala1539985Thr（GCC→ACC）（19/95,20.00%）。4.TB患者比正常体检者外周血中M1型巨噬细胞表达显着下降（P=0.0001）,耐药TB较敏感TB表达明显下降（P=0.0280）。TB患者比正常体检者外周血中M2型巨噬细胞表达显着升高（P<0.0001）,耐药TB较敏感TB表达有升高趋势（P=0.4950）。5.不同研究对象外周血中分泌细胞因子测定结果显示,IL-6在TB患者比正常体检者表达显着升高（P=0.0005）,IL-10在TB患者较正常体检者（P=0.0624）表达升高,TGF-β1在TB患者比正常体检者表达水平显着升高（P<0.0001）,精氨酸酶-1在TB患者较正常体检者有明显下降（P<0.0001）。根据分泌细胞因子的不同,敏感TB患者以M2b型巨噬细胞为主,耐药TB患者偏向M2c型巨噬细胞分化。6.用野生型的敏感BCG构建耐药菌株,结果显示敏感BCG的MIC值为0.125μg/ml,耐药BCG的MIC值为>128μg/ml。异烟肼耐药基因inh A和kat G测序后比对发现,inh A有T→G突变,kat G有A→T突变。SNP突变耐药BCG诱导成功。7.敏感或耐药BCG感染M0巨噬细胞后,1)M1型细胞因子表达:与正常对照组（M）比较,IL-6和TNF-α在耐药组（R）及敏感组（S）中表达均明显升高,但R组表达显着低于S组（P=0.0036,P=0.0201）;IL-1β在R组、S组中表达较M组升高（P=0.0841,P=0.0468）,而R组与S组间无区别;以上结果提示BCG感染诱导了巨噬细胞活化,但耐药BCG能力弱于敏感株。2)M2型细胞因子表达:与M组相比,IL-10在R组、S组中均为显着增高,但R组较S组具有更为显着的表达（P=0.0155）;TGF-β1在R组较S组中表达水平显着降低（P=0.0274）;提示BCG感染均可引起抑制性细胞因子升高,敏感BCG以TGF-β1为主,耐药BCG以IL-10升高更为明显。3)STAT1及STAT3:与M组相比,S组STAT1表达明显升高（P=0.0043）,但R组与M组无差异状态;STAT3表达在R组及S组均明显升高（P=0.0035,P<0.0001）,两个组间无显着区别（P=0.0771）;提示BCG感染活化巨噬细胞,耐药BCG感染以STAT3升高为主。8.敲低IL-10后,用敏感或耐药BCG感染M0巨噬细胞:1)IL-6在耐药组（R’）组较敏感组（S’）显着降低（P=0.0004）,与未敲低IL-10组比,即R’组与R组比较也为显着降低（P=0.0005）;提示IL-6的表达依赖于IL-10。2)TGF-β1表达在si-IL-10作用组整体表现降至很低水平,提示TGF-β1表达对IL-10具有依赖性。3)敲除IL-10与未敲除IL-10两组细胞在敏感BCG（S’与S组）作用下,S’诱导STAT1的能力受到影响;耐药BCG诱导STAT1的能力较敏感BCG更弱;而STAT3在R’组显着低于S’组（P=0.0018）;R’组比R组也有显着降低（P=0.0041）。提示STAT活化与IL-10作用的具有相关性。4)敲低IL-10后,i NOS、乳酸在R’组表达水平均呈显着升高,提示IL-10对耐药BCG诱导i NOS、乳酸具有一定的抑制性。结论:1.鸟分枝杆菌对于氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素的耐药具有与MTB相似的SNP耐药机制。SNP突变是分枝杆菌产生耐药的重要原因。2.TB患者外周血中M2型巨噬细胞水平显着增高,抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β1表达升高;耐药TB患者主要偏向M2c型巨噬细胞分化,处于失能状态。3.成功构建了SNP突变的耐药BCG;耐药BCG感染巨噬细胞,巨噬细胞产生M1型细胞因子的能力降低,更倾向于M2型分化。4.耐药BCG感染致巨噬细胞促炎性细胞因子IL-6、TNF-α降低,提示不利于自身清除。5.耐药BCG活化巨噬细胞STAT分子的能力依赖IL-10;促巨噬细胞向M2分化、表达IL-6以及产生杀菌酶依赖于IL-10。
晁金[5]（2019）在《牛支原体强弱菌株感染对犊牛免疫反应及其外周血单个核细胞转录谱调节的研究》文中认为牛支原体是影响肉牛和奶牛养殖业的一种重要病原,主要导致肺炎,乳腺炎和关节炎等。抗生素对牛支原体病的治疗效果较差,且耐药性产生迅速。市场上商用化灭活疫苗免疫保护力较低,弱毒疫苗可望提供更好的保护效果,但目前尚无可用的商业化牛支原体弱毒疫苗。牛支原体的致病机制和诱导的机体免疫反应不清楚是阻碍疫苗研发的重要因素。本研究通过比较牛支原体强弱菌株接种后牛体临床症状、大体和组织病理学变化、器官带菌情况、体液免疫反应、细胞免疫反应、细胞因子水平、外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）转录组学及组织中关键因子的表达等,对牛支原体引起的机体应答反应进行了比较研究,以期全面揭示牛支原体的致病机制和免疫机制。主要研究内容如下:1.牛支原体强弱菌株动物感染模型的建立将20头断奶奶公犊分为4组,P1组滴鼻感染牛支原体野生株（n=6）,P150-ND组滴鼻感染致弱菌株P150株（n=6）,P150-HI组皮下注射接种P150株（n=4）,阴性对照组用PPLO滴鼻（NC组,n=4）。临床症状观察发现:牛支原体P1能够刺激犊牛产生较为严重的呼吸道症状,直肠体温升高;P150-ND组犊牛接种后没有出现显着的临床症状;P150-HI组犊牛接种后应激反应较大。P1株导致犊牛出现较为严重的肺脏病变,入侵并定植于呼吸道组织,还能入侵肺门淋巴结、脾脏、肾脏等器官,鼻腔排菌在22d以上;P150-ND与P150-HI组犊牛无显着的大体和肺脏病变,组织中没有分离到牛支原体,鼻腔排菌时间小于18d。2.牛支原体强弱菌株及不同接种途径对犊牛体液免疫的影响测定犊牛感染后的抗体水平,结果表明,牛支原体强弱菌株鼻黏膜感染后均能够诱导血清中各种抗体的产生,以Ig G和Ig A为主,其中P150株感染犊牛28d后血清中的Ig G2水平显着高于P1组（p<0.05）;牛支原体强弱菌株均能诱导唾液中一过性的Ig A和Ig M;P1组犊牛鼻腔灌洗液中的Ig A显着增加（p<0.05）;与P150-ND组相比,P150-HI组犊牛的血清各抗体水平,唾液中Ig A水平均较低（p<0.05）。3.牛支原体强弱菌株及不同接种途径对犊牛细胞免疫的影响各感染组感染后第14d PBMC的增殖指数均高于NC组（p<0.05）。P1感染犊牛后第14d和21d PBMC的总凋亡细胞显着高于P150-ND组,活细胞数比例显着低于P150-ND组（p<0.05）。P150-ND组犊牛PBMC中CD4+细胞比例显着高于P1组和NC组（p<0.05）;P1组犊牛CD4+/CD8+细胞比率显着低于NC组（7d,p<0.05）。这表明,P1株能诱导机体PBMC的凋亡,而P150株黏膜接种能够引起机体较强的CD4+细胞分化。利用蛋白芯片进一步检测了犊牛感染后7d和14d全血刺激后上清中细胞因子的水平。结果显示,P1组MIG、TNF-α、IFN-γ、IL-13水平显着低于NC组（p<0.05）,表明牛支原体强毒株感染动物后,血液某些促炎因子的分泌受到抑制;P150-ND组除IL1F5的表达水平显着高于NC组（p<0.05）外,其IFN-γ、IL-1α、IL1F5、TNF-α、MIG和IP10的表达水平显着高于P1组（p<0.05）;P150-HI组在接种后第7天全血上清中的IL-1α和GASP1水平显着低于P150-ND组。4.牛支原体强弱菌株感染犊牛后外周血单个核细胞转录组表达谱的研究分析牛支原体强弱菌株感染犊牛后第7d PBMC的转录谱,结果发现:与NC组相比,P1组单独上调和下调的基因分别为874和519个;P150组单独上调和下调的基因分别为540和274个。GO功能分析发现强毒株P1单独上调的基因主要富集在炎性反应、凋亡过程和RNA调节过程等生物学过程。KEGG pathway分析发现这些基因涉及bacterial invasion of epithelial cells和Fc gamma R-mediated phagocytosis等通路;P1单独下调的基因主要富集在氧化还原过程、细胞黏附I-κB激酶的调控等生物学过程,涉及的KEGG pathway主要为ABC transporters和NFk B信号。进一步分析发现,上调基因SYK,TP53,IL-6,STAT3,ATP5B,GSK3B,ACTG1及下调基因UBC,TNF,TLR4,INS,HSPA8,NFKBIA,INSR,NOS3和BIRC3是P1调控宿主反应的重要差异表达基因。其中,大部分上调基因涉及Th17细胞分化,SYK和UBC是强毒株调节机体应答反应的关键基因,可能参与强毒菌株P1对机体的免疫抑制。弱毒株P150组单独上调的基因主要富集在信号转导、细胞增殖与分裂、蛋白质泛素化和SUMO样降解及基因组核苷酸的修复等生物学过程;KEGG pathway分析发现这些基因涉及nucleotide excision repair和ubiquitin mediated proteolysis等通路;P150单独下调的基因主要富集在细胞黏附、ATP合成的调控及K48相关的蛋白去泛素化等生物学过程,机体果糖和甘露糖的代谢通路可能受到了影响。UBE2I,RAD23B,GTF2H4,SOCS1,MDM2,TCEB1,CDK7,ITCH,UBE2D3,UBE2E3和RCHY1可能在P150对机体的免疫保护中起重要作用。这些基因大部分为泛素化相关酶,功能涉及Th1,Th2及Th17反应的调控,其余涉及核苷酸的剪切修复。将171个随菌株毒力增加基因表达梯度增加的基因进行分析,发现这些基因主要涉及RNA的过程调控及血小板的激活功能,inflammatory mediator regulation of TRP channels和bacterial invasion of epithelial cells可能参与了牛支原体诱导的机体免疫反应调控。TRPV4、CALM和ITPR1可能是参与这些梯度变化的重要基因。牛支原体强毒株P1诱导机体肺脏发生的损伤可能与TRPV4参与的TRP通道有关,CALM和ITPR1可能也参与了这种损伤调节。5.牛支原体强弱菌株调节宿主反应重要差异基因的验证将分析得到的重要差异基因与犊牛平均日增重和病理变化评分进行相关性分析,发现18个基因和9个基因与大体评分和肺脏评分分别呈显着正相关和负相关（p<0.05）,另外1个基因和两个基因与大体评分显着正相关与负相关（p<0.05）;1个基因和4个基因与平均日增重显着正相关和负相关（p<0.05）。其中,IFN-γ与病理变化评分显着负相关（p<0.05）,与平均日增重显着相关（p<0.05）;IL-17D与病理变化评分显着相关（p<0.05）。对犊牛感染强毒菌株后PBMC和肺组织中涉及Th17细胞分化通路中关键因子的表达水平进行验证。结果表明,P1组PBMC中IL-23R和IL-21R,肺组织中IL-6、IL-23R和IL-21R的m RNA表达水平高于其他两组（p<0.05）;P1组肺组织中IL-6和IL-21R的蛋白水平显着上升（p<0.05）。P1组犊牛全血上清中的IL-17A水平在感染后第14d显着高于NC组和P150组（p<0.05）。综合分析后,推测P1株感染犊牛后可能使机体产生致病性的Th17反应,这种反应是Teff17细胞分化上调和Treg细胞分化抑制的综合结果,与牛支原体造成的病理损伤相关。P150组全血上清中的IFN-γ水平在感染后第7d显着高于NC组和P150组（p<0.05）,表明候选疫苗P150株促进机体的Th1反应。综上所述,牛支原体强弱菌株诱导的机体应答反应差异主要体现在细胞免疫上方面。强毒株P1诱导机体PBMC的早期凋亡,抑制机体炎性因子如IFN-γ和TNF-α的分泌和相关基因如TNF,TLR等的表达,从而逃避宿主的免疫识别和清除,入侵并定植在机体多个组织;P1通过上调犊牛PBMC中Th17细胞分化相关基因,增强致病性Teff17反应,抑制Treg17反应,从而促进IL-17A的分泌,这种反应可能与牛支原体导致的肺脏病变相关;SYK和UBC是P1影响机体反应应答的关键基因;P1诱导的机体肺脏损伤可能与TRPV4介导的TRP通道有关。致弱菌株P150诱导机体PBMC中CD4+细胞比例的增加,促进Th1反应,使机体产生较高水平的细胞因子如IFN-γ,快速产生免疫应答,这些应答反应的调节可能与蛋白的泛素化调节和核苷酸的修复有关。另外,牛支原体强弱毒株均能诱导机体产生体液免疫,以血清Ig G和Ig A的水平增加为主,弱毒株组犊牛在接种后28d的血清Ig G2水平高于强毒株组,强毒株P1可引起鼻腔灌洗液中Ig A水平升高。本研究更新了对牛支原体发病机理和免疫机制的理解,为有效防控牛支原体相关疾病的措施提供基础依据与支持。
呙阳[6]（2015）在《EBP50重组慢病毒对巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的影响及相关机制研究》文中研究说明研究目的:构建EBP50基因的重组慢病毒表达载体,进行病毒包装后体外感染巨噬细胞,探讨EBP50对巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染能力的影响,并分别从巨噬细胞吞噬体与溶酶体融合率、诱导性一氧化氮合酶表达水平和NO产生水平、巨噬细胞的自噬和凋亡水平等方面探讨EBP50影响巨噬细胞抗Mtb感染能力的相关机制。研究方法:1.重组慢病毒表达质粒的构建:采用PCR方法从质粒p LEM中扩增出EBP50基因,然后克隆进慢病毒表达质粒p Lenti-146-GFP中,构建重组慢病毒表达质粒p Lenti-146-EBP50,构建完成后经限制性内切酶酶切鉴定和测序鉴定。2.慢病毒的包装及滴度测定:分别将慢病毒表达质粒（p Lenti-146-EBP50以及对照慢病毒载体p Lenti-146-GFP和p Lenti）和慢病毒包装载体（p MD2.G和ps PAX2）共转染293T细胞,72h后收集细胞培养上清液中的慢病毒颗粒,采用超滤离心管浓缩法进行病毒颗粒的浓缩,获取重组慢病毒LV-EBP50、LV-Lenti-GFP和LV-Lenti。将浓缩后的慢病毒LV-Lenti-GFP感染RAW264.7细胞,通过流式细胞仪计数GFP阳性表达的细胞比率,明确所获慢病毒的滴度,并确定重组慢病毒感染RAW264.7细胞的最适滴度。3.重组慢病毒表达效果鉴定:重组慢病毒以MOI=10感染RAW264.7细胞,于24h、48h、72h荧光显微镜观察荧光表达,确定慢病毒表达的最佳时间,并且于最佳表达时间分别采用荧光定量RT-PCR和Western blot法检测EBP50在RAW264.7细胞中的表达。4.探讨EBP50对巨噬细胞杀伤Mtb能力的影响:采用上述重组慢病毒以MOI=10感染RAW264.7细胞,72h后再用Mtb H37Rv株对RAW264.7细胞进行感染,于Mtb感染后的不同时间点裂解细胞进行Mtb的培养、计数。5.探讨EBP50影响巨噬细胞杀伤Mtb能力的相关机制:采用上述重组慢病毒以MOI=10感染RAW264.7细胞,72h后进行指标检测:（1）EBP50对巨噬细胞i NOS表达及分布的影响:收集并裂解细胞,采用Western-blot法检测i NOS的表达水平;采用H37Rv-GFP对RAW264.7细胞进行感染,24h后采用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜检测各组细胞中Mtb与i NOS的共定位情况;（2）EBP50对巨噬细胞NO产生水平的影响:收集细胞培养上清,采用硝酸还原酶法检测上清液中NO的水平;（3）EBP50对巨噬细胞内Mtb吞噬体成熟情况的影响:采用H37Rv-GFP对RAW264.7细胞进行感染,24h后采用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜检测各组细胞中Mtb与溶酶体的共定位情况;（4）EBP50对巨噬细胞自噬水平的影响:收集细胞,采用Cyto-ID Autophagy detection kit自噬检测试剂盒通过流式细胞术检测细胞的自噬水平;裂解细胞,采用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3的表达变化;（5）EBP50对巨噬细胞凋亡水平的影响:采用凯基Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒试剂盒通过流式细胞术检测RAW264.7细胞的凋亡水平。研究结果:1.酶切和测序结果显示成功构建了重组慢病毒表达质粒p Lenti-146-EBP50。2.成功获取了重组慢病毒LV-EBP50、LV-Lenti-GFP和LV-Lenti,滴度均在1.0×107TU/ml以上,可以用于细胞水平的研究。同时,流式细胞术的检测结果显示,重组病毒以MOI=10（病毒比细胞）的感染复数感染RAW264.7细胞72h时荧光表达最强,且细胞状态良好。3.重组慢病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR与Westernblot均能检测到EBP50的表达上调,证实重组慢病毒可成功在RAW264.7细胞中表达所携带的重组基因。4.与LV-Lenti-GFP对照组比较,LV-EBP50感染组RAW264.7细胞对Mtb的杀伤能力显着增强。5.与LV-Lenti感染组比较,LV-EBP50感染显着上调RAW264.7细胞i NOS的表达水平和NO产生量,但对巨噬细胞中Mtb与i NOS的共定位率没有显着影响。6.与LV-Lenti感染组比较,LV-EBP50感染组RAW264.7细胞的自噬水平升高,LC3的表达量也明显上调,同时,LV-EBP50感染可有效提高巨噬细胞中Mtb与溶酶体的共定位率。7.与LV-Lenti感染组比较,LV-EBP50感染组RAW264.7细胞的凋亡水平显着升高。结论:1.本研究成功构建了EBP50重组的慢病毒表达载体,并通过慢病毒包装获取了可在巨噬细胞中有效表达EBP50的慢病毒LV-EBP50。2.EBP50过表达可促进巨噬细胞对Mtb的杀伤功能。3.EBP50促进巨噬细胞对Mtb杀伤能力的机制可能与以下两方面的因素有关:（1）通过上调巨噬细胞的自噬水平,经自噬-溶酶体途径促进Mtb吞噬体与溶酶体的融合。（2）上调巨噬细胞自身的凋亡水平。
王平[7]（2014）在《表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠免疫治疗效果评价》文中研究说明结核病（tuberculosis，TB）是由分枝杆菌属中的结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染性疾病，主要通过气溶胶形式在人群中传播。自上世纪九十年代以来，MTB耐药菌株的出现和增加、TB合并人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者的增多、人口流动性增加，特别是目前唯一可用于预防TB的疫苗——卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG）对成人的保护效果欠佳等原因，使得TB疫情不能得到有效控制。因此，研制新的预防性或兼具治疗性的TB疫苗，是TB防治研究中的重要内容。目前TB的传播难以得到有效控制的主要原因有：1)MTB感染机体后，MTB特殊的脂质表面结构导致其可在巨噬细胞内长期存活，以持留菌的形式或潜伏状态存在，而感染者并不出现临床症状或症状轻微，这些潜伏感染者的发病是新增TB病例的主要来源；2)耐药菌株增加，尤其是多重耐药性MTB的出现和流行，使得原用于TB治疗的化学药物对耐药菌的作用甚微。因此，针对MTB耐药性以及持续性感染状态，研发新的TB预防和治疗制剂及药物、探索新的治疗措施和途径具有重要意义。分枝杆菌属中的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一种能够快速生长的、非致病性的分枝杆菌，能够高效表达外源性基因，是TB新型疫苗研究的理想候选载体。抗原85B（Ag85B）和6kDa早期分泌靶抗原（6kDa early secretedantigen target，ESAT-6）均为MTB感染早期分泌表达的免疫优势抗原，以其为靶抗原单独或融合后构建的基因疫苗、亚单位疫苗和重组BCG等均能有效刺激机体产生特异性的抗MTB免疫应答。此外，国内外研究表明，MTB热休克蛋白65（heat shockprotein65，Hsp65）及辅助性T细胞1型（Th1）细胞因子——白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）也均能有效刺激机体产生对MTB的免疫应答。【研究目的】以MS为表达载体，构建能够分泌表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组MS（rMS），观察rMS诱导小鼠特异性免疫应答尤其是细胞免疫应答的能力；评价其作为治疗性疫苗单独或与抗TB化学药物联合应用对MTB耐药株感染小鼠及MTB标准株低剂量感染小鼠的免疫治疗效果。【实验方法和研究结果】1.重组耻垢分枝杆菌（Ag85B-ESAT-6-rMS）的构建及鉴定以MTB H37Rv株（标准株）基因组DNA为模版，多聚酶链式反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）扩增ag85B基因片段和携带疏水性氨基酸残基基因连接片段（linker）的esat-6基因片段。经T4连接酶连接后，PCR扩增获得融合基因ag85B-linker-esat-6。将融合基因克隆入pMD18-T载体后，再将其亚克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中，进行酶切鉴定和序列测定。结果显示，可切出预期大小片段，测序分析表明ag85B和esat-6基因与GenBank公布的序列完全一致，将其命名为pDE22-ag85B-esat-6。将pDE22-ag85b-esat-6电穿孔转化MS感受态细菌，提取质粒后采用酶切法进行基因型鉴定，结果证明切出的目的基因片段大小与预期一致。将基因型鉴定正确的rMS菌株经42℃热诱导表达后，SDS-PAGE分析并采用抗Ag85B的多克隆抗体和抗ESAT-6的单克隆抗体对表达产物进行Western blot鉴定。结果表明rMS菌可分泌表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白，证明rMS构建成功，将其命名为Ag85B-ESAT-6-rMS。2. Ag85B-ESAT-6-rMS诱导小鼠的免疫应答方法：取68周龄雌性BALB/c小鼠75只，随机分成5组（每组15只），即Ag85B-ESAT-6-rMS组、BCG组、MS组、纯化的Ag85B-ESAT-6融合蛋白（AE）组及生理盐水对照组。rMS组和MS组分别经背部皮下注射相应细菌1×107CFU/只，间隔2周，共免疫3次；BCG组经背部皮下注射BCG1×107CFU/只，仅免疫1次；AE组经腹股沟皮下包埋含20μg AE的硝酸纤维素膜，间隔3周，共免疫2次。初次免疫后第1周起，每周采集各组小鼠尾静脉血（共采集6周），无菌分离外周血单核细胞（PBMC），分析CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比；初次免疫后第6周，乙醚麻醉后处死小鼠，无菌法取各组小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，分别检测其特异性增殖指数（SI）、CTL杀伤活性，以及分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的淋巴细胞频数。结果：①Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的PBMC中CD4+T细胞与CD8+T细胞所占百分比之和均高于其他各组（P<0.05）；②Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的脾淋巴细胞SI高于生理盐水组、AE免疫组和MS免疫组（P<0.05），而与BCG免疫组相比无显着差异（P>0.05）；③Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的脾淋巴细胞CTL杀伤效率高于生理盐水组和MS组（P<0.05），与AE免疫组和BCG免疫组比无显着差异（P>0.05）；④Ag85B-ESAT-6-rMS免疫组小鼠的脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2的细胞频数分别高于其他各组（P<0.05），分泌IL-4的细胞频数与BCG免疫组和MS免疫组相比无显着差异（P>0.05）。以上结果表明，Ag85B-ESAT-6-rMS可诱导小鼠强烈的免疫应答，并以Th1型细胞免疫应答为主。3. Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB耐利福平株感染小鼠模型的免疫治疗方法：①取MTB耐利福平（Rifampin，RFP）株经尾静脉注射感染68周龄的雌性BALB/c小鼠（1×106CFU/只），感染后第4周，无菌分离小鼠脾脏和肺脏，制作组织切片，进行HE染色观察和抗酸染色检查，平板计数法分别检测两脏器的荷菌数（CFU）。②与上述同样方法用MTB耐RFP株感染小鼠，并将感染小鼠随机分为8组（15只/组），即异烟肼（Isoniazid，INH）治疗组、RFP治疗组、Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组、 Hsp65-IL-2-rMS治疗组、 INH+Ag85B-ESAT-6-rMS联合治疗组、INH+Hsp65-IL-2-rMS联合治疗组、 MS治疗组、生理盐水对照组。其中Ag85B-ESAT-6-rMS组、Hsp65-IL-2-rMS组和MS组分别在感染后6周和10周经小鼠背部皮下注射1×107CFU的rMS或MS；联合治疗组在感染后第6周开始用INH给小鼠灌胃治疗，持续4周，第10周时再经小鼠背部皮下分别注射1×107CFU的两种rMS；RFP组和INH组自感染后第6周开始灌胃治疗，持续8周。③观察并记录各组小鼠活动及体重变化情况；在治疗后第4周和第8周，分别无菌分离小鼠脾脏和肺脏，同上进行抗酸染色检查、HE染色观察，并进行荷菌数检测。④治疗后统计各组小鼠存活率。结果：①感染小鼠模型肺和脾中均可见抗酸杆菌（+++），HE染色可见慢性肉芽肿性炎的表现，肺和脾荷菌数分别达105和104CFU，表明MTB耐RFP株感染小鼠模型建立成功；②生理盐水组、RFP组和MS组的小鼠体重均呈下降趋势，INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组、INH+Hsp65-IL-2-rMS组、Ag85B-ESAT-6-rMS组和Hsp65-IL-2-rMS组的小鼠体重均呈显着增长趋势（P<0.05）；③治疗后第4周和第8周各组小鼠肺组织中抗酸染色镜检的结果显示，生理盐水组和RFP组均呈强阳性（++++或+++），其次为MS组（+++），而Ag85B-ESAT-6-rMS组和Hsp65-IL-2-rMS组为（++），INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组、INH+Hsp65-IL-2-rMS组和INH组均为（+）；④治疗后第4周和第8周各组小鼠肺组织HE染色观察结果显示，各组小鼠肺组织均呈慢性炎症反应，除INH组外其他各组均呈慢性肉芽肿性炎的表现，肺间质增生并纤维化，表明MS和rMS可引起小鼠肺组织一定程度的病理损伤；⑤治疗后第4周和第8周，Ag85B-ESAT-6-rMS组、Hsp65-IL-2-rMS组、INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组、INH+Hsp65-IL-2-rMS组和INH组小鼠脾和肺的荷菌数（log10CFU）均低于生理盐水对照组（P<0.05），表明两种rMS均能有效抑制MTB耐RFP株在小鼠组织中的增殖，具有免疫治疗作用，与INH联合应用时的治疗效果较单独用rMS的治疗效果更好；⑥rMS与INH联合治疗组小鼠存活率均高于rMS单独治疗组和MS组，但是与生理盐水对照组无差别，结果提示各组存活率排序除与小鼠MTB脏器荷菌数的多少有关之外，还与小鼠肺组织显示的病理损伤（间质增生并纤维化）程度一致。4. Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB H37Rv株低剂量感染小鼠的免疫治疗方法：①取MTB H37Rv株经尾静脉注射感染68周龄的雌性C57BL/6小鼠（1×104CFU/只），分别于感染第6周和第10周时，无菌分离小鼠脾和肺脏，制作组织切片进行抗酸染色检查和HE染色观察，平板计数法计脏器荷菌数（CFU）。②与上述同样方法用MTB H37Rv株感染小鼠，并将其随机分为4组（30只/组），即Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组、RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS联合治疗组、RFP/INH治疗组和感染模型对照组；各组治疗均在感染后第10周开始，其中Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组经背部皮下注射1×107CFU/只，间隔4周后同样方法免疫第2次；RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS联合治疗组先用RFP/INH通过饮水治疗4周后，再用Ag85B-ESAT-6-rMS通过皮下注射治疗，剂量同上，间隔4周后同样方法免疫第2次；RFP/INH药物治疗组通过饮水治疗，持续12周；各组小鼠在治疗结束4周后，通过肌肉注射地塞米松诱导小鼠MTB感染的复发。③观察并记录各组小鼠活动及体重变化情况；分别在实验开始后第8周、13周、17周、22周和26周无菌分离小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，采用ELISpot检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数；④分别在第10周、14周、18周、22周和第26周无菌分离小鼠肺、脾组织，进行抗酸染色检查、HE染色观察及荷菌数（CFU）检测。结果：①感染小鼠肺和脾中均可见抗酸杆菌（++），HE染色可见慢性炎症反应（无典型慢性肉芽肿性炎的病理表现），肺和脾荷菌数分别为104CFU和103CFU，表明MTB低剂量感染小鼠模型建立成功；②各组小鼠体重均呈缓慢增长趋势，各组间无显着差异（P>0.05）；③在各自的免疫治疗后的4周和第8周，Ag85B-ESAT-6-rMS组和RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数均高于感染模型对照组（P<0.05）；④治疗后各组小鼠肺组织的HE染色观察均可见轻至中度慢性炎症反应，未见明显的病理性损伤表现。⑤治疗后，Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组小鼠和RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS治疗组小鼠的肺、脾荷菌数均低于感染模型对照组（P<0.05），其中联合治疗组的效果更为显着；地塞米松诱导后，该两组小鼠肺、脾荷菌数虽然上升，但仍低于感染模型对照组（P<0.05）。【结论】本研究成功构建了能分泌表达MTB Ag85B-ESAT-6融合蛋白的Ag85B-ESAT-6-rMS，该菌能够诱导免疫小鼠以Th1型为主的细胞免疫应答。Ag85B-ESAT-6-rMS能够抑制MTB耐RFP株在小鼠肺和脾组织中的增殖，对该菌株感染小鼠具有明显的免疫治疗作用，但同时也可引起感染小鼠肺组织一定的病理损伤；将Ag85B-ESAT-6-rMS与INH联合应用时的治疗效果显着优于单独用rMS治疗。Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB H37Rv株低剂量感染小鼠也有明显的免疫治疗作用；与RFP和INH联合治疗的效果要优于单独使用rMS；Ag85B-ESAT-6-rMS对MTB H37Rv株低剂量感染小鼠的免疫治疗后，小鼠肺组织未见明显病理损伤。Ag85B-ESAT-6-rMS作为治疗性疫苗有一定的优势，主要针对一些耐药菌或是残留于组织和细胞中低载量的休眠菌引发免疫清除，利用其可调节机体免疫系统功能，增强机体特异性免疫应答的特性，与化疗药物联用，发挥协同治疗作用。
侯江厚[8]（2012）在《免疫制剂在耐多药结核病治疗中作用的研究》文中研究说明目的研究胸腺五肽、重组人白介素（2rh-IL-2）和重组人干扰素（γrh-IFN-γ）三种免疫制剂在巨噬细胞吞噬耐多药结核分枝杆菌中的作用及可能的机制。方法鼠源巨噬细胞用培养基稀释后加入４８孔细胞培养板，每孔加入耐多药结核分枝杆菌，设为实验组和对照组，实验组由低到高分别加入不同浓度的胸腺五肽、rh-IL-2和rh-IFN-γ，对照组不加任何免疫制剂。培养24小时后，在显微镜下观察各组巨噬细胞吞噬耐多药结核分枝杆菌的活动情况，用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）测定各组吞噬耐多药结核分枝杆菌的相对量。结果（1）显微镜下观察，与对照组比较，巨噬细胞在高浓度胸腺五肽和rh-IL-2作用下吞噬耐多药结核分枝杆菌的数量多于低浓度，而巨噬细胞在高浓度rh-IFN-γ的作用下吞噬耐多药结核分枝杆菌的数量少于低浓度。（2）实时荧光定量PCR测定显示，添加低浓度的胸腺五肽、rh-IL-2和rh-IFN-γ后，实验组Ratio较对照组分别高3.34、3.71和12.24，随着浓度增加，胸腺五肽的Ratio值增加，rh-IL-2的Ratio值无显着性变化，rh-IFN-γ的Ratio值降低。结论胸腺五肽、rh-IL-2和rh-IFN-γ在体外均能促进鼠源巨噬细胞吞噬耐多药结核分枝杆菌，其中，胸腺五肽的作用具有依赖性，rh-IL-2的作用与浓度无关，而rh-IFN-γ应选择最适低浓度。目的研究胸腺五肽、rh-IL-2和rh-IFN-γ在耐多药结核病（MDR-TB）小鼠中的治疗作用和免疫学机制。方法165只成年雄性BALB/c小鼠，用含耐多药结核分枝杆菌的气溶胶感染后，采用随机数字表法分为对照组（不给予任何药物治疗）和7个实验组（胸腺五肽组、rh-IL-2组、rh-IFN-γ组、莫西沙星组、胸腺五肽+莫西沙星组、rh-IL-2+莫西沙星组和rh-IFN-γ+莫西沙星组），每组20只，另有5只作空白对照的小鼠在感染21天（设定为治疗0周）脱颈处死，余下160只当天开始给药治疗，治疗4、8、16、20周各组脱颈处死5只，4只小鼠观察血清细胞因子IFN-γ和IL-10的水平，肺脾活菌（CFU）计数和肺脾质量指数，余下1只小鼠肺组织作病理切片。结果（1）对照组：20周时小鼠血清IFN-γ水平较0周增高（P <0.05），而各时间段小鼠血清IL-10水平无显着性差异（P>0.05）。8周开始小鼠肺组织CFU显着低于治疗0周（P <0.05），而各时间段小鼠脾组织CFU无显着性差异（P>0.05）。治疗16周、20周小鼠肺指数降低（P <0.05），但病理切片则显示肺组织炎症病变程度从治疗4周至16周逐渐加重。而各时间段小鼠脾指数无显着性差异（P>0.05）。（2）三个免疫制剂治疗组（胸腺五肽组、rh-IL-2组和rh-IFN-γ组）：①血清细胞因子水平：与对照组0周相比，三个免疫制剂组小鼠血清IFN-γ水平于治疗20周时增高（P <0.05），而各时间段小鼠血清IL-10水平无明显变化（P>0.05）。在同一时间段，与对照组相比，胸腺五肽组于治疗4和8周时、rh-IL-2和rh-IFN-γ组于治疗8周时小鼠血清IFN-γ水平降低（P <0.05），而三组小鼠血清IL-10则均与对照组相接近（P>0.05）。②肺、脾组织CFU：在治疗的不同时间段和相同时间段，三个免疫制剂组小鼠肺组织CFU与对照组均相接近（P>0.05）。而在治疗的同一时段，与对照组相比，胸腺五肽组16、20周小鼠脾组织CFU降低（P <0.05），rh-IFN-γ组20周小鼠脾组织CFU降低（P <0.05），而rh-IL-2组小鼠脾组织CFU无明显变化（P>0.05）。③炎症：治疗8周时，三个免疫制剂组肺指数较对照组降低（P<0.05），病理切片显示各时间段肺组织炎症病变程度均为轻度。三个免疫制剂组脾指数均与对照组相接近（P>0.05）。（3）三个免疫制剂辅助莫西沙星治疗组（胸腺五肽+莫西沙星组、rh-IL-2+莫西沙星组和rh-IFN-γ+莫西沙星组）：①莫西沙星治疗：与对照组相比，治疗4、8、16周小鼠血清IFN-γ水平降低，治疗4周时IL-10水平降低（P <0.05）；小鼠肺CFU于治疗4、8周降低、16、20周达到0（P <0.05），脾CFU自治疗4周起即达到0；脾、肺指数自治疗8周始均降低（P <0.05），病理切片显示肺组织轻度炎症病变。②三个免疫制剂辅助莫西沙星治疗：三个免疫制剂辅助莫西沙星治疗组小鼠血清细胞因子IFN-γ和IL-10水平、肺脾CFU、肺脾质量指数、病理切片肺组织病变程度与莫西沙星组均相接近，无显着性无差异（P>0.05）。结论（1）小鼠感染耐多药MTB后，其自身先天性免疫可发挥作用，可能通过增强Th1优势免疫应答，促进肺组织耐多药MTB的杀灭、减轻肺组织炎症。（2）三种免疫制剂治疗早期（治疗8周）均可下调MDR-TB小鼠血清IFN-γ水平，但也不排除IFN-γ在免疫制剂促进巨噬细胞活化时被消耗，呈现Th1弱势免疫应答，但在治疗后期MDR-TB小鼠血清IFN-γ水平逐渐接近正常，恢复Th1优势免疫应答。这种免疫机制在治疗后期对清除小鼠脾组织耐多药MTB、在治疗早期减轻小鼠肺部炎症具有重要作用，但对清除小鼠肺组织耐多药MTB无明显作用。三种免疫制剂比较，胸腺五肽和rh-IFN-γ促进小鼠脾脏杀菌作用较强。（3）三种免疫制剂辅助莫西沙星治疗MDR-TB小鼠，因莫西沙星较为强大的杀菌作用，使三种免疫制剂的辅助作用未能体现，也提示免疫制剂是否能与强杀菌剂联用值得探讨。
张景鸿[9]（2012）在《灭活草分支杆菌雾化吸入对支气管哮喘气道炎症和Vγ1+、Vγ4+γδT细胞亚群的影响》文中进行了进一步梳理第一部分雾化吸入灭活草分支杆菌减轻哮喘小鼠气道炎症及对细胞因子IL-4、IL-10、IFN-y的影响目的：探讨雾化吸入灭活草分支杆菌对支气管哮喘小鼠气道炎症及肺组织细胞因子分泌的影响。方法：将50只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组：正常对照组（A）、哮喘模型组（B0、B3、B4、B5）、治疗组（C0、C3、C4、C5）、预防组（D）。用卵清蛋白（OVA）致敏和激发制成小鼠支气管哮喘模型。C组在卵蛋白激发后给予雾化吸入草分枝杆菌治疗,一天一次,C3、C4、C5分别治疗3天、4天、5天,D组在每次OVA激发前给予草分枝杆菌雾化吸入,一天一次。各组动物处死后提取肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）。肺组织进行病理HE染色、AB-PAS染色观察支气管肺炎症和气道粘液分泌情况,并行病理半定量分析。BALF离心后行炎症细胞计数,计算细胞总数及分类计数；酶联免疫吸附法检测BALF上清液中IL-4、IL-10、IFN-y水平。采用SPSS17.0软件统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用LSD法,病理半定量结果采用非参数秩和检验。结果：BALF中IL-4值治疗4天组（15.35±3.53）、5天组（14.48±4.21）、预防组（14.60±2.89）,分别较同期模型组（分别是28.41±4.45,30.524±3.57,26.81±3.59）减少（P<0.01）,IL-10值治疗4天组（70.00±6.28）、5天组（70.72±5.40）、预防组（71.36±6.46）较同期模型组（分别是46.53+4.41,45.47±4.14,47.68-4.47）增加（P<0.01）, IFN-γ值治疗4天组（243.80-58.78）、5天组（248.40-62.53）、预防组（259.00±43.29）较同期模型组（分别是166.20-54.25,157.20-51.74,175.20±55.35）增加（P<0.05）,BALF中嗜酸性粒细胞比例低于模型组,治疗5天组、预防组气道炎症病变均较模型组减轻,病理半定量结果差异有显着性（P<0.05）。结论：雾化吸入草分枝杆菌能减轻支气管哮喘小鼠气道炎症,其效应与调节细胞因子分泌有关。第二部分灭活草分支杆菌雾化吸入对支气管哮喘小鼠γδT细胞功能和Vy4+γδT细胞亚群的影响目的：观察雾化吸入灭活草分枝杆菌对哮喘小鼠气道炎症和γδT细胞功能的影响,探讨草分枝杆菌治疗哮喘与γδT细胞分泌细胞因子和Vγ1+、Vy4+γδT细胞亚群的关系方法：雄性Balb/c小鼠随机分为3组,每组6只,分别为：空白对照组（A）,哮喘模型组（B）,治疗组（C）。 OVA致敏激发制备支气管哮喘模型,C组予以草分枝杆菌雾化吸入治疗5天。治疗结束24小时内处死小鼠,收集肺组织标本。病理HE染色观察肺部及气道炎症状况。免疫组化染色检测肺内γδTCR表达以了解肺内γδT细胞分布。流式细胞学检γδT细胞胞内细胞因子IL-10和IFN-y。荧光定量PCR检测肺内Vγ1mRNA、Vy4mRNA表达量。结果：治疗组小鼠气道炎症较模型组明显减轻；IL-10+γδT细胞,IFN-γ+γδT细胞比模型组增加,有统计学差异（P<0.05）；治疗组小鼠肺组织Vy4mRNA表达量较模型组增加,Vγ1mRNA表达量较模型组降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：雾化吸入灭活草分枝杆菌能调节γδT细胞功能和Vγ1+、Vy4+γδT细胞亚群数量,其减轻哮喘气道炎症的作用可能与调节γδT细胞功能和亚群比例有关。第三部分雾化吸入灭活草分支杆菌减轻哮喘小鼠气道炎症及对TOLL样受体2表达的影响目的：研究雾化吸入灭活草分支杆菌对支气管哮喘小鼠气道炎症及肺组织细胞因子分泌的影响,探讨TOLL样受体2（TLR2）表达在雾化吸入灭活草分支杆菌防治支气管哮喘中的作用。方法：将24只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为3组,每组8只：正常对照组（A）、哮喘模型组（B）、干预组（C）。卵清蛋白（OVA）致敏制成小鼠支气管哮喘模型。C组在每次卵蛋白激发前给予雾化吸入草分枝杆菌治疗,一天一次。各组动物处死后提取肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）。进行病理HE染色、AB-PAS染色观察支气管肺炎症和气道粘液分泌情况,并行半定量分析。BALF中炎症细胞计数,检测BALF中IL-4、IL-10、IFN-y水平。实时定量PCR检测肺组织TLR2mRNA表达水平。结果：干预组BALF中IL-4分泌减少,IL-10、IFN-y增加（P<0.05）,BALF中嗜酸性粒细胞比例低于模型组,气道炎症病变较模型组减轻,肺组织TLR2mRNA表达水平较模型组显着升高（P<0.05）。结论：雾化吸入草分枝杆菌能减轻支气管哮喘小鼠气道炎症,其效应与调节肺内细胞因子分泌有关。草分枝杆菌可能通过上调TLR2基因的表达调节支气管哮喘的免疫失衡。第四部分雾化吸入草分枝杆菌对中度持续哮喘患者的治疗作用观察目的观察雾化吸入灭活草分枝杆菌治疗中度持续支气管哮喘的临床效果方法收集2010年6月至2011年3月广西医科大学第一附属医院门诊确诊为支气管哮喘患者,满足纳入标准：1)年龄大于18岁；2)支气管舒张实验阳性或支气管激发实验阳性；3)根据中华医学会《支气管哮喘防治指南》符合慢性持续性中度标准（即：每日均有症状；发作影响活动和睡眠；夜间哮喘症状≥每周一次；FEV1为69%-79%预计值或PEF为69%-79%个人最佳值）；4)无明显呼吸道感染5)从未接受糖皮质激素或如何抗炎治疗。中度持续性哮喘患者28名,随机分为两组：治疗组（A组）和对照组（B组）,每组14名患者。两组患者性别组成、年龄构成比无差异。A组患者给予雾化吸入灭活草分枝杆菌溶液治疗,一天一次,连续5天,且在一月后重复一次疗程。B组患者沙美特罗氟替卡松粉吸入剂,每天2次,持续应用。在第1天,第6天,第31天和第91天行肺功能检测和支气管激发试验,收集FVC, FEV1, PEF,记录乙酰甲胆碱累积量FEV1-PD20。治疗前、治疗后1月、3月末行ACT评分。结果：A组患者治疗后,FEV1和治疗前相比有上升趋势,但无统计学意义。B组患者第91天FEV1较治疗前明显升高（P<0.05）,两组PEF值在治疗后第6天,第31天和第91天均有升高（P<0.05）,A、B两组之间无明显差异。B组FEV1占预计值比值（FEV1%）第31天、第91天高于A组（P<0.05）。A、B两组FEV1-PD20值治疗后第6天,第31天和第91天均较治疗前增加（P<0.05）,两组之间无明显差异。两组患者治疗后激发试验转阴率,经卡方检验两组间相比差异无统计学意义（P>0.05）。两组ACT评分第31天、第91天较治疗前明显升高,有统计学意义（P<0.01）。结论：雾化吸入灭活草分枝杆菌一定程度上改善哮喘症状,减少急性发作和需要使用缓解药的次数。和沙美特罗氟替卡松吸入在减轻哮喘气道高反应性方面具有相同效果。雾化吸入草分枝杆菌可能作为一种更安全方便和依从性更好的哮喘替代治疗方法。
赵金秋,郭述良[10]（2011）在《结核病免疫治疗的进展及评价》文中认为化疗是治疗结核病最主要的方法,但是耐多药结核病（multiple drug resistant tuberculosis,MDR-TB）及广泛耐药结核病（extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB）使结核病的化疗陷入困境。化疗还存在疗程过长、二线抗结核药物价格昂贵和不良反应大,以及难于彻底根除休眠菌或持留菌等问题。鉴于结核病的发生、发展及转归与机体的免疫应答密切相关,人们试图通过调节机体免疫应答来治疗结核病。一、结核病免疫治疗的理论进展1.Th1/Th2应答失衡:机体对MTB的保护性免疫应答主要由T细胞介导,并显着依赖于Th1细胞因子的产生。
二、母牛分支杆菌菌苗对结核病小鼠Th1/Th2细胞动力学及诱导型一氧化氮合酶表达影响的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、母牛分支杆菌菌苗对结核病小鼠Th1/Th2细胞动力学及诱导型一氧化氮合酶表达影响的研究（论文提纲范文）
（1）活动性结核病患者免疫功能状态评估和免疫治疗专家共识（2021年版）（论文提纲范文）
| 抗结核免疫 |
| 一、 固有免疫应答 |
| 二、适应性免疫应答 |
| 结核病患者免疫异常的因素及机制 |
| 活动性结核病患者免疫功能状态评估方法、对象及策略 |
| 一、活动性结核病患者免疫功能状态评估的方法及意义 |
| 二、活动性结核病患者进行免疫功能状态评估的指征 |
| 三、活动性结核病患者进行免疫功能状态评估的策略 |
| 结核病免疫治疗的定义、作用及目的 |
| 结核病免疫治疗制剂的种类和临床应用 |
| 一、免疫活性物质 |
| (一)细胞因子 |
| (二)小分子活性肽 |
| 二、治疗性疫苗 |
| (一)灭活疫苗 |
| (二)亚单位疫苗 |
| 三、化学制剂 |
| 四、免疫抑制剂 |
| 五、中成药制剂 |
| 活动性结核病患者免疫治疗的适应证和禁忌证 |
（2）2型糖尿病并发肺结核患者血糖管理及营养状况与转归预后的关联研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 血糖管理与2型糖尿病并发肺结核患者转归预后的关联研究 |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 样本含量的计算 |
| 3 伦理学要求 |
| 4 诊断标准 |
| 5 研究内容及方法 |
| 6 主要变量定义 |
| 7 质量控制 |
| 8 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 一般特征比较 |
| 2 糖尿病相关指征 |
| 3 血糖管理与基线结核相关症状及指征关联性分析 |
| 4 强化期转归 |
| 5 6个月转归 |
| 6 临床治疗结局 |
| 7 抗结核治疗2个月痰转阴失败危险因素的单因素分析 |
| 8 抗结核治疗2个月痰转阴失败危险因素的多因素分析 |
| 9 抗结核治疗后呈现不理想结局危险因素的单因素分析 |
| 10 抗结核治疗后呈现不理想结局危险因素的多因素分析 |
| 讨论 |
| 第二章 营养状况与2型糖尿病并发肺结核患者转归预后的关联研究 |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 伦理学要求 |
| 3 诊断标准 |
| 4 研究内容及方法 |
| 5 主要变量定义 |
| 6 质量控制 |
| 7 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 一般特征比较 |
| 2 糖尿病相关指征 |
| 3 营养状况与基线结核相关症状及指征关联性分析 |
| 4 强化期转归 |
| 5 6个月转归 |
| 6 临床治疗结局 |
| 7 抗结核治疗2个月后痰转阴失败危险因素的单因素分析 |
| 8 抗结核治疗2个月后痰转阴失败危险因素的多因素分析 |
| 9 抗结核治疗后呈现不理想治疗结局危险因素的单因素分析 |
| 10 抗结核治疗后呈现不理想治疗结局危险因素的多因素分析 |
| 讨论 |
| 结论与建议 |
| 1 结论 |
| 2 建议 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 在校期间参与项目 |
| 致谢 |
（3）二甲基精氨酸二甲胺水解酶DDAH2抑制先天免疫抗病毒信号通路传导（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、DDAH2与MAVS存在相互作用 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 蛋白质谱鉴定发现DDAH2为MAVS相互作用蛋白 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、DDAH2 负调控RLR信号通路介导的抗病毒免疫反应 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 DDAH2 特异性参与RLR信号通路的调节 |
| 2.2.2 在小鼠BMDMs中,DDAH2 的缺失增强了SeV病毒感染后RLR信号通路的激活 |
| 2.2.3 在小鼠MEFs中,DDAH2 的缺失增强了SeV病毒感染后RLR信号通路的激活 |
| 2.2.4 在人源细胞系中,DDAH2 表达的敲降增强了SeV病毒感染后RLR信号通路的激活 |
| 2.2.5 在鼠源和人源细胞中,敲除或敲低DDAH2的表达增强了细胞的抗病毒能力 |
| 2.2.6 DDAH2的缺失增强了小鼠的抗病毒能力 |
| 2.2.7 在鼠源和人源细胞中,回补或者过表达DDAH2 均抑制SeV病毒感染介导的RLR信号通路的激活 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、DDAH2 通过一氧化氮激活Drp1 介导的线粒体片段化,从而抑制RLR信号通路转导 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RLR信号通路激活后可以诱导DDAH2 由细胞质向线粒体迁移,并诱导线粒体的断裂 |
| 3.2.2 DDAH2 通过促进Drp1 介导的线粒体分裂来抑制RLR信号通路的传导 |
| 3.2.3 DDAH2 通过促进一氧化氮的生成来调控DRP1 的活化以及RLR信号通路的传导 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、TBK1磷酸化并抑制DDAH2活性 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 一氧化氮信号通路在免疫系统中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）耐药分枝杆菌SNP突变及对巨噬细胞极化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 分枝杆菌的分离培养、药敏试验及SNP耐药机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 M1/M2巨噬细胞及其分泌细胞因子在耐药结核病患者外周血中的表达研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SNP突变耐药分枝杆菌对巨噬细胞极化微环境的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 对抗分枝杆菌感染的免疫学研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）牛支原体强弱菌株感染对犊牛免疫反应及其外周血单个核细胞转录谱调节的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 牛支原体病原学 |
| 1.2 牛支原体病临床特征 |
| 1.2.1 牛支原体病流行病学 |
| 1.2.2 牛支原体病临床症状和病理变化 |
| 1.2.3 牛支原体病的诊断 |
| 1.3 牛支原体病的防控现状和面临的问题 |
| 1.3.1 牛支原体病的防控现状 |
| 1.3.2 牛支原体病的耐药性 |
| 1.3.3 牛支原体疫苗的研究进展 |
| 1.4 支原体的致病机制 |
| 1.4.1 粘附 |
| 1.4.2 侵袭 |
| 1.4.3 逃避宿主防御机制,胞内持续存在和扩散 |
| 1.4.4 次级代谢产物和生物被膜的形成 |
| 1.4.5 支原体表面脂蛋白及其在致病过程中的作用 |
| 1.5 宿主对支原体免疫应答的研究进展 |
| 1.5.1 天然免疫 |
| 1.5.2 体液免疫 |
| 1.5.3 细胞免疫 |
| 1.5.4 免疫抑制应答 |
| 1.6 牛支原体研究展望 |
| 1.7 本研究目的与意义 |
| 2 牛支原体强弱菌株对犊牛体液免疫和细胞免疫反应的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 主要试剂及试剂盒 |
| 2.2.2 主要溶液及配制方法 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 实验动物与分组 |
| 2.3.2 临床指标记录 |
| 2.3.3 实验菌株及其准备 |
| 2.3.4 动物接种 |
| 2.3.5 样品采集 |
| 2.3.6 牛支原体分离培养方法 |
| 2.3.7 大体病变评价和肺部病变评价 |
| 2.3.8 牛支原体强弱菌株对犊牛血清、唾液及鼻腔灌洗液各种抗体水平的影响 |
| 2.3.9 外周血单个核细胞的分离 |
| 2.3.10 刺激蛋白的制备与体外刺激实验 |
| 2.3.11 MTT法检测牛支原体强弱菌株对犊牛PBMC的细胞活力影响 |
| 2.3.12 Annexin-V/PI检测牛支原体强弱菌株对犊牛PBMC的凋亡反应 |
| 2.3.13 检测牛支原体强弱菌株对犊牛PBMC中T细胞分化的影响 |
| 2.3.14 检测牛支原体强弱菌株对全血培养上清中细胞因子的影响 |
| 2.3.15 病理组织学切片 |
| 2.3.16 组织免疫组化 |
| 2.3.17 数据处理与分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 犊牛临床症状分析 |
| 2.4.2 犊牛临床排菌分析 |
| 2.4.3 犊牛大体病变和肺部病变观察 |
| 2.4.4 病理学观察 |
| 2.4.5 犊牛器官带菌分析 |
| 2.4.6 犊牛体液免疫变化分析 |
| 2.4.7 犊牛外周血单个核细胞(PBMC)增殖分析 |
| 2.4.8 犊牛PBMC凋亡分析 |
| 2.4.9 犊牛PBMC中T淋巴细胞分化的分析 |
| 2.4.10 犊牛血液刺激上清细胞因子检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 牛支原体强弱菌株及不同接种途径对犊牛临床症状及排菌的影响 |
| 2.5.2 牛支原体强弱菌株及不同接种途径对犊牛体液免疫的影响 |
| 2.5.3 牛支原体强弱菌株及不同接种途径对犊牛PBMC增殖、凋亡及细胞分化的影响 |
| 2.5.4 牛支原体强弱菌株及不同接种途径对犊牛细胞因子的影响 |
| 3 牛支原体强弱菌株感染犊牛外周血单个核细胞转录组表达谱调节生物信息学与验证 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 资料来源 |
| 3.2.2 实验材料及试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 数据处理与软件应用 |
| 3.3.2 差异表达基因的互作分析 |
| 3.3.3 强弱菌株组功能性差异基因与犊牛平均日增重和解剖病变评价的相关性分析 |
| 3.3.4 总RNA提取 |
| 3.3.5 实时荧光定量PCR(q PCR)验证 |
| 3.3.6 Western blot检测肺组织中蛋白水平的表达 |
| 3.3.7 检测牛支原体强弱菌株对全血培养上清中IFN-γ的影响 |
| 3.3.8 检测牛支原体强弱菌株对全血培养上清中IL-17A的影响 |
| 3.3.9 数据处理与统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 牛支原体强弱菌株对犊牛临床症状和解剖大体评价的影响 |
| 3.4.2 牛支原体强弱菌株感染犊牛后PBMC中转录谱的整体分析 |
| 3.4.3 强毒株感染犊牛后PBMC中差异基因的Gene Ontology功能富集、KEGG和蛋白蛋白互作网络分析 |
| 3.4.4 致弱菌株感染犊牛后PBMC差异基因的Gene Ontology功能富集、KEGG pathway和蛋白蛋白互作网络分析 |
| 3.4.5 牛支原体强弱菌株感染犊牛后PBMC梯度递增表达基因的功能分析 |
| 3.4.6 牛支原体强弱菌株感染犊牛后PBMC差异基因的表达水平验证 |
| 3.4.7 牛支原体强弱菌株感染犊牛后PBMC重要差异基因与其临床症状、大体评分和肺部评分的相关性分析 |
| 3.4.8 牛支原体强弱菌株对犊牛肺组织中Th17细胞分化关键因子的影响 |
| 3.4.9 牛支原体强弱毒株对犊牛全血刺激上清中IL-17A和 IFN-γ水平的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 牛支原体强弱菌株对犊牛临床症状、病理解剖变化、体液免疫和细胞因子的影响 |
| 3.5.2 牛支原体强弱菌株接种犊牛后PBMC转录谱表达研究 |
| 3.5.3 牛支原体强毒株P1对宿主机体反应应答的影响和相关基因的讨论 |
| 3.5.4 牛支原体致弱菌株P150对宿主机体反应的影响和相关基因的讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 差异基因及GO功能富集信息 |
| 附录Ⅱ 在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（6）EBP50重组慢病毒对巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 重组慢病毒载体的构建和慢病毒的包装以及鉴定 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组慢病毒载体p Lenti-146-EBP50 的构建与鉴定 |
| 2.3.2 重组慢病毒载体p Lenti的构建与鉴定 |
| 2.3.3 重组慢病毒感染最佳时间的检测 |
| 2.3.4 重组慢病毒的滴度测定 |
| 2.3.5 RT-PCR检测RAW264.7 细胞中EBP50 的表达 |
| 2.3.6 Western blot检测RAW264.7 细胞中EBP50 的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 重组慢病毒对巨噬细胞杀伤MTB能力的影响和相关机制的探讨 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 EBP50 对巨噬细胞杀伤Mtb能力的影响 |
| 3.3.2 EBP50 对巨噬细胞i NOS表达及分布的影响 |
| 3.3.3 EBP50 对巨噬细胞内Mtb吞噬体成熟情况的影响 |
| 3.3.4 EBP50 对巨噬细胞自噬水平的影响 |
| 3.3.5 EBP50 对巨噬细胞凋亡水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 全文总结 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 研究结论 |
| 4.3 本课题创新之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 共刺激分子在结核病免疫中的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠免疫治疗效果评价（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、MTB 感染的流行及防治简况 |
| 二、MTB 的感染免疫学研究进展 |
| 三、TB 新型疫苗的候选抗原 |
| 四、TB 新型疫苗的研究进展 |
| 五、TB 的免疫治疗 |
| 第一部分 分泌表达 Ag85B-ESAT-6 融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建及免疫学特性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Ag85B-ESAT-6-rMS 对 MTB 耐 RFP 株感染小鼠的免疫治疗效果评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Ag85B-ESAT-6-rMS 对 MTB H37Rv 株低剂量感染小鼠的免疫治疗效果评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究成果 |
（8）免疫制剂在耐多药结核病治疗中作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| 实验Ⅰ中文摘要 |
| 实验Ⅱ中文摘要 |
| 实验Ⅰ英文摘要 |
| 实验Ⅱ英文摘要 |
| 前言 |
| Ⅰ免疫制剂在巨噬细胞吞噬耐多药结核分枝杆菌中作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| Ⅱ三种免疫制剂在耐多药结核病小鼠治疗中作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述：结核病的免疫治疗 |
| 第一部分 结核病免疫治疗的理论基础：自噬 |
| 第二部分 结核病免疫制剂的介绍 |
| 参考文献 |
| 发表的文章 |
| 致谢词 |
| 个人简历 |
（9）灭活草分支杆菌雾化吸入对支气管哮喘气道炎症和Vγ1+、Vγ4+γδT细胞亚群的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 雾化吸入灭活草分支杆菌减轻哮喘小鼠气道炎症及对细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 灭活草分支杆菌雾化吸入对支气管哮喘小鼠γ δ T细胞功能和V γ 1+、V γ 4+γ δ T细胞亚群的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 雾化吸入灭活草分支杆菌减轻哮喘小鼠气道炎症及对TOLL样受体2表达的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 雾化吸入草分枝杆菌对中度持续哮喘患者的治疗作用观察 |
| 引言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间学术论文发表情况 |
四、母牛分支杆菌菌苗对结核病小鼠Th1/Th2细胞动力学及诱导型一氧化氮合酶表达影响的研究（论文参考文献）
- [1]活动性结核病患者免疫功能状态评估和免疫治疗专家共识（2021年版）[J]. 吴雪琼,范琳. 中国防痨杂志, 2022(01)
- [2]2型糖尿病并发肺结核患者血糖管理及营养状况与转归预后的关联研究[D]. 牟宇泽. 青岛大学, 2020(01)
- [3]二甲基精氨酸二甲胺水解酶DDAH2抑制先天免疫抗病毒信号通路传导[D]. 黄珊. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]耐药分枝杆菌SNP突变及对巨噬细胞极化的影响[D]. 庞慧. 河北医科大学, 2020(01)
- [5]牛支原体强弱菌株感染对犊牛免疫反应及其外周血单个核细胞转录谱调节的研究[D]. 晁金. 华中农业大学, 2019
- [6]EBP50重组慢病毒对巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的影响及相关机制研究[D]. 呙阳. 南昌大学, 2015(01)
- [7]表达Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠免疫治疗效果评价[D]. 王平. 第四军医大学, 2014(01)
- [8]免疫制剂在耐多药结核病治疗中作用的研究[D]. 侯江厚. 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2012(12)
- [9]灭活草分支杆菌雾化吸入对支气管哮喘气道炎症和Vγ1+、Vγ4+γδT细胞亚群的影响[D]. 张景鸿. 广西医科大学, 2012(05)
- [10]结核病免疫治疗的进展及评价[J]. 赵金秋,郭述良. 中华结核和呼吸杂志, 2011(12)