一、首次克隆出丙肝病毒五区蛋白（论文文献综述）
冯小飞[1]（2020）在《医疗机构丙型肝炎诊疗现况研究》文中研究说明目的:了解医疗机构丙型肝炎（简称“丙肝”）诊断和治疗的现况,分析有关影响因素,为评估丙肝防治策略措施的落实情况提供参考信息。方法:本研究为横断面研究,采用抽样调查与典型调查相结合的方式,通过定量与定性相结合的方法,调查医疗机构丙肝相关诊断及治疗现况。抽样调查采用多阶段抽样的方法在全国抽取部分省份的部分县区,以当地居民就诊较多的二级及以上公立医院为调查对象。典型调查选取最近3年报告丙肝病例数及报告发病率均居全国前列的某一县（区）内的所有公立医院为调查对象。定量研究调查内容主要包括所调查医院的丙肝检测策略、丙肝抗体检测及核酸检测能力现况、近3年检测量以及丙肝治疗相关情况等,使用卡方检验比较计数资料。定性研究是对部分医疗机构的医务人员和丙肝患者进行一对一访谈,访谈内容主要包括丙肝相关检测和治疗情况及相关影响因素等,采用主体框架分析法进行分析。定性研究是对定量研究内容的扩展和补充。结果:1.抽样调查本次共调查14个省（自治区、直辖市）的61县区的83家医院,其中二级医院55家,三级医院28家。1.1医疗机构丙肝抗体检测现况83家医院全部开展HCV抗体检测项目。所有被调查的医院均要求手术前常规进行HCV抗体检测,对于肝功能异常的患者,只有60家（占72.29%）医院进行丙肝抗体检测。83家医院三年间总的抗体检测比例为48.32%。二级医院抗体检测比例高于三级医院（卡方检验,P均<0.01）,且二级、三级医院抗体检测比例均呈逐年增加趋势（卡方趋势检验,P均<0.01）。东部地区丙肝抗体检测比例高于中部和西部地区（卡方检验,P均<0.01）,且东、西地区抗体检测比例均呈逐年上升趋势,中部地区呈先下降后上升趋势（卡方趋势检验,P均<0.01）。1.2医疗机构丙肝核酸检测现况36家（占43.37%）医院开展HCV核酸检测项目,共覆盖31个县区（占所调查县区的50.82%）。二级医院开展核酸检测比例（40%）低于三级医院（50%）（χ2=13.92,P=0.001）。近3年36家开展HCV核酸检测的医院核酸检测比例为34.9%。二级医院核酸检测比例均低于三级医院（卡方检验,P均<0.01）,且二级、三级医院HCV核酸检测比例均呈逐年上升趋势（卡方趋势检验,P均<0.01）。西部地区核酸检测比例高于东、中部地区（卡方检验,P均<0.01）。1.3医疗机构丙肝治疗现况83家医院中,36家（占43.37%）报告可开展丙肝相关治疗服务。13家医院报告提供抗病毒治疗方案,23家医院仅采用保肝治疗方案。13家报告开展丙肝抗病毒治疗的医院3年间共治疗1308人,以这些治疗者均采用了抗病毒治疗方案来测算,占所调查83家医院同期核酸检测结果阳性人次数的 12.45%（1308/10503）。仅9家医院（占10.84%）可满足丙肝规范诊疗的基本要求;该9家医院3年间治疗人数占所调查83家医院同期核酸检测结果阳性人次数的12.45%（1308/10503）,二级医院规范治疗的人数占比（13.38%）高于三级医院（11.91%）（χ2=4.90,P=0.03）。2.典型调查选择近3年丙肝病例报告数及报告发病率均居全国前3位的某县（简称“A县”）开展调查。A县共有公立医疗机构21家,其中2家二级医院,19家乡镇卫生院。2.1医疗机构丙肝抗体检测现况21家医院中,20家开展HCV抗体检测项目,10家医院开展手术且均要求术前常规进行HCV抗体检测,16家有住院部的医院均将HCV抗体作为住院患者的常规检测项目。20家医院三年间总的抗体检测比例为68.57%。一级医院检测比例（85.33%）高于二级医院（65.79%）（卡方检验,P均<0.01）;且一级医院抗体检测比例均呈逐年增加趋势,二级医院抗体检测比例均呈逐年递减趋势（卡方趋势检验,P均<0.01）。2.2医疗机构丙肝核酸检测现况2家二级医院均具备丙肝核酸检测能力,核酸检测比例68.41%。2.3医疗机构丙肝治疗现况仅1家医院（占4.76%）满足丙肝规范诊疗的基本要求,该1家医院3年间共治疗1080人,仅占所调查2家医院同期核酸检测结果阳性人次数的12.07%（1080/8942）。3.定性访谈本次研究共完成个人深入访谈59人,其中医务人员34人,丙肝患者25人。采用主题框架分析法主要对影响检测和治疗的因素进行了分析,结果显示:3.1丙肝患者方面对丙肝相关知识的缺乏及其经济状况是影响患者进行丙肝抗体及核酸检测的主要因素;患者的经济状况、对治疗方法的认识、丙肝诊断治疗药物等知识缺乏是影响患者治疗的影响因素。3.2医疗机构方面不具备核酸检测能力、非专科医务人员对丙肝诊断标准理解错误,是影响患者接受丙肝核酸检测的影响因素;基层医疗机构中医疗相关专业的人才不足,各类设施、环节薄弱,以及医疗机构内部转诊机制不健全等,也是影响患者接受核酸检测的因素;部分医务人员不了解丙肝防治领域的最新进展,治疗观念落后,是影响丙肝患者接受治疗的影响因素。结论:1.全国二级及以上医疗机构普遍具备丙肝抗体检测能力,疫情严重地区的一级医院也绝大多数具备丙肝抗体检测能力。2.丙肝抗体检测已普遍纳入医疗机构术前筛查项目;医疗机构丙肝抗体检测量呈逐年上升趋势;但少数医疗机构尚未将丙肝抗体纳入住院患者及肝功能异常者常规检测项目,建议进一步扩大医疗机构就诊者的丙肝抗体筛查范围和力度。3.医疗机构丙肝核酸检测能力尚存在不足,对筛查出的HCV抗体阳性者的核酸检测比例较低,特别是二级及以下医院。4.检测能力、医患双方的认识、院内外转诊机制是否健全是影响核酸检测的重要因素,建议通过自身建设或与第三方检测机构合作的方式提高核酸检测能力,同时通过培训和宣传提高医患双方的核酸检测意识,通过建立院内外有效转诊机制提高核酸检测率。5.医疗机构提供丙肝规范抗病毒治疗不足,规范治疗比例低下。6.医务人员对丙肝规范治疗的认知、治疗药物的医保政策等是其重要影响因素,建议尽快各地促进丙肝药物医保政策落地,加强专业人员特别是基层医生的培训,并通过多种途径宣传加强公众对丙肝治疗的认识。
朱俊杰[2]（2017）在《克氏原螯虾CypA基因的结构及免疫功能分析》文中认为克氏原螯虾已成为我国重要的淡水养殖虾类之一,近10年来产量以年平均24.56%的速度快速增加。随着人工养殖克氏原螯虾面积的迅速扩大,病害的发生越来越频繁和严重。了解宿主与病原的相互关系,特别是深入了解宿主免疫相关基因对病原的反应机制,对于控制养殖甲壳类病害爆发具有重要意义。亲环蛋白（Cyclopllilins,简称Cyps）是一种广泛存在于从原核生物到高等哺乳动物中高度保守的重要蛋白,具有多种生物学功能。目前已知最重要的两个生物学功能:一是具有肽基脯氨酸顺反异构酶（cis-trans peptidyl-prolyl isomerse,PPIase）活性能催化蛋白质折叠和转运过程并起着分子伴侣作用;二是具有免疫抑制功能,在体内能介导T细胞进行免疫抑制。CypA是第一个被发现的Cyp家族蛋白。最新研究表明,CypA可能在某些水生生物中具有免疫应激功能。本研究拟以克氏原螯虾为研究对象,从肝胰腺cDNA文库里获得了克氏原螯虾CypA基因cDNA全长,应用生物信息学分析了该基因的结构特征和预测功能,以pET30a（+）为载体构建重组表达质粒,在大肠杆菌中进行原核表达并制备了特异性的多克隆抗体;应用荧光定量PCR和Western blot技术分析了该基因在克氏原螯虾各组织间的转录和表达分布特点;用WSSV病毒感染攻毒后,分析了克氏原螯虾各组织中CypA基因的免疫应答情况,为研究克氏原螯虾免疫相关基因在淡水甲壳类中的功能打下基础,为研究无脊椎动物的免疫机制提供一个新的方向。主要研究结果如下:1、PcCypA 序列（GenBank 登录号为 JX878886）全长为 884bp,包括 108bp的5’端非翻译区（5’ UTR）,281bp的3’端非翻译区（3’ UTR）。开放阅读框（ORF）长度为495bp,可编码164个氨基酸残基,理论分子量17.3kDa,具有肽基脯氨酰顺反异构酶家族标签序列（YKGSTFHRVIPNFMCQGG）。PcCypA蛋白整条肽链不存在明显的疏水区,无信号肽,也不存在跨膜区。该蛋白的二级结构组成中,无规卷曲所占比例较大,使蛋白质的构象呈现出多样性的特性。三级结构组成中,8股反向平行的β折叠和2个α螺旋形成一个圆筒状结构,推测形成活性中心区域,证明PcCypA是亲环素家族成员。然而,在结构上克氏原螯虾CypA的Gly70替代真骨鱼类和哺乳动物中的His70,该替换是否让克氏原螯虾失去了趋化作用,在生物进化上是否具有进化意义,有待于进一步研究。系统发育分析表明,PcCypA基因在生物进化过程中符合动物学分类,具有较高的保守性。2、将PcCypA基因克隆到含有组氨酸标签的原核表达载体pET-30a（+）中,得到重组质粒pET-30a（+）-PcCypA,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blot检测分析表达产物,结果显示His-PcCypA能够高效表达,以包涵体形式存在,约23kDa。在水生甲壳类中率先尝试并成功制备了 CypA兔源多克隆抗血清,Western blot验证发现抗体可以和原核表达的His-PcCypA融合蛋白杂交出目的条带（23kDa）,也可以与克氏原螯虾肝胰腺全蛋白杂交出目的条带（17kDa）,为后续蛋白表达和免疫组化等相关研究提供物质基础。3、应用荧光实时定量PCR分析PcCypA基因在克氏鳌虾不同组织中的转录情况。PcCypA在克氏原螯虾的肝胰腺、腮丝、精巢、卵巢、心脏和肌肉等6种组织器官中都有表达,在心脏中表达量最高,其次是肌肉、腮丝、卵巢和精巢,在肝胰腺中表达量最低。CypA蛋白在克氏原螯虾的肝胰腺、腮丝、精巢、心脏和肌肉中均有发现,大小约17kDa,与根据CypA氨基酸序列预测出的蛋白大小基本一致。然而在卵巢中未发现相应的蛋白条带,却出现了极其复杂的表达模式,有可能是与其他物质形成了蛋白质复合体。4、WSSV病毒对克氏原螯虾有很强的感染能力。病理组织学观察发现感染WSSV的克氏原螯虾心脏和肌肉组织中都出现了肌纤维断裂溶解的现象,在肝胰腺组织中出现了脂肪颗粒脱落、细胞空泡化和细胞膜溶解现象。WSSV感染后不同组织PcCypA基因对感染后的响应有时序差异。以24hpi为界,0-24hpi为注射应激期,在此期间,肝胰腺（0-12hpi）、心脏（12-24hpi）等组织的PcCypA转录表达均有上调。24-36hpi为应激恢复期,绝大多数的组织中PcCypA转录表达均出现了回落,但在心脏、肌肉、血淋巴组织中出现了上调,说明这三个组织对WSSV感染的响应早于其他组织。48hpi之后为WSSV感染响应阶段,在此期间鳃和肌肉组织有大量PcCypA转录表达,肝胰腺和精巢组织表达下调。96-120hpi为感染响应后期阶段,肝胰腺和肠组织的PcCypA转录水平再次上调。推断CypA在克氏原螯虾中可能参与机体的先天免疫系统,参与生物性免疫响应和物理性应激响应。5、根据RT-PCR扩增出来的PcCypA基因ORF序列在3个地理群体60个个体中发现了 2个变异位点,3’ UTR区域发现1个变异位点,共发现8个单倍型,单核苷酸多态性较高。因此推断,虽然PcCypA是一个高度保守的基因,在但ORF和3’ UTR区域都存在丰富的碱基变异,适合做SNP分析。
张玉娟[3]（2013）在《猪IFITM基因分析及过量表达细胞系构建》文中指出干扰素（Inferons，IFN）是调节细胞生长、分化、免疫反应、抗肿瘤及抗病毒等多种重要生理功能的细胞因子，通过IFN诱导干扰素刺激基因编码的蛋白家族（ISGs）组成的信号网络完成其信号传导过程。干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM（inferon-inducible transmemberaneproteins）是系列ISGs中的一个家族，干扰素诱导后可大量表达。近几年发现IFITM蛋白可抑制多种病毒的复制。IFITM在人、畜、禽、鼠等多种生物中都有表达，在进化上也非常保守，但不同物种中报道的IFITM基因种类和数量都有一定的差异。人类共有IFITM1、IFITM2、IFITM3和IFITM5基因的表达，其中IFITM1、IFITM2和IFITM3广泛表达于多种组织中，而IFITM5仅在成骨细胞中发现。而鼠中除了有IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5外，还有IFITM6和IFITM7的存在。最近有文献报道IFITM蛋白具有抗甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）等一些黄病毒属病毒及艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）等多种病毒的功能，引起了广泛关注。本论文主要以猪IFITM基因的序列、结构、表达及其对乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的影响进行了研究。本论文主要研究结果有：1、IFITM基因的克隆及其序列分析。通过序列对比已知的IFITM基因的CDS区保守序列，设计特异性的引物，从猪肾细胞PK15中扩增出猪IFITM基因，提交序列至NCBI。2、IFITM基因的进化分析。以猪组织的总DNA为模板，扩增出IFITM1、IFITM2、IFITM3等3个基因的全长序列，经过分析和序列对比，三个基因都含有一个内含子，并确定这三个基因均位于猪的2号染色体上。在猪基因组中尚未发现完整的IFITM5和IFITM10。通过绘制系统进化树发现猪IFITM与牛（Bos taurus）IFITM基因的同源性最高达到77%以上，牛和鼠的IFITM5同源率高达90%以上。3、IFITM基因的组织表达分析。采集了猪的不同组织提取RNA，分别扩增IFITM1、IFITM2、IFITM3的基因序列，发现IFITM1、IFITM2和IFITM3在各组织中的表达有较大差异。IFITM1和IFITM3在一些组织（如肝和肾）中表达量较大，而IFITM2仅在猪脾脏组织中检测出有表达。4、抗JEV功能的初步分析。将猪的IFITM1、IFITM2和IFITM3分别连接到真核表达载体pcDNA3.1（+）上，分别构建了三个重组质粒pcDNA3.1（+）-IFITM1、pcDNA3.1（+）-IFITM2和pcDNA3.1（+）-IFITM3，瞬时转染至PK15细胞，然后进行JEV感染实验，细胞病变分析及RT-PCR结果分析表明三组IFITM基因对JEV具有不同程度的抑制作用。5、稳定表达IFITM细胞系的构建。将构建好的三个重组质粒pcDNA3.1（+）-IFITM1、pcDNA3.1（+）-IFITM2和pcDNA3.1（+）-IFITM3，转染至PK15细胞，48小时后分析其表达情况，并用G418筛选10-15天，以建立IFITM1、IFITM2、IFITM3基因分别稳定表达的细胞系，以便于以后更深入的研究该基因的功能。
杨洋[4]（2009）在《上海市HIV-1主要流行株近全长序列分析与HIV/HCV合并感染者中HCV基因亚型的分布》文中提出人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）是导致人获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体。我国HIV/AIDS流行呈快速上升趋势。HIV分为HIV-1和HIV-2型,HIV-1的M群至少包含11个亚型,其中CRF01-AE重组型在全国所占比例也有所增加,在上海HIV-1 CRF01-AE重组型为主要的流行株。HIV感染和丙型肝炎病毒感染有着相似的传播途径如经血传播、性传播和母婴传播,因此HIV和HCV混合感染很常见。本研究中,我们应用巢式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,分段扩增HIV-1近全长基因组相应片段,进行克隆、测序,并进行遗传进化树和序列断点位置。我们还对186份HCV病毒载量大于1000拷贝/ml的来自于河南、云南、新疆维吾尔自治区、吉林和辽宁省HIV-1/HCV合并感染人群标本,用逆转录套式聚合酶链反应方法扩增病人血浆HCV核心基因区并进行基因亚型分型,同时检测病人的HIV-1和HCV载量以及CD4+T细胞计数。主要结果如下:1、完成了5株HIV-1CRF01-AE、1株URF01-AE/B近全基因组克隆,建立了HIV-1 CRF01-AE、URF01-AE/B近全基因组扩增平台。2、系统进化树分析表明,所有5条近全长基因序列与CRF-01AE参考株聚在一起.pol、gag、env三个结构基因区的组内基因离散率均低于泰国分离株;所有克隆序列未出现基因水平的重组,对蛋白酶和逆转录酶的药物依然敏感。3、一株为由CRF01AE和HIV-1B’亚型嵌合组成,两者各占约50%。其多聚酶蛋白基因（Pol）和外膜糖蛋白基因（Env）区均有HIV-1 B’亚型片段和CRF01AE片段嵌合组成。2种亚型病毒DNA片段嵌合点的位置与过去报道的重组病毒株（CRF15AE/B、CRF33AE/B和CRF34AE/B）均不同。4、HCV不同基因亚型比例分别为1a（1.2%）,1b（39.9%）,2a（17.9%）,3a（10.4%）,3b（15.6%）,6a（1.2%）,6n （6.4%）和6型未鉴定亚型（7.5%）。5、HCV1b（69例）和2a（31例）主要流行于河南省既往有偿献血浆人员中;3a（18例）和3b（26例）亚型主要流行于新疆和云南静脉注射吸毒人员（IDU）中;HCV6型（26例）主要流行于云南吸毒人员中;6、1b型（69例）的HCV RNA水平显着高于非1b亚型（104例）（ P<0.05）,但在HIV-1载量和CD4+T细胞数方面没有显着性差异（ P>0.05）。2a亚型（31例）的HIV-1 RNA和HCV RNA水平显着低于非2a亚型（142例） （ P<0.05）。7、HIV-1/HCV合并感染人群中HCV基因亚型的流行和分布与流行地区和感染途径有关。新的HCV6型亚型（13例）病毒株已经在合并感染的IDU人群中存在。HCV基因亚型与HIV感染的疾病进展之间无明显相关性研究。首次开展了上海市HIV-1CRF01-AE流行株、URF 01-AE/B的近全基因组克隆及及序列测定,为本型病毒的病原学、变异特征、疫苗、诊断方法和致病机理的研究提供了基础。在此基础上,进一步研究了我国部分地区HIV-1和HCV合并感染人群中HCV基因亚型的流行、分布及其与HIV-1感染疾病进展的关系。
杨振[5]（2009）在《中国献血员人群丙型肝炎病毒“窗口期”感染分析》文中进行了进一步梳理血液传播是丙型肝炎病毒（HCV）感染的一个重要途径之一。在我国所有临床使用的血液,全部需经过HCV抗体检测以确保血液安全。由于国际上HCV抗体酶联免疫诊断试剂已从第一代向第三代甚至第四代发展,同时也出现了新的HCV抗体诊断方法,如微粒子试剂和化学发光试剂,HCV抗体试剂的质量明显提高。这些试剂在中国的血液中心和医院也已开始使用,这样就提高了血液和血液制品的质量,同时也保障了临床治疗的安全。但是,由于理论上HCV感染存在一个“窗口期”,这一阶段尚无抗体的出现,利用抗体试剂无法检出HCV感染的存在。在实际中,国内外均有因存在“窗口期”问题而导致HCV输血感染的报道。因此,欧洲、美国等国家相继规定在血源筛查中使用HCV抗原和核酸（RNA）检测方法。但中国关于这方面的临床研究及流行病学调查相对薄弱,因此,无法制定关于血液HCV抗原和核酸检测的相关政策。本研究为解决中国因HCV“窗口期”造成的输血感染问题,分别利用了来自北京某血液中心的6190份献血员样品,四川成都某血液中心的766份献血员样品,广东深圳某血液中心的1693份献血员样品,566份河北廊坊某血液中心的HCV可疑感染样品,总共9215份血样,对中国HCV“窗口期”感染情况进行研究分析。HCV游离核心抗原检测发现：在8649份自然供血员血清中,确证检出一份游离核心抗原单独阳性血清,在566份高危人群HCV可疑感染者血清中,确证检出一份游离核心抗原和HCV抗体同时阳性血清,经抗体确证该份血清产生的抗体是核心区抗体（Core）。HCV RNA试剂检测这2份血清,全部阳性,病毒载量分别为42300（copies／ml）和653000（copies／ml）。同时,这两份血清送澳大利亚国家血液中心进行RNA复核,检测结果与我们一致。由于确证检出了游离核心抗原阳性的“窗口期”样品,尽管游离核心抗原的检出率较低,但对于中国庞大的献血员人群仍有其现实意义。核心总抗原检测发现,在收集的血清中,用核心总抗原试剂共筛出91份阳性血清,其中,自然献血员中7份,可疑感染者中84份,这84份可疑感染者血清中HCV抗体同时阳性76份,抗体阴性而总抗原阳性血清8份。应用HCV RNA试剂检测这8份血清,6份RNA为阳性。抗体筛查阴性而总抗原阳性的8份血清中仅确证检出一份单独游离核心抗原阳性样品,这是否与抗原抗体复合物的形成对抗体的检测造成了影响,产生了抗体检测的假阴性结果,尚有待进一步的研究。核心总抗原试剂共筛出的91份阳性血清中,有2份HCV RNA和抗体检测都呈阴性的样品。看来HCV感染存在一个核酸和抗体都阴性,核心总抗原阳性的阶段。这一现象值得重视。HCV RNA检测发现,18-60岁的正常献血员中,筛出7份RNA阳性而抗体阴性的血清,利用HCV核心总抗原试剂检测全部阳性,表明,我们筛查的献血员中“窗口期”样品比例达0.081%,高于西方的0.041%。在566份HCV可疑感染者血清中,也筛出6份HCVRNA阳性而抗体阴性的血清,利用HCV核心总抗原试剂检测,这6份也是阳性,可以认为这些血清也是“窗口期”样品。这13份血清送到澳大利亚国家血液中心进行RNA复核,检测结果与我们一致。在566份HCV可疑感染的献血员血清中,检测出84份核心总抗原阳性样品,阳性率14.84%。检出491份RNA阳性样品,阳性率86.75%。检出抗体阳性样品550份,阳性率97.17%。抗体检出率最高,但仍漏检6份核心抗原与核酸阳性血清。从理论上来说,核酸检测应该是最早期出现的,但伴随免疫压力,它又不是一直得以检出。在566份血清中就可以看出,它的检出率并不是最高的。综上所述,RNA试剂、抗原试剂以及抗体试剂在血清学检测时,所得结果并不完全平行,有一部分重叠检出,也有一部分交叉检出,由于检出了HCV游离核心抗原、核心总抗原以及RNA单独阳性或同时阳性但抗体阴性的“窗口期”样品,利用HCV抗体试剂对血液进行筛查的同时,使用抗原以及RNA试剂做必要的补充实验,可以减少因“窗口期”样品造成的漏检。因此推荐这些检测方法互相补充来解决“窗口期”问题可能是比较可行的。进行基因型别分析,健康献血员中筛出的7份HCVRNA阳性的样本,其中北京3份,基因型分别为2a、lb和3a型。成都1份,基因型为3b型,深圳3份,基因型分别为1a和两个lb型。在566份HCV可疑感染者血清中,对检出RNA阳性的491份血清进行型别分布分析,以1b、2a型为主,分别为41.5%和39.3%。对照已有报道的临床样本基因型别分布情况,献血员样本与临床样本HCV RNA型别分布是一致的。研究不同基因型别样品与病毒载量及转氨酶的相互关系,我们发现在HCV早期感染人群中,1b与2a基因型间病毒载量差异具有统计学意义。2a型人群HCV RNA载量明显高于1b型人群（P<0.01）,其他基因型别病毒载量均低于1b型。由于不同型别抗体检出率没有明显差异（P>0.05）,这说明2a型与其他基因型别不存在免疫压力的差别,表明2a型在自然复制过程中,与其他型别相比,存在复制优势。同时,不同基因型人群,丙氨酸转氨酶（ALT）水平的差异有统计学意义,2a型人群ALT明显高于1b型人群（P<0.01）。由此看来,这两个基因型别之间,HCV对肝的损伤程度可能有差别,2a型更易引起肝损伤,当然,这也需要得到临床进一步的研究来证实。其他基因型由于样本量太少,小样本与1b、2a基因型的大样本无法进行统计分析,也有待进一步研究。基于本研究,我们得出如下结论：（1）由于检出了HCV游离核心抗原、核心总抗原以及RNA单独阳性或同时阳性但抗体阴性的“窗口期”样品,表明,HCV感染“窗口期”的存在会严重威胁血液和血液制品的安全,因此,在HCV抗体筛查的基础上,对血液和血液制品的HCV RNA和核心抗原的进一步检测是必要的,能够减少“窗口期”样品的漏检：（2）在我国,HCV“窗口期”感染率为0.081%,高于西方国家的0.041%；（3）后“窗口期”感染的基因型主要为1b和2a,与我国已报道过的临床样本基因型别分布比例基本一致,有别于西方国家的基因型别分布。（4）2a基因型与其他型别相比,病毒载量有显着升高,它较其他基因型存在复制优势,这一发现,国内外尚没有相关报道。
金武丕[6]（2008）在《细胞凋亡相关基因及因素在大鼠酒精性肝病中的相关性研究》文中提出目的本研究通过酒精灌胃的方法建立酒精性肝病大鼠模型,探讨肝细胞凋亡相关基因及因素在酒精性肝病中的表达,为酒精性肝病发病机制的研究提供实验与理论依据。方法1.酒精性肝病动物模型的建立与分组:Wistar大鼠随机分为两组,模型组给予40%酒精8g/kg/d,分二次灌胃,共12周;对照组给予等量的生理盐水灌胃。实验第8、12周末处死动物,左心室采血离心保存待测血清指标。取肝组织一部分经10%中性福尔马林固定待做病理、凋亡及免疫组织化学检测;一部分肝组织经2.5%戊二醛固定待做电镜检查;另一部分肝组织-70℃液氮保存待做PCR法检测。2.应用光镜（HE染色）和电镜分别观察肝组织病理变化和肝细胞超微结构变化,用TUNEL法检测肝细胞凋亡,用全自动生化仪分别检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的含量,用免疫组化染色方法（采用SABC法）分别观察肝组织内的半胱天冬酶—3（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤—2基因（Bcl-2）和核转录因子KB（NF-kB）表达,用硫代巴比妥酸法（TBA法）和黄嘌呤氧化酶法分别测定血清丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活力,用放射免疫分析法和免疫组化染色法分别观察血清和肝组织的肿瘤坏死因子—α（TNF-α）的水平,用PCR法测定肝细胞色素P450 2E1的表达。结果1.模型组与对照组比较血清ALT（116.12±14.30 vs 43.56±7.89）IU/L值和AST（248.83±20.25 vs 84.67±12.67）IU/L值明显升高,ALT/AST比值＞2,有统计学意义（P＜0.05）。2.HE染色组织切片光镜下模型组与对照组比较,肝细胞明显肿胀,可见大小不等的脂肪空泡,部分处可见“嗜酸性小体”和点状、灶壮坏死,周围有炎性细胞浸润,肝组织内胶原纤维轻度增生;电镜下模型组与对照组比较肝细胞线粒体明显肿胀,嵴显示不清,部分呈空泡样变性,肝细胞内质网旺盛,可见肝细胞、肝窦内皮细胞凋亡。3.凋亡的肝细胞主要分布在肝组织中点状、灶状和碎屑样坏死区及其周围,模型组（6.2±1.7%）肝细胞凋亡指数明显高于对照组（1.7±0.8%）,且随造模时间延长模型组细胞凋亡指数明显增加,有显着性差异（P＜0.05）。4.Caspase-3、Bcl-2和NF-B阳性细胞主要分布在中央静脉及肝细胞坏死灶周围,模型组Caspase-3、Bcl-2、NF-kB基因表达强度明显高于对照组（P＜0.05）,且Bcl-2与NF-kB表达之间呈正相关(r=0.576,P＜0.01>。5.与对照组相比模型组血清MDA（15.72±2.06 vs 41.53±7.43）nmol/ml含量明显升高,而血清SOD（636.82±138.60 vs 353.12±61.02）u/ml活力明显下降,两组间均有统计学意义（P＜0.05）,且MDA与SOD呈负相关（r=-0.5818,P＜0.05）。6.肝细胞凋亡指数与血清MDA呈正相关,与血清SOD呈负相关(rMDA=0.6437,rSOD=-0.5115,P＜0.05)。7.与对照组相比模型组血清TNF-α（745.6±174.8 vs 1236.4±283.5）ng/L含量明显升高,两组间有统计学意义（P＜0.05）,且肝细胞凋亡指数呈正相关（r=0.8358,P＜0.05）。8.血清TNF-α与血清MDA呈正相关、与血清SOD呈负相关(rMDA=0.4654,rSOD=-0.38 17,P＜0.05)。9.模型组肝组织TNF-α表达强度明显高于对照组,且随造模时间延长表达强度增强,有显着性差异（P＜0.05）。10.肝组织TNF-α的表达与Caspase-3的表达呈正相关（r=0.648,P＜0.01）,与NF-kB的表达呈正相关(r=0.678,P＜0.01>。11.模型组肝组织CYP2E1的B基因（c1/c2）,C基因（c2/c2）表达强度明显高于对照组,其差异有统计学意义（P＜0.05）,且与对照组相比c1基因频率（53.4%）明显降低,c2基因频率（46.7%）明显升高,其差异有统计学意义（P＜0.05）。结论1.Caspase-3、Bcl-2、NF-kB参与酒精性肝病的肝细胞凋亡,其中NF-kB作为一种抑制凋亡的转录因子,通过对Bcl-2一类的下游抗凋亡基因表达的调节而发挥作用。2.TNF-α和脂质过氧化损伤在酒精性肝病的肝细胞凋亡过程中起一定作用,并且TNF-α通过其受体介导Caspase-3活化参与酒精性肝病的肝细胞凋亡。3.TNF-α活化NF-kB而共同参与酒精性肝病的肝细胞凋亡。4.CYP2E1基因PstI及RsaI RFLPs参与酒精性肝病的肝细胞凋亡,其中c2基因在肝细胞凋亡中可能起决定作用。
马鸣潇[7]（2007）在《FMDV分子背景分析、病毒拯救及多价基因工程疫苗研究》文中进行了进一步梳理为了对FMDV致病分子机制和新型疫苗的研究奠定基础,本研究成功克隆到了O/LZ株FMDV除poly（C）和poly（A）外的整个基因组,并对其分子背景进行分析;在此基础上完成了O/LZ株FMDV的拯救。为了研制适合于不同血清型、不同流行株FMDV的广谱、高效和廉价的新型疫苗,选择O型、A型FMDV VP1基因和AsiaI型FMDV的两个基因拓扑型的VP1基因上的主要抗原表位基因为主免疫原基因,以FMDV非结构蛋白及结构蛋白上的Th2细胞表位基因作为辅助基因,设计和构建FMDV复合多表位免疫原基因表达盒OAAT,通过计算机软件模拟分析,理论上符合预期要求。以OAAT为目的基因进行原核表达,目的蛋白以包涵体的形式获得高效表达。以OAAT为目的基因,并辅以SEA和IL-18作为基因佐剂,构建了FMDV三价DNA疫苗和鸡痘病毒重组载体活疫苗;小鼠免疫试验结果表明,OAAT具有良好的免疫原性,SEA和IL-18有可能在未来成为有效的基因佐剂,且采用prime-boost免疫策略,免疫效果更佳。
唐青海[8]（2007）在《日本脑炎病毒WHe株基因组特征及其疫苗的研究》文中提出日本脑炎（Japanese Encephalitis,JE）,又称流行性乙型脑炎,是由日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）引起的一种中枢神经系统人畜共患急性传染病。其致死率高达30%左右,50%的患者会留下永久性的后遗症,其中,中国的JE发病数占世界总发病数的80%以上。库蚊伊蚊是该病的主要传播媒介,而猪则是重要的传染源和放大器。猪患JE的主要表现为怀孕母猪流产、产死胎、弱仔、公猪睾丸炎及少数仔猪呈神经症状,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前,用于JE免疫预防的疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗两种,其安全性和较高的生产应用成本已成为人们日益关注的问题。近年来,病毒分子生物学和反向遗传学的发展为开发新型JE疫苗提供了新的技术手段。本研究为进一步探索JEV/WHe株基因组功能、致病机理及构建高效新型疫苗,开展了以下工作:1.JEV/WHe株全基因组特征分析本研究设计了11对特异性引物,采用RT-PCR技术扩增得到覆盖JEV/WHe株基因组全长cDNA的11个特异性片段,测序分析表明,JEV/WHe株基因组由一个开放阅读框（ORF,10296个核苷酸）和5’端非编码区（5’LITR,95个核苷酸）和3’端非编码区（3’UTR,585个核苷酸）组成。核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,WHe株与P3株亲缘关系最近,但3’UTR.形成的二级结构与Vellore P20778株3’UTR.形成的二级结构最相似;与黄病毒科其他属成员比较,3’UTR最末端约84个核苷酸所形成的二级结构相当保守。WHe株与P3株的膜蛋白（E）拥有M（76）、G（306）和L（408）三个特有氨基酸,而在其它19株JEV为T（76）、E（306）、S（408）,推测可能与病毒的宿主及组织嗜性有关。WHe株E蛋白中存在控制黄病毒毒力的RGD（387-389）基序,而一部分弱毒株也有该基序,提示JVE毒力型的决定簇具有毒株特异性。由全基因组序列构建的系统发育图与由E基因构建的系统发育图仅有一些细微的差别,表明E基因在研究各分离株之间进化关系中具有重要意义;从GenBank中调出不同时间和地区分离的140株JEV E基因,构建了系统发育图谱。2.JEV/WHe株全长cDNA的长链RT-PCR法扩增采用长链RT-PCR技术扩增基因组全长eDNA。对其进行PCR扩增鉴定,并对含复杂二级结构的3’末端和5’末端非编码区扩增片段进行了测序分析。扩增结果表明,扩增出的JEV WHe株基因组全长cDNA分子近11kb大小:非编码区测序分析表明,扩增产物为WHe株所特有。证明长链RT-PCR法可用于JEV W-He株基因组全长cDNA的扩增。3.JEV/WHe株DNA疫苗载体构建采用RT-PCR.技术扩增prM/E和NSl全基因并进行序列分析,将其分别克隆于真核表达载体pAVXI.,构建的表达载体pAVXlprM/E和pAVXl-NSl,酶切鉴定和序列分析表明,JEV/WHe株DNA疫苗载体构建成功。4.WIte株NSl基因在大肠杆菌中的表达.将NSl基因克隆到pET28b（+）表达载体,构建了pET28b（+）.NSl重组表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,并对其进行了诱导表达,对表达产物进行检测。结果表明,表达产物相对分子质量约为43ku。为JE亚单位疫苗和DNA疫苗的开发奠定了基础。
许信刚[9]（2005）在《逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究》文中认为丙型肝炎病毒（HCV）是输血后非甲非乙型肝炎以及社区获得性肝炎的主要病原因子,目前全世界约有2 亿HCV感染者。HCV感染后缺乏有效的保护性免疫。目前对HCV感染尚未找到有效的治疗手段,因此需要提高治疗手段和发展有效的疫苗以控制HCV感染。HCV 为单股正链RNA 病毒,属于黄病毒科的成员。其基因组全长9.4kb,编码约3 000 氨基酸的多聚蛋白前体,在宿主及病毒蛋白酶的作用下,将其切割成3 个结构蛋白和7 个非结构蛋白,其中有2 个糖蛋白E1 和E2 为HCV的包膜蛋白。由于其位于病毒颗粒的最外侧,是宿主免疫系统攻击的主要目标,也是HCV 疫苗研究的首选抗原。近年来各国学者运用基因重组技术对HCV包膜糖蛋白的结构和功能进行了深入研究,以期进一步理解HCV感染后慢性化机制及病毒与宿主相互作用的关系,并寻找有效的保护性疫苗及治疗药物。Chiron公司的研究人员在1994 年首先报道了用哺乳动物细胞表达的E1 和E2 蛋白共免疫大猩猩,可诱生出中和抗体能抵抗同源病毒攻击的。他们认为在大猩猩免疫试验中,E2 区尤其是E2 的高变区之一HVR1（386～411 位氨基酸）对于诱导中和抗体的保护性免疫具有更为重要的作用。但是由于E2 区的高度变异性,针对某种型或株的抗体往往对其他型或株的HCV 无中和作用。而且有的学者认为抗E2 抗体对病毒感染的预防作用仍难以肯定。由于尚未建立HCV 体外复制系统,病人血清中的HCV 病毒粒子又极难纯化,迄今为止的HCV被膜蛋白研究几乎完全以各种系统中表达的重组蛋白为对象。有证据表明,只有哺乳动物细胞中表达的E1、E2 糖蛋白才能较好地反映天然HCV病毒粒子上被膜蛋白的构象和性质。但就目前而言,E1 及E2 糖蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,以及表达蛋白的纯化,仍然是世界范围内都未攻克的难题,严重影响了被膜蛋白相关研究及其临床应用的进展,说明HCV 中和抗体的研究还面临许多困难。本研究由三部分构成,第一部分是用逆转录病毒载体将HCV囊膜蛋白基因整合到SP2/0 细胞基因组中,在SP2/0 细胞的细胞膜上成功表达了HCV 囊膜蛋
吕欣[10]（2005）在《嵌合型重组HCV cDNA的构建及体外转录RNA的感染特性研究》文中进行了进一步梳理丙型肝炎病毒（HCV）是有囊膜的单股正链RNA病毒,属黄病毒科肝炎病毒属。基因组全长约9.6kb,仅含有一个开放读码框（ORF）,ORF两侧具有与复制和翻译相关的非编码区（UTR）。HCV是丙型肝炎的病原体,急性感染后约75%发展为慢性肝炎,其中约20%结局为肝硬化或肝功能衰竭,并有可能进一步发展为肝细胞肝癌。目前全世界有1.7亿HCV感染者,HCV感染已经成为全球性的严重社会公共卫生问题之一。 迄今尚无特异有效的防治HCV感染的方法,疫苗研究也未取得明显进展。其原因除了HCV本身型别多样,且高度变异以外,缺乏稳定可靠的细胞培养系统和小动物实验模型,也极大地制约着HCV及其致病机理和防治研究的深入开展。利用传统方法建立HCV细胞培养模型一直未获得突破性进展,而体外转录制备感染性RNA（感染性转录体）技术的建
二、首次克隆出丙肝病毒五区蛋白（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、首次克隆出丙肝病毒五区蛋白（论文提纲范文）
（1）医疗机构丙型肝炎诊疗现况研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 研究目的 |
| 研究内容与方法 |
| 1 研究对象及样本量 |
| 1.1 定量研究 |
| 1.2 定性研究 |
| 2 研究内容与方法 |
| 2.1 定量研究 |
| 2.2 定性研究 |
| 3 现场实施 |
| 3.1 预调查 |
| 3.2 调查员的培训 |
| 3.3 正式调查 |
| 4 数据处理和结果分析 |
| 4.1 定量研究 |
| 4.2 定性研究 |
| 5 质量控制 |
| 5.1 设计阶段 |
| 5.2 实施阶段 |
| 5.3 资料处理与分析 |
| 6 偏倚及控制 |
| 6.1 信息偏倚 |
| 6.2 选择偏倚 |
| 7 伦理学审核 |
| 8 技术路线图 |
| 研究结果 |
| 1 抽样调查结果 |
| 1.1 调查现场的丙肝疫情状况 |
| 1.2 所调查医院基本情况 |
| 1.3 丙肝抗体检测现况 |
| 1.4 丙肝核酸检测现况 |
| 1.5 丙肝治疗现况 |
| 1.6 规范诊断治疗现况 |
| 2 典型调查结果 |
| 2.1 调查地区丙肝疫情及基本情况 |
| 2.2 医疗机构基本情况 |
| 2.3 丙肝抗体检测现况 |
| 2.4 丙肝核酸检测现况 |
| 2.5 丙肝治疗现况 |
| 2.6 规范诊断治疗现况 |
| 3 定性访谈结果 |
| 3.1 丙肝抗体检测策略 |
| 3.2 丙肝核酸检测情况 |
| 3.3 丙肝治疗情况 |
| 3.4 影响丙肝诊断、治疗的因素 |
| 讨论 |
| 1 医疗机构丙肝抗体检测情况 |
| 2 医疗机构丙肝筛查策略及影响因素 |
| 3 医疗机构丙肝核酸检测现况及影响因素 |
| 4 医疗机构丙肝治疗现况及影响因素 |
| 5 丙肝诊断治疗中机构间合作情况 |
| 6 本研究的不足 |
| 结论与建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 丙型肝炎诊断治疗方法概述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）克氏原螯虾CypA基因的结构及免疫功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 亲环素基因 |
| 1.1 亲环素 |
| 1.2 亲环素A |
| 1.3 亲环素A的结构特征 |
| 1.4 亲环素A的分布 |
| 1.4.1 亲环素A在物种间的分布 |
| 1.4.2 亲环素A在组织间的分布 |
| 1.4.3 在细胞水平上的分布 |
| 1.5 亲环素A的生物学功能 |
| 1.5.1 肽脯氨酰顺反异构酶活性的生物学功能 |
| 1.5.2 介导CsA的免疫抑制 |
| 1.5.3 参与细胞周期的调节 |
| 1.5.5 促进肿瘤细胞的增殖 |
| 1.5.6 参与炎症反应 |
| 1.5.7 参与病毒感染 |
| 1.5.8 植物亲环素的功能 |
| 1.6 CypA在细胞内的生化反应机制 |
| 1.6.1 分子伴侣 |
| 1.6.2 信号分子 |
| 1.6.3 分泌型CypA与其受体CD147相互作用 |
| 1.6.4 CypA与FHIT基因的相互作用 |
| 1.6.5 CypA与AIF的互作 |
| 1.6.6 CypA与PRLr的相互作用 |
| 1.6.7 CypA与多种耐药性基因的互作 |
| 1.7 水产动物CypA基因的研究现状 |
| 1.8 小结 |
| 2 水产动物新基因生物学功能的主要技术方法及其原理和技术特点 |
| 2.1 新基因cDNA全长的克隆策略 |
| 2.2 生物信息学分析 |
| 2.2.1 新基因编码区的特性分析 |
| 2.2.2 序列比对 |
| 2.2.3 编码产物预测分析 |
| 2.3 系统发育分析 |
| 2.4 新基因的表达谱分析 |
| 2.4.1 mRNA水平的表达谱分析 |
| 2.4.2 蛋白质水平的表达谱分析 |
| 2.5 基因功能的研究方法 |
| 2.5.1 基因转导 |
| 2.5.2 动物转基因技术 |
| 2.5.3 RNA干扰 |
| 2.5.4 基因敲除 |
| 2.6 基因编码蛋白质互作的研究 |
| 2.7 小结 |
| 3 克氏原螯虾相关背景研究 |
| 3.1 分类地位 |
| 3.2 地理分布 |
| 3.3 形态特征 |
| 3.4 营养价值 |
| 3.5 生态习性 |
| 3.6 生活史与繁殖习性 |
| 3.7 遗传多样性 |
| 3.8 功能基因研究 |
| 3.9 小结 |
| 4 本研究目的与意义 |
| 5 主要内容 |
| 6 技术路线 |
| 第二章 克氏原螯虾亲环素基因的克隆和结构特征分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 克氏原螯虾 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验所用引物的设计与合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 克氏原螯虾CypA基因中间片段的获得 |
| 2.2.2 克氏原螯虾CypA基因全长的RACE-PCR扩增 |
| 2.2.3 序列分析和系统进化分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 总RNA的浓度和纯度 |
| 3.2 克氏原螯虾CypA全长cDNA序列及推导的氨基酸序列 |
| 3.3 不同物种的CypA的氨基酸序列的同源性对比及系统进化分析 |
| 3.4 CypA基因的疏水性 |
| 3.5 CypA基因的信号肽 |
| 3.7 CypA基因蛋白的功能 |
| 3.8 CypA蛋白的二级结构 |
| 3.9 CypA基因的亚细胞定位 |
| 3.10 CypA基因的功能位点 |
| 3.11 CypA蛋白的三级结构预测分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 克氏原螯虾CypA的结构特征 |
| 4.2 克氏原螯虾CypA基因的生物信息学分析 |
| 4.3 CypA基因的结构与功能的关系 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 克氏原螯虾群体形态差异与亲环素基因的遗传多样性分析 |
| 第一节 克氏原螯虾5种群形态学差异及判别 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 数据测量 |
| 2.3 参数选择 |
| 2.4 分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 聚类分析 |
| 3.2 判别分析 |
| 3.2.1 雄性克氏原螯虾形态判别分析 |
| 3.2.2 雌性克氏原螯虾形态判别分析 |
| 3.3 主成分分析 |
| 3.3.1 雄性克氏原螯虾主成分分析 |
| 3.3.2 雌性克氏原螯虾主成分分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 形态差异与种群间亲缘关系 |
| 4.2 三种多元分析方法的使用评价 |
| 第二节 3个克氏原螯虾地理群体CypA基因的序列差异分析和SNP位点筛查 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 引物设计及PCR扩增 |
| 2.2.3 RNA的提取、RT-PCR及PcCypA基因扩增 |
| 2.2.4 序列分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 CypA基因的基因组PCR扩增结果 |
| 3.2 CypA基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.3 基因片段的序列分析 |
| 3.3.1 序列变异 |
| 3.3.2 碱基组成和遗传距离 |
| 3.3.3 不同群体遗传多样性及遗传分化分析 |
| 3.3.4 系统发育 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PcCypA基因序列的SNP位点分析 |
| 4.2 克氏原螯虾的种群遗传多样性 |
| 本章小结 |
| 第四章 克氏原螯虾亲环素A基因的原核表达和多克隆抗体制备 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 克氏原螯虾 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验药品及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 寡核昔酸引物设计与合成 |
| 2.2.2 表达前的序列分析 |
| 2.2.3 RNA的提取、RT-PCR及PcCypA蛋白基因扩增 |
| 2.2.4 原核表达载体构建 |
| 2.2.5 pET30a(+)-PcCypA重组蛋白的原核表达与鉴定 |
| 2.2.6 重组pET30a(+)-PcCypA蛋白表达条件优化 |
| 2.2.7 pET30a(+)-PcCypA重组蛋白的纯化和Western blot检测 |
| 2.2.8 多克隆抗体的制备与Western blot检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 融合蛋白结构及表达特性预测 |
| 3.2 PcCypA目的片段和pMD18-T载体的连接 |
| 3.3 pET30a(+)-PcCypA重组载体构建 |
| 3.4 融合蛋白表达效率及存在形式 |
| 4 讨论 |
| 4.2 IPTG诱导浓度、时间对pET30a(+)-PcCypA原核融合表达量的影响 |
| 4.3 CypA蛋白特性分析 |
| 4.3.1 CypA重组蛋白的存在形式 |
| 4.3.2 PcCypA蛋白和PcCypA融合蛋白的分子量 |
| 4.4 克氏原螯虾CypA多克隆抗体制备 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 CypA基因在克氏原螯虾组织中的转录与表达模式研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 克氏原螯虾 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 克氏原螯虾CypA基因的组织表达模式研究 |
| 2.2.2 克氏原螯虾不同组织CypA蛋白表达分析 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PcCypA荧光定量检测与分析 |
| 3.2 克氏原螯虾不同组织CypA蛋白表达分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 克氏原螯虾不同组织中CypA的转录表达分析 |
| 4.2 CypA基因在克氏原螯虾不同组织中蛋白表达分析 |
| 5 本章小结 |
| 第六章 WSSV感染下克氏原螯虾CypA基因的表达响应研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 克氏原螯虾 |
| 2.2 人工感染实验 |
| 2.3 组织病理学观察 |
| 2.4 qRT-PCR检测CypA基因的转录表达 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 WSSV对克氏原螯虾的感染能力 |
| 3.2 WSSV感染克氏原螯虾的组织学研究 |
| 3.3 WSSV感染后克氏原螯虾不同组织的CypA转录的时序表达模式 |
| 3.4 WSSV感染后克氏原螯虾CypA基因在不同时间转录的组织空间表达模式 |
| 4 讨论 |
| 4.1 WSSV对克氏原螯虾的感染效果 |
| 4.2 WSSV感染下克氏原螯虾CypA的转录表达特性 |
| 4.3 水生生物CypA基因的功能 |
| 5 本章小结 |
| 第七章 研究小结、创新点与展望 |
| 一、研究小结 |
| 二、创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）猪IFITM基因分析及过量表达细胞系构建（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 IFITM 的研究进展 |
| 1.1.1 IFITM 基因家族的简介 |
| 1.1.2 IFITM 的生物活性 |
| 1.1.2.1 IFITM 调控细胞的生长和分化 |
| 1.1.2.2 IFITM 蛋白的抗病毒活性 |
| 1.1.2.3 IFITM 抗肿瘤细胞的增殖 |
| 1.2 乙型脑炎及乙型脑炎病毒简介 |
| 1.2.1 乙型脑炎的简介 |
| 1.2.2 乙型脑炎病毒 |
| 1.2.2.1 JEV 的结构和基因组 |
| 1.2.2.2 JEV 的 E 蛋白简介 |
| 1.2.2.3 JEV 的毒力及致病机理 |
| 1.2.2.4 JEV 细胞模型的选用 |
| 1.3 本课题研究目的和意义 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂与耗材 |
| 3.1.3.1 试剂 |
| 3.1.3.2 耗材器具 |
| 3.2 试剂与耗材的准备 |
| 3.2.1 试剂与耗材准备 |
| 3.2.1.1 预备耗材处理方法 |
| 3.2.1.2 主要试剂配制方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 基因克隆 |
| 3.3.2.1 细胞总 RNA 提取及纯化 |
| 3.3.2.2 RNA 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 3.3.2.3 目的基因的克隆 |
| 3.3.2.4 目的DNA 片段琼脂糖胶回收 |
| 3.3.2.5 感受态的制备 |
| 3.3.2.6 目的基因与 T 载体的连接 |
| 3.3.2.7 T-IFITM 重组质粒转化 |
| 3.3.2.8 克隆筛选与鉴定 |
| 3.3.3 猪 IFITM 全长基因的克隆和染色体定位 |
| 3.3.3.1 组织中总 DNA 的提取 |
| 3.3.3.2 猪 IFITM 全长基因的克隆 |
| 3.3.3.3 NCBI BLAST 基因组 |
| 3.3.4 猪 IFITM 基因生物信息学分析 |
| 3.3.4.1 数据收集 |
| 3.3.4.2 多序列对比 |
| 3.3.4.3 进化树构建 |
| 3.3.5 组织表达差异分析 |
| 3.3.5.1 各组织总 RNA 提取及纯化 |
| 3.3.5.2 RNA 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 3.3.5.3 基因克隆 |
| 3.3.6 IFITM 原核表达载体的构建 |
| 3.3.6.1 质粒的提取 |
| 3.3.6.2 表达质粒酶切反应与DNA 片段的回收 |
| 3.3.6.3 目的基因与原核表达载体的连接及转化 |
| 3.3.6.4 重组子筛选及酶切鉴定 |
| 3.3.6.5 重组子转化表达菌株 |
| 3.3.6.6 蛋白的诱导表达 |
| 3.3.6.7 表达产物SDS-PAGE 分析 |
| 3.3.7 IFITM 真核表达载体的构建 |
| 3.3.8 检测过量 IFITM 蛋白对乙脑病毒感染细胞的影响 |
| 3.3.8.1 瞬时转染和病毒感染 |
| 3.3.8.2 细胞形态学观察 |
| 3.3.8.3 Western Blot 检测 |
| 3.3.9 pcDNA3.1(+)-IFITM 稳定表达细胞系筛选 |
| 3.3.9.1 稳定转染 |
| 3.3.9.2 RNA 的提取 |
| 3.3.9.3 RT-PCR 检测 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 细胞培养 |
| 4.2 猪 IFITM 基因克隆 |
| 4.2.1 细胞总 RNA 提取及纯化 |
| 4.2.2 猪 IFITM 基因克隆的结果 |
| 4.2.3 猪 IFITM 基因序列提交 |
| 4.3 猪 IFITM 全长基因的克隆和染色体定位 |
| 4.3.1 猪肝组织总 DNA 提取及 IFITM 全长基因克隆 |
| 4.3.2 猪 IFITM 基因结构与染色体的定位 |
| 4.4 猪 IFITM 基因生物信息学分析 |
| 4.4.1 跨膜域分析 |
| 4.4.2 多序列对比 |
| 4.4.3 系统进化树 |
| 4.5 猪 IFITM 基因在不同组织表达差异性 |
| 4.5.1 组织总 RNA 提取及纯化 |
| 4.5.2 组织表达差异 |
| 4.6 IFITM 原核表达载体的构建结果 |
| 4.7 IFITM 真核表达载体的构建结果 |
| 4.8 猪 IFITM 蛋白对乙脑病毒感染细胞的表观影响 |
| 4.8.1 细胞形态学分析 |
| 4.8.2 Western Blot 检测结果 |
| 4.9 pcDNA3.1(+)-IFITM 稳定表达细胞系的验证 |
| 4.9.1 G418 筛选稳定表达细胞系 |
| 4.9.2 RNA 的提取及纯化 |
| 4.9.3 猪 IFITM 基因的 RT-PCR 结果 |
| 5.结论与讨论 |
| 5.1 猪 IFITM 基因的研究 |
| 5.1.1 猪 IFITM 基因克隆和定位 |
| 5.1.2 生物信息学分析 |
| 5.1.3 组织表达差异分析 |
| 5.2 猪 IFITM 蛋白功能的研究 |
| 5.2.1 重组蛋白原核表达的分析 |
| 5.2.2 病毒感染分析与稳定表达细胞系建立 |
| 参考文献 |
| Abstract |
（4）上海市HIV-1主要流行株近全长序列分析与HIV/HCV合并感染者中HCV基因亚型的分布（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 上海市HIV-1主要流行株近全长序列分析 |
| 前言 |
| (一) 实验材料和方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 与HIV/HCV合并感染者中HCV基因亚型的分布 |
| 前言 |
| (一) 实验材料和方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）中国献血员人群丙型肝炎病毒“窗口期”感染分析（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 中国自然献血员人群丙型肝炎病毒"窗口期"感染检测数据分析 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 试剂 |
| 2. 样品 |
| 3. 主要仪器设备 |
| 4. 检测与分析 |
| 5. 实验工作流程图 |
| 实验结果 |
| 1. HCV抗体检测 |
| 2. HCV游离核心抗原检测 |
| 3. HCV核心总抗原检测 |
| 4. HCVRNA检测及基因型别分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 中国献血员中高危人群丙型肝炎病毒"窗口期"感染流行病学调查与分析 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 试剂 |
| 2. 样品 |
| 3. 仪器设备 |
| 实验结果 |
| 1. 对收集的廊坊地区献血员进行人群分布情况的流行病学调查 |
| 2. 所收集样本HCV抗体检测 |
| 3. HCV游离核心抗原检测 |
| 4. 所收集样本总抗原检测 |
| 5. HCV RNA检测 |
| 6. HCV RNA阳性血清基因型别检测 |
| 7. 不同HCV基因型别样品的病毒载量和ALT检测以及基因型别与它们的关系研究 |
| 8. 不同HCV基因型别样品对应HCV基因不同区域抗体的检测 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附件:原始数据 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 第一部分:HCV基因结构与功能分析 |
| 第二部分:HCV疫苗的研制 |
| 第三部分:细胞免疫在HCV预防和治疗中的作用 |
| 第四部分:HCV体液免疫疫苗的研制 |
| 简历 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（6）细胞凋亡相关基因及因素在大鼠酒精性肝病中的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 统计方法 |
| 2.5 实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 附图 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 附录A 攻读学位期间发表的相关论文目录 |
| 附录B 攻读学位期间的科研课题目录 |
| 附录C 个人简介 |
（7）FMDV分子背景分析、病毒拯救及多价基因工程疫苗研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 动物RNA 病毒反向遗传学操作技术研究进展 |
| 1 正链RNA 病毒反向遗传学操作系统的建立 |
| 2 负链RNA 病毒反向遗传学操作系统的建立 |
| 3 反向遗传学操作技术的应用 |
| 4 动物RNA 病毒反向遗传学操作技术的不足与发展前景 |
| 第二章 口蹄疫病毒抗原性及其致病性的分子基础 |
| 1 FMDV 抗原性 |
| 2 FMDV 致病分子基础 |
| 3 其它毒力因子 |
| 4 结语 |
| 第三章 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 1 灭活疫苗的研究 |
| 2 新型疫苗研究 |
| 3 新型疫苗的免疫佐剂研究 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 口蹄疫病毒O/LZ 株的分子特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 O型口蹄疫病毒O/LZ株基因组全长CDNA的构建及其病毒拯救 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 O 型、A 型和ASIA1 型FMDV 复合多表位免疫原基因表达盒分子设计、构建及其原核表达与纯化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 O 型、A 型、ASIA1 型FMD 三价DNA 疫苗的构建及小鼠免疫实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗的构建及小鼠免疫实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 FMD 不同类型疫苗联合免疫策略及实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（8）日本脑炎病毒WHe株基因组特征及其疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 日本脑炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.1 JEV 的分类及分型 |
| 1.2 JEV 分子生物学 |
| 1.2.1 JEV 的基因组特征 |
| 1.2.2 JEV 的结构蛋白 |
| 1.2.3 JEV 的非结构蛋白 |
| 1.2.4 JEV 基因组RNA5'末端和3'末端非翻译区的结构和功能 |
| 第二章 长链RT-PCR 技术研究概况 |
| 2.1 逆转录（Reverse Transcription） |
| 2.1.1 RNA 质量和数量 |
| 2.1.2 逆转录酶 |
| 2.1.3 反转录产物处理 |
| 2.2 长链PCR 原理 |
| 2.2.1 长链PCR 反应条件的优化 |
| 2.2.2 DNA 聚合酶 |
| 2.2.3 引物 |
| 2.2.4 缓冲液 |
| 2.2.5 Mg2+ |
| 2.2.6 循环条件 |
| 2.2.7 添加剂 |
| 2.2.8 其它因素 |
| 2.4 长链RT-PCR 技术应用 |
| 2.4.1 感染性克隆的构建 |
| 2.4.2 微生物基因组研究 |
| 2.4.3 基因检测 |
| 2.5 展望 |
| 第三章 JEV/WHe 株全基因组序列特征分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要质粒、菌株和毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病毒增殖 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 RNA 提取 |
| 3.2.4 RT-PCR 反应 |
| 3.2.5 目的片段的回收 |
| 3.2.6 感受态细胞与LB 培养基制作 |
| 3.2.7 目的片段的克隆、转化及重组质粒的筛选与鉴定 |
| 3.2.8 测序结果分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RT-PCR 反应 |
| 3.3.2 WHe 株基因组全长cDNA 的克隆及核苷酸与氨基酸序列分析 |
| 3.3.3 WHe 株进化分析 |
| 3.3.4 WHe 株UTR 二级结构的预测与分析 |
| 3.3.5 E 基因及其氨基酸序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 JEV/WHe 株全长cDNA 的长链RT-PCR 法扩增 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株、质粒、菌种、试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 JEV WHe 株RNA 的提取 |
| 4.2.3 JEV WHe 株RNA 的RT-PCR 反应 |
| 4.2.4 JEV WHe 株cDNA 的PCR 鉴定 |
| 4.2.5 JEV WHe 株cDNA 测序结果分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 长链PCR 最佳反应体系和扩增参数的建立 |
| 4.3.2 JEV WHe 株全基因组cDNA 的扩增 |
| 4.3.3 JEV 基因组全长cDNA 的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 JEV/WHe 株prME 和N51 基因的克隆及其DNA 疫苗载体的构建 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要质粒与菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 PCR 反应 |
| 5.2.3 目的片段的回收 |
| 5.2.4 感受态细胞与LB 培养基制作 |
| 5.2.5 扩增片段的克隆与转化 |
| 5.2.6 重组质粒筛选与鉴定 |
| 5.2.7 重组质粒的序列测定与分析 |
| 5.2.8 测序结果分析 |
| 5.2.9 DNA 疫苗载体pVAX1-prME 和pVAX1-N51 的构建 |
| 5.2.10 prME 和 N51 基因的回收与纯化 |
| 5.2.11 pVAX1 质粒的大量制备 |
| 5.2.12 目的基因的克隆与转化 |
| 5.2.13 pVAX1-prME 和pVAX1-N51 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 5.2.14 重组质粒的序列测定与分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 prME 和NS1 基因的PCR 扩增 |
| 5.3.2 prME 和NS1 基因的克隆与鉴定 |
| 5.3.3 重组DNA 疫苗载体pVAX1-prME 和pVAX1-NS1 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 5.3.4 重组DNA 疫苗载体pVAX1-prME 和pVAX1-NS1 序列测定与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 JEV /WHe 株N51 基因在大肠杆菌中的高效表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 NS1 基因的克隆与回收 |
| 6.2.2 原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 6.2.3 细菌的培养与诱导表达 |
| 6.2.4 表达产物的SDS-PAGE 检测 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 重组表达质粒的构建及鉴定 |
| 6.3.2 诱导表达产物的SDS- PAGE 电泳检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ（缩略词） |
| 附录Ⅱ（本文所引用的JEV 分离毒株） |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 丙型肝炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 丙型肝炎的流行现状、致病性与危害 |
| 1.3 病毒的颗粒特征 |
| 1.4 丙型肝炎病毒各区段基因组的结构和功能 |
| 1.4.1 5’非编码区(5’UTR) |
| 1.4.2 核心蛋白区 |
| 1.4.3 包膜蛋白区 |
| 1.4.4 p7 蛋白 |
| 1.4.5 非结构蛋白 |
| 1.4.6 3'非编码区(3'UTR) |
| 1.5 丙型肝炎病毒囊膜蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 包膜蛋白的结构 |
| 1.5.2 E2 蛋白在HCV入胞过程中的作用 |
| 1.5.3 E2 与机体免疫反应 |
| 1.6 丙型肝炎病毒基因的变异及分型 |
| 1.6.1 HCV 的变异机制 |
| 1.6.2 HCV 各基因的变异情况 |
| 1.6.3 HCV 基因分型研究 |
| 1.6.4 HCV 基因型的地理分布特点 |
| 1.6.5 HCV 基因分型的方法 |
| 1.7 HCV 的体外复制模型及感染动物模型研究 |
| 1.7.1 HCV 体外复制模型 |
| 1.7.2 黑猩猩 |
| 1.7.3 猴 |
| 1.7.4 树鼩 |
| 1.7.5 转基因和免疫耐受人鼠嵌合肝模型 |
| 1.8 丙型肝炎病毒感染的免疫反应 |
| 1.8.1 体液免疫应答 |
| 1.8.2 细胞免疫应答 |
| 1.9 丙型肝炎预防和治疗 |
| 1.9.1 干扰素(IFN) |
| 1.9.2 病毒唑 |
| 1.9.3 LAK 细胞治疗 |
| 1.9.4 熊去氧胆酸治疗 |
| 1.9.5 免疫调节剂 |
| 1.9.6 联合用药 |
| 1.9.7 中医中药 |
| 1.9.8 丙型肝炎预防 |
| 1.10 丙型肝炎疫苗研究 |
| 1.10.1 重组HCV 蛋白质疫苗 |
| 1.10.2 HCV 基因疫苗 |
| 1.10.3 HCV 融合基因疫苗 |
| 1.10.4 丙肝肝炎口服活菌苗 |
| 1.10.5 丙肝疫苗研制面临的问题 |
| 1.11 丙型肝炎病毒单克隆抗体(HCV-McAb)的研究 |
| 1.11.1 鼠源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.2 人源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.3 HCV单克隆抗体的意义及其发展前景 |
| 1.12 丙型肝炎病毒的实验室诊断研究进展 |
| 1.12.1 血清抗-HCV 抗体检测 |
| 1.12.2 HCV RNA检测用于HCV 感染的诊断 |
| 1.12.3 HCV 抗原的检测 |
| 1.13 丙型肝炎的研究展望 |
| 1.13.1 规范分型 |
| 1.13.2 细胞与动物模型 |
| 1.13.3 大容量噬菌体抗体库与肽库的构建 |
| 1.13.4 基因的表达调控 |
| 1.13.5 发病机制 |
| 1.13.6 HCV 受体 |
| 1.13.7 治疗 |
| 1.13.8 疫苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 HCV 囊膜蛋白基因E1E2 的亚克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 含有HCV 囊膜蛋白基因组的质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 载体和菌种 |
| 2.1.4 PCR 引物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收 |
| 2.2.3 纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接 |
| 2.2.4 新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法) |
| 2.2.5 连接产物的转化 |
| 2.2.6 重组质粒的提取 |
| 2.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 序列的计算机分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 2.3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 2.3.3 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.3.4 测序结果 |
| 2.3.5 氨基酸序列分析结果 |
| 2.3.6 HCV E1E2 基因编码蛋白质的理化性质分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 细胞系 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.1.5 载体核菌株 |
| 3.1.6 培养基 |
| 3.1.7 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 逆转录病毒表达质粒的构建 |
| 3.2.2 逆转录病毒假病毒制备 |
| 3.2.3 逆转录病毒假病毒侵染SP 2/0 细胞及抗性筛选表达细胞 |
| 3.2.4 FACS 分析筛选膜表面表达E1E2 蛋白的SP 2/0 细胞 |
| 3.2.5 表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞免疫Balb/c 小鼠 |
| 3.2.6 小鼠采血及血清分离 |
| 3.2.7 血清抗体的检测 |
| 3.2.8 血清中和抗体检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 3.3.2 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.3.3 HCV E1E2 基因的核苷酸和相应的氨基酸序列 |
| 3.3.4 FACS 分析检测表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞 |
| 3.3.5 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 3.3.6 中和抗体检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 HCV 囊膜蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 细胞系 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的制备 |
| 4.2.2 动物免疫 |
| 4.2.3 骨髓瘤细胞的准备 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞的准备 |
| 4.2.5 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 |
| 4.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆 |
| 4.2.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 4.2.9 小鼠腹水的制备 |
| 4.2.10 单抗中和活性的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 分泌特异单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 |
| 4.3.2 中和抗体检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小节 |
| 第五章 丙型肝炎病毒核酸疫苗的构建及动物免疫试验 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 细胞系 |
| 5.1.3 试验动物 |
| 5.1.4 基因组质粒 |
| 5.1.5 载体和菌株 |
| 5.1.6 培养基 |
| 5.1.7 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物的设计 |
| 5.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取 |
| 5.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 5.2.4 真核表达质粒的构建 |
| 5.2.5 重组真核表达质粒转染293T 细胞 |
| 5.2.6 FACS 分析表达E1E2 蛋白的293T 细胞 |
| 5.2.7 重组真核表达质粒的大量提 |
| 5.2.8 重组真核表达质粒免疫Balb/c 小鼠取 |
| 5.2.9 免疫小鼠采血及血清分离 |
| 5.2.10 免疫小鼠血清抗体的检测 |
| 5.2.11 小鼠血清中和抗体的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 5.3.2 重组pGEM-T Easy载体质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.3 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.4 重组质粒的测序结果 |
| 5.3.5 FACS 分析重组真核表达质粒转染293T 细胞瞬时表达 |
| 5.3.6 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 5.3.7 中和抗体检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小节 |
| 第六章 HCV 囊膜蛋白基因E1 和E2 原核表达载体的构建及表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 酶和试剂 |
| 6.1.3 阳性血清及酶标抗体 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 引物的设计与合成 |
| 6.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的鉴定 |
| 6.2.3 原核重组表达载体的构建与鉴定 |
| 6.2.4 E2 基因在大肠杆菌中的表达 |
| 6.2.5 表达蛋白的鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的PCR鉴定 |
| 6.3.2 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的酶切鉴定 |
| 6.3.3 重组原核表达载体序列测定 |
| 6.3.4 表达蛋白的SDS-PAGE 检测 |
| 6.3.5 表达蛋白的Western blot 检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词英汉对照表 |
| 致 谢 |
| 作者简介 |
（10）嵌合型重组HCV cDNA的构建及体外转录RNA的感染特性研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 HCV 1a/1b嵌合型全长cDNA的构建及其体外转录制备RNA的感染特性研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 HCV/JEV嵌合型cDNA的构建及其嵌合体RNA感染特性研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 发表文章 |
四、首次克隆出丙肝病毒五区蛋白（论文参考文献）
- [1]医疗机构丙型肝炎诊疗现况研究[D]. 冯小飞. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [2]克氏原螯虾CypA基因的结构及免疫功能分析[D]. 朱俊杰. 浙江大学, 2017(12)
- [3]猪IFITM基因分析及过量表达细胞系构建[D]. 张玉娟. 河南农业大学, 2013(04)
- [4]上海市HIV-1主要流行株近全长序列分析与HIV/HCV合并感染者中HCV基因亚型的分布[D]. 杨洋. 第二军医大学, 2009(10)
- [5]中国献血员人群丙型肝炎病毒“窗口期”感染分析[D]. 杨振. 中国协和医科大学, 2009(04)
- [6]细胞凋亡相关基因及因素在大鼠酒精性肝病中的相关性研究[D]. 金武丕. 延边大学, 2008(03)
- [7]FMDV分子背景分析、病毒拯救及多价基因工程疫苗研究[D]. 马鸣潇. 吉林大学, 2007(03)
- [8]日本脑炎病毒WHe株基因组特征及其疫苗的研究[D]. 唐青海. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [9]逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究[D]. 许信刚. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [10]嵌合型重组HCV cDNA的构建及体外转录RNA的感染特性研究[D]. 吕欣. 第四军医大学, 2005(06)