一、猪胆汁性肝纤维化的形成机制研究（论文文献综述）
宋健[1]（2021）在《基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究》文中研究指明目的:肝纤维化（hepatic fibrosis）是慢性肝病的常见病理基础,并且是慢性肝病发展为肝硬化的必要阶段。肝纤维化的主要特征是激活肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）介导细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积。并且慢性肝脏炎症也会加速肝纤维化的进程。人参皂苷活性成分是人参中主要的活性物质,其药理作用与能量代谢和调控炎症反应有关。人参皂苷具有肝保护、抗氧化、抗炎等广谱的药理活性。核受体肝X受体（liver X receptor,LXRs）与法尼酯X受体（Farnesoid X receptor,FXR）作为调节能量代谢的重要途径,在调控肝纤维化和炎症中发挥重要作用。本课题是基于核受体LXRs与FXR探讨人参皂苷25-OCH3-原人参二醇（25-OCH3-PPD）及20S-原人参三醇（M4）调控肝纤维化的作用与机制研究。方法:1.人参皂苷25-OCH3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠分为六组:正常组、TAA组、TAA+25-OCH3-PPD（5、10、20 mg/kg）给药组和TAA+Silymarin（100 mg/kg）组。25-OCH3-PPD与Silymarin组小鼠通过灌胃的方式给药。除正常组外,其他各组小鼠均通过腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200mg/kg,每周两次）。相关指标的测定:采用H&E染色、Sirius Red染色、Masson染色法检测组织病理学变化。检测血清中ALT、AST变化水平。TUNEL染色法检测25-OCH3-PPD对肝细胞凋亡的影响。在TAA诱导的肝纤维化中,通过蛋白印记、RT-PCR、免疫组织化学染色以及组织荧光染色实验检测细胞外基质、炎症因子、SIRT1、FXR、LXRα、LXRβ、P2X7r和NLRP3等蛋白或m RNA的表达情况。分析了与TAA诱导的凋亡途径相关的几个分子蛋白的表达,包括caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、c FILP。（2）体外实验:选用HSC-T6细胞,TGF-β刺激2 h,然后用25-OCH3-PPD（1、5或10μM）或caspase-1抑制剂I培养6 h。这些细胞被收集,分别做Western blotting以及免疫荧光实验,检测HSC-T6细胞中α-SMA、P2X7r、NLRP3、LXRβ、LXRα、caspase-1、IL-1β等蛋白的表达水平;并通过免疫荧光染色做进一步验证。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究中:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠随机分成4组:正常组、TAA组、TAA+M4-10组、TAA+M4-20组。小鼠每天采用M4（10和20 mg/kg）或等量生理盐水灌胃处理。除正常组小鼠外,小鼠腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200 mg/kg,每周两次）,以建立小鼠肝纤维化模型。相关指标的测定:采用H&E染色法检测组织病理学变化。提取总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测α-SMA、Collagen I、TIMP-1、MMP-13、FXR、P2X7r、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及免疫荧光染色做进一步验证。（2）HSC-T6细胞体外实验:HSC-T6细胞被TGF-β刺激2 h后,再用浓度为10、20μM的M4或guggulsterone（50μM）或GW4064（2μM）处理4 h。提取细胞总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测HSCs细胞中α-SMA、FXR、P2X7r、caspase-1等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及FXR与P2X7r免疫荧光染色做进一步验证。（3）Hep G2细胞质粒转染（sh RNA-FXR）:对Hep G2细胞给予FXR特异性si RNA转染48 h,然后给予TGF-β培养2 h,再用M4孵育细胞4 h。利用RT-PCR、Westeron blot,以及免疫荧光法检测FXR、α-SMA和P2X7r的表达变化以及IL-1β蛋白表达情况。结果:1.人参皂苷25-OCH3-PPD通过促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的研究:（1）TAA诱导肝纤维化小鼠模型:TAA组小鼠血清ALT、AST水平升高,肝组织发生损伤并有大量胶原沉积;而25-OCH3-PPD可以降低血清中ALT、AST水平;改善TAA诱导小鼠肝脏组织的病理变化以及肝组织中胶原沉积情况;25-OCH3-PPD可以改善肝组织中纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13;降低促炎细胞因子表达水平,包括降低caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;改善肝组织中肝细胞凋亡情况,调控了caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、FILP凋亡途径相关分子蛋白的表达;并抑制P2X7r-NLRP3炎症小体的活化进;抑制PI3K/Akt磷酸化,活化LKB1/AMPK-SIRT1信号通路;25-OCH3-PPD还能改善由TAA诱导的LXRs和FXR的活性降低。（2）体外实验中,25-OCH3-PPD减弱HSC-T6细胞中促纤维化标志物α-SMA的转录活性;25-OCH3-PPD可以通过调控LXRs和P2X7r-NLRP3、P-PI3K/P-Akt的表达降低,抑制肝星状细胞的活化;并且在肝星状细胞中抑制了caspase-1、IL-1β、IL-18的表达,与caspase-1抑制剂I效果一致。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究:（1）在TAA诱导的小鼠肝纤维化中,M4可减轻组织病理学改变,改善肝损伤;M4可以调节肝组织中肝纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13的表达;并降低肝组织中促炎细胞因子表达水平,包括降低F4/80、caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;蛋白印记、RT-PCR、组织免疫荧光实验表明,M4显着增加FXR的蛋白和m RNA的表达;M4也抑制了和P2X7r、NLRP3的表达,对P2X7r-NLRP3信号通路具有调控作用。（2）HSC-T6细胞体外实验中,TGF-β刺激后肝星状细胞被活化;给予M4可抑制HSC-T6中细胞外基质（ECM）的沉积包括α-SMA、Collagen-I、TIMP-1的表达,升高MMP-13的表达;以及降低caspase-1、IL-1β、IL-1R1和IL-6等炎症因子的表达水平;M4显着增加了FXR的表达,抑制了P2X7r-NLRP3信号通路,并作为FXR激动剂GW4064发挥作用;M4与GW4064激活FXR,抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1、IL-1β、IL-1R1的表达;（3）并且对Hep G2细胞转染FXR,建立sh RNA-FXR,实现了Hep G2细胞低表达FXR;但给予M4后FXR被激活,活化FXR后进而抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1的表达。结论:人参皂苷25-OCH3-PPD与M4可改善TAA诱导小鼠和活化HSCs中纤维化形成及炎症。25-OCH3-PPD可能激活LXRs,以改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体。并且25-OCH3-PPD可以通过调控LKB1-AMPK信号通路以及激活SIRT1调节TAA诱导的肝纤维化和肝脏炎症。M4改善了TAA诱导的肝纤维化,其调控肝纤维化机制可能通过激活FXR介导P2X7r-NLRP3炎症信号通路。因此,25-OCH3-PPD和M4可能是一种有效的抗肝纤维化和抗肝脏炎症活性物质。
程龙浩[2]（2021）在《肝纤维化小鼠模型的建立及血清生物标志物群的筛选研究》文中研究说明背景和目的:肝纤维化是多种慢性肝病进展期的共同病理表现,是诊断和治疗慢性肝病的关键环节。现阶段,临床诊断肝纤维化主要依赖于病理学、影像学和实验室检查,但仍需更准确有效的诊断方法;由于肝纤维化的发病机制复杂,目前尚无疗效明确的药物可供使用,因此在临床研究前期,需要建立能模拟不同病因导致肝纤维化的小鼠模型,作为解决肝纤维化防治问题的基础研究手段。代谢组学是系统生物学的组成部分,是探索疾病发病机制的重要研究工具,生物标志物是代谢组学的研究意义,考虑到目前临床上缺乏有效的诊断性生物标志物和药物治疗手段,通过代谢组学筛选肝纤维化模型的血清生物标志物,不仅能为临床疾病代谢组学提供前期理论基础,也对肝纤维化代谢途径的研究具有重要生物学意义。本课题旨在通过代谢组学技术分析不同种肝纤维化小鼠模型的血清代谢物,寻找与肝纤维化发生发展相关的共同代谢标志物和代谢机制。方法:分别建立四氯化碳化学毒性诱导的急、慢性肝纤维化模型,高脂高糖饮食诱导的早、晚期肝纤维化模型和胆管结扎胆汁淤积性肝纤维化模型,并通过血清生化指标、肝脏病理分析及纤维化标志物等验证肝纤维化模型的成功性。运用UPLCHDMS技术对以上小鼠模型的血清样本进行检测,采用多元统计分析方法筛选差异性化合物,再与代谢组学数据库匹配,鉴定得到各组模型特定的内源性代谢物,通过通路分析研究与肝纤维化相关的代谢通路变化。最后将五种肝纤维化模型的差异性代谢物信息和代谢通路进行整合,筛选共同的肝纤维化生物标志物。结果:五种肝纤维化模型中Model组小鼠的血清生化指标AST和ALT水平均较Control组有不同升高,但在高脂高糖饮食诱导的早期肝纤维化模型中升高不明显,肝组织切片H&E染色发现五种模型中Model组均发生炎症反应和肝损伤;肝纤维化评价方面,Masson染色和天狼星红染色表明,五种模型中Model组均有不同程度的胶原纤维沉积,肝纤维化轻重不同,编码肝纤维化基因Acta2和Col1a1的m RNA表达水平进一步验证肝纤维化病理结果,Model组Acta2和Col1a1的基因表达升高。以上结果说明五种不同类型的肝纤维化小鼠模型构建成功。随后就上述小鼠模型的血清样本进行基于代谢组学的生物标志物群研究。多元统计分析共筛选得到四氯化碳急性模型的81个差异性代谢物,四氯化碳慢性模型的63个差异性代谢物,高脂高糖早期模型的88个差异性代谢物,高脂高糖晚期模型的107个差异性代谢物和胆汁淤积性模型的147个差异性代谢物,代谢通路分析得到与肝纤维化发生相关的通路有苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、视黄醇代谢和生物素代谢,五种肝纤维化模型差异性代谢物整合分析得到与肝纤维化发生发展相关的共同代谢标志物有Lyso PC（14:0）、Lyso PC（15:0）、Lyso PC（16:0）、Lyso PC（17:0）、Lyso PC（18:0）、Lyso PE（22:0/0:0）、12（S）-HEPE和4,7,10,13-Eicosatetraenoic acid。结论:成功复制了多种不同类型的肝纤维化小鼠模型,并就其血清样本进行代谢组学的生物标志物群研究。肝纤维化发生涉及的代谢通路变化有苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、视黄醇代谢和生物素代谢。Lyso PC（14:0）、Lyso PC（15:0）、Lyso PC（16:0）、Lyso PC（17:0）、Lyso PC（18:0）、Lyso PE（22:0/0:0）、12（S）-HEPE和4,7,10,13-Eicosatetraenoic acid这8个代谢物可作为肝纤维化的血清生物标志物。
汪先凯[3]（2021）在《七叶皂苷钠通过降低4EBP1的磷酸化水平抑制梗阻性黄疸大鼠小胆管增生的研究》文中提出目的本课题选用梗阻性黄疸淤胆性肝纤维化大鼠模型,以七叶皂苷钠腹腔注射的干预方式,探讨4EBP1在梗阻性黄疸大鼠肝组织的表达情况及生物学关系,并研究七叶皂苷钠对梗阻性黄疸大鼠增生胆管的抑制作用及淤胆性肝纤维化的改善作用。方法将81只SD大鼠分为胆管结扎组（OJ）、胆管结扎+七叶皂苷钠治疗组（SA）以及假手术组（Sham）。其中自术后第一天给予SA组七叶皂苷钠,OJ组及Sham组大鼠给予相应量的生理盐水,保证3组实验大鼠的饲养环境一样。连续给药7天后处死实验大鼠,下腔静脉采取血液标本及分离获取肝脏标本。并且通过HE染色、Masson染色、免疫荧光染色以及免疫组织化学染色等检测观察实验大鼠的肝脏组织情况。对各组实验大鼠肝脏组织的染色情况用显微镜拍摄采集图片,然后使用Image-Pro Plus 6.0软件分析采集的图片,获取实验数据。对于实验数据的分析处理使用SPSS 22.0软件。结果（1）胆管结扎术48小时后,OJ组、SA组实验大鼠均出现尿液颜色黄色加深,耳朵、眼睛、毛发及皮肤黄染,粪便呈浅灰色;Sham组实验大鼠尿液呈淡黄色,耳朵、眼睛、毛发及皮肤无黄染。（2）HE染色结果显示,Sham组实验大鼠可见辐射状肝索,未见明显的结缔组织增生,肝脏形态结构正常。并且在肝脏组织汇管区未见增生性胆管,肝脏无淤胆性纤维化症状;OJ组大鼠肝脏组织肝索结构紊乱,间隙扩张,空泡增多。并明显可见肝脏组织大面积坏死,整个显微镜视野布满炎症细胞,在汇管区周围可见大量的细小胆管;SA组实验大鼠肝脏组织肝索较规整,在显微镜下可见数量极少的空泡。其肝脏组织汇管区周围胆管数量较OJ组明显减少,肝小叶结构变化也较OJ组有显着改善。（3）Masson染色结果显示,相比Sham组,OJ组大鼠肝脏胶原纤维的面积及平均胶原密度等指标均明显增高（P<0.05）;SA组大鼠肝脏胶原纤维面积及平均胶原密度等指标较OJ组大鼠肝组织有显着改变（P<0.05）。（4）免疫荧光结果显示,Sham组大鼠肝脏中COL-Ⅰ及COL-Ⅲ蛋白含量均最少,OJ组大鼠肝脏中COL-Ⅰ及COL-Ⅲ蛋白含量比Sham组显着升高（P<0.05）;相比OJ组,SA组大鼠肝脏中COL-Ⅰ及COL-Ⅲ蛋白含量明显减少（P<0.05）。（5）免疫组织化学染色结果显示,Sham组实验大鼠肝脏组织中α-SMA表达最低,阳性染色面积最少;OJ组实验大鼠中α-SMA表达最高,阳性染色面积最多,分布范围最广泛;SA组实验大鼠中α-SMA表达水平显着下降,阳性染色面积明显减少相比OJ组实验大鼠而言。假手术组实验大鼠汇管区周围未见4EBP1及p-4EBP1的阳性表达;OJ组大鼠肝脏相比Sham组大鼠肝脏汇管区周围可见大量的胆管,且胆管的柱状上皮细胞内可见4EBP1及p-4EBP1明显表达。SA组大鼠肝脏汇管区周围仅存在少量的胆管,胆管细胞内可见4EBP1阳性表达,而p-4EBP1未见在SA组大鼠肝脏内阳性表达。结论梗阻性黄疸模型大鼠引起淤胆性肝纤维化,肝脏汇管区周围胆管大量增生代偿。七叶皂苷钠可以抑制梗阻性黄疸模型大鼠的小胆管增生通过降低胆管柱状上皮细胞4EBP1的磷酸化表达水平。
王荣华[4]（2020）在《mTOR信号通路介导Omega-3多不饱和脂肪酸防治肝纤维化的研究》文中认为肝纤维化是由各种致病因子所致的细胞外基质（Extra cellular matrix,ECM）过度沉淀的病理过程,阻止或减缓肝纤维化的发生与发展是预防肝硬化的关键。目前临床主要采糖皮质激素类、黄酮类等化学药物进行肝纤维化治疗,这种治疗方式虽然疗效确切,但存在副作用大和易耐药等问题,因此,现阶段迫切需要寻找一种作用温和、毒副作用小和耐药性低的新型抗纤维化疗法。Omega-3多不饱和脂肪酸（Omega-3 polyunsaturated fatty acid,ω-3 PUFAs）源于植物和深海鱼类,主要由α-亚麻酸（α-linolenic acid,ALA）、二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）组成,是一种安全可靠和无耐药性的生物活性化合物。既往研究已证实ω-3 PUFAs对机体炎症具有显着的调控作用,近年来已成为许多慢性疾病饮食干预和治疗的研究热点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路作为细胞生长中心协调器,对肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）的活化增殖和胶原纤维的表达具有调控作用,是肝纤维化发生发展密切相关的信号通路之一。目前,ω-3 PUFAs饮食干预对肝纤维化的防治作用及其对mTOR信号通路的影响尚不清楚,因此有待做进一步探讨。综上所述,本课题的研究意义在于探讨ω-3 PUFAs饮食干预对肝纤维化的防治作用及其对mTOR信号通路的影响,为潜在的新型抗纤维化疗法提供实验和机制基础。目的:探讨ω-3 PUFAs饮食干预对肝纤维化的防治作用及其对mTOR信号通路的影响,为其潜在的分子机制提供理论依据。方法:将20只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、4周模型组、8周模型组和治疗组,其中4周模型组的设立是为了确定ω-3 PUFAs饮食干预开始时的肝纤维化程度。模型组和治疗组小鼠均以5 ml·kg-1每周2次的剂量腹腔注射20%CCl4玉米油溶液,对照组小鼠注射相同剂量的玉米油,除4周模型组外,其余3组持续注射8周。此外,治疗组小鼠从造模的第4周起每日1次进行4 g·kg-1 EPA/DHA的灌胃,对照组和8周模型组灌食相同剂量的生理盐水。（1）通过记录分析造模期间小鼠体重变化以及造模结束后小鼠毛色、肝脏大体形态和肝重体重比来初步鉴定肝纤维化模型是否建立成功,随后采用马松三色染色从肝脏组织形态学层面做进一步鉴定;（2）采用HE染色检测各组小鼠肝组织的病理学变化;（3）采用免疫组化（Immunohistonchemistry,IHC）方法检测各组小鼠肝组织中抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤因子-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、B淋巴细胞瘤因子-2-x L（B-cell lymphoma-2-x L,Bcl-x L）及细胞增殖蛋白增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）的表达水平;（4）采用IHC和蛋白质免疫印迹（Westerin blot,WB）方法检测各组小鼠肝组织中肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达水平;（5）采用天狼星红染色和WB方法检测各组小鼠肝组织中胶原纤维含量及促纤维化蛋白Collagen1A1和Fibronectin表达水平;（6）采用WB方法检测各组小鼠肝组织中mTOR通路相关蛋白mTOR和S6核糖体蛋白（S6 Ribosomal Protein,S6）的总蛋白表达水平及其磷酸化水平。结果:（1）与对照组相比,4周模型组小鼠的毛色体重、肝脏大体形态、肝重体重比及马松三色染色均显示其肝纤维化已经形成,表明在造模4周后,肝纤维化模型已成功建立;（2）相比于8周模型组,治疗组小鼠的肝组织结构损伤改善明显,肝细胞坏死数量和炎症细胞数量显着减少,表明ω-3 PUFAs饮食干预显着改善纤维化肝组织损伤;（3）与8周模型组相比,治疗组Bcl-2、Bcl-x L和PCNA蛋白表达显着升高。表明ω-3 PUFAs饮食干预有效抑制肝细胞的凋亡并促进肝细胞的增殖;（4）与8周模型组相比,治疗组α-SMA蛋白表达明显下调,表明ω-3 PUFAs饮食干预显着抑制HSCs的活化;（5）与8周模型组相比,治疗组小鼠胶原纤维含量及促纤维化蛋白Collagen1A1和Fibronectin表达显着降低,表明ω-3 PUFAs饮食干预具有明显的抗纤维化作用;（6）与8周模型组相比,治疗组mTOR和S6的磷酸化水平显着下降,表明ω-3 PUFAs饮食干预对mTOR通路有抑制作用,mTOR信号通路是介导其作用的信号通路之一。结论:ω-3 PUFAs饮食干预对肝纤维化具有防治作用,mTOR信号通路是其潜在的分子机制之一。
张珺[5]（2020）在《IL-35和P4HA2在自身免疫性肝病中的作用及机制研究》文中研究说明第一部分IL-35促进Ig G4相关疾病中Th9细胞介导的Ig G4类别转换背景与目的:Ig G4相关疾病（Ig G4-RD）是累及全身多种脏器的自身免疫性疾病,以血清Ig G4水平显着升高、肝脏/胰腺组织中Ig G4阳性浆细胞大量浸润、闭塞性静脉炎和席纹状纤维化为主要特征。但是,异常免疫应答在Ig G4-RD发生发展中所起的作用尚未完全明确。Ig G4相关硬化性胆管炎可以并发或不并发自身免疫性胰腺炎,导致顽固性黄疸和胆道感染,甚至进展为肝硬化和肝衰竭。这项研究的目的是明确Ig G4相关疾病中特异性表达的炎症因子,并阐明分泌IL-35的浆细胞与Th9细胞之间的相互作用促进Ig G4相关疾病中免疫球蛋白类别转换的机制。方法:在Ig G4相关疾病患者的血浆样本中检测24种促炎症细胞因子和13种趋化因子的表达水平。实验结果表明,与疾病对照和健康对照组相比,Ig G4相关疾病患者血浆IL-35表达水平显着升高。采用免疫组化、免疫荧光方法分别检测肝脏和胰腺组织中IL-35两个亚基EBI3和IL-12p35表达水平。随后我们通过体外诱导实验和流式细胞术评估了IL-35在Th9细胞分化中的作用。为了进一步阐明Th9细胞在Ig G4相关疾病中的作用,我们通过流式细胞术、免疫组化和免疫荧光检测了Ig G4-相关疾病患者外周血和病变组织中Th9细胞的数量,并通过体外诱导实验检测IL-9在浆细胞分化和免疫球蛋白抗体类别转换过程中的作用。结果:与疾病对照和健康对照组相比,Ig G4相关疾病患者血浆IL-35表达水平显着升高,病变组织中EBI3和IL-12p35阳性细胞数量显着升高。EBI3、IL-12p35分别与B细胞标志物CD19和CD38存在共定位,表明Ig G4相关疾病患者病变组织中B细胞可以分泌IL-35。有趣的是,体外诱导实验表明IL-35通过激活IRF4促进了幼稚的CD4阳性T细胞向Th9细胞分化。Ig G4相关疾病患者外周血和病变组织中Th9细胞显着升高,由Th9细胞分泌的IL-9促进了浆细胞的分化以及Ig G1和Ig G4的产生,且主要促进了浆细胞分泌Ig G4,使Ig G1/Ig G4比值显着降低。结论:Ig G4相关疾病患者IL-35显着升高,并且在Th9细胞分化中发挥重要作用,从而进一步促进了IL-9介导的浆细胞分化和Ig G4型免疫球蛋白类别转换。第二部分P4HA2在自身免疫性肝病中调控胆管反应并促进胆汁淤积性肝纤维化的机制研究背景与目的:原发性胆汁性胆管炎（PBC）和原发性硬化性胆管炎（PSC）,是自身免疫介导的慢性胆汁淤积性肝病,以非化脓性胆管损伤为主要特征,可进展为胆汁淤积性肝纤维化、肝硬化甚至肝衰竭。慢性胆汁淤积性肝损伤时,胆管反应是导致胆汁淤积性肝纤维化的关键事件。脯氨酰4-羟化酶A2（P4HA2）表达于胆管反应细胞,这项研究的目的是探究P4HA2调控胆管反应促进胆汁淤积性肝纤维化的机制。方法:采用免疫组化、免疫荧光方法检测肝组织中P4HA2表达情况。构建P4HA2-/-小鼠,采用H&E染色、Masson染色、免疫组化、q PCR等多种方法,明确DDC诱导的慢性胆汁淤积性肝损伤模型中,P4HA2促进胆管反应和胆汁淤积性肝纤维化的作用。以人胆管上皮细胞系为研究模型,通过RNA-seq、q PCR、Western blot和免疫共沉淀等阐明P4HA2调控胆管反应的机制。结果:与健康对照和疾病对照患者相比,PBC患者和PSC患者肝组织内P4HA2表达水平显着升高,且肝脏损伤程度越重、炎症程度和纤维化分期更高的患者,P4HA2表达水平更高。在胆汁淤积性肝损伤小鼠模型中,与野生型小鼠相比,P4HA2-/-小鼠胆管反应和纤维化程度显着减轻。体外实验表明,P4HA2与Hippo信号通路关键元件SAV1结合,促进SAV1羟基化并通过泛素-蛋白酶体系统降解,从而激活YAP,促进胆管上皮细胞增殖。结论:胆汁淤积性肝损伤过程中,高表达的P4HA2通过与SAV1结合调控Hippo/YAP通路,促进胆管反应和胆汁淤积性肝纤维化。P4HA2极有可能成为包括PBC和PSC在内的自身免疫性肝病的潜在治疗靶点。
余蕾[6]（2020）在《肝苏颗粒抑制肝星状细胞的活化作用及机制研究》文中研究指明目的:采用TGF-β1活化肝星状细胞,探讨肝苏颗粒主要有效物质对其抑制作用和作用机制,从而初步揭示肝苏颗粒抗肝纤维化的可能机理,为其进一步开发和应用提供依据。方法:1.文献研究查阅近年来肝苏颗粒及赶黄草有关文献报道,包括肝苏颗粒来源、临床应用、实验研究报道等进行文献数据分析。2.实验研究建立TGF-β1诱导的人肝星状细胞LX-2活化模型,MTT法筛选肝苏颗粒主要有效物质赶黄草总黄酮的作用剂量,设定高、中、低三个剂量,采用酶联免疫吸附法检测不同剂量下细胞培养液中I型胶原（Col I）和纤连蛋白（FN）的含量,划痕实验检测细胞迁移率,胶原收缩实验检测胶原收缩情况,流式细胞技术检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白m RNA的表达,western Blot法检测凋亡相关蛋白及TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的表达情况;并观察在给予TGF-β1/Smads信号通路抑制剂LY2109761后,赶黄草总黄酮对活化LX-2细胞胶原收缩和TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达的影响。结果:1.肝苏颗粒的文献研究结果通过对关于肝苏颗粒的文献进行梳理、研究后发现,肝苏颗粒为现在常用的治疗肝病的中药制剂之一,主要功效为降酶、保肝、退黄,其化学成分主要为黄酮类和酚酸类化合物。实验研究和临床应用文献均表明,肝苏颗粒对肝纤维化具有治疗作用;药学和药理研究可证明,赶黄草总黄酮是当前公认的赶黄草保肝、抗脂肪肝的主要药效物质,也是其治疗肝纤维化的重要有效物质。2.LX-2活化模型的建立和赶黄草总黄酮药效浓度确定TGF-β1浓度为2、4、6、8、10、12、14、16μg/L均可促进LX-2细胞增殖（P<0.01）,6μg/L时的增殖活性和细胞培养液中α-SMA含量最高,当低于或超过该剂量时作用均减弱,提示6μg/L的TGF-β1是活化LX-2的最佳浓度,故以之为LX-2细胞活化浓度。赶黄草总黄酮药物浓度的筛选结果显示,赶黄草总黄酮浓,度为13mg/L时,细胞存活率大于80%,而浓度大于17mg/L时,药物呈现出明显的细胞毒性,因此选用5、9、13mg/L三个剂量进行后续实验。3.赶黄草总黄酮对活化的LX-2一般状态和细胞凋亡的影响MTT法结果显示,赶黄草总黄酮可抑制TGF-β1活化后的LX-2细胞的增殖,且药物浓度越高抑制作用越明显,在13mg/时有显着抑制作用（P<0.01）。划痕实验显示赶黄草总黄酮可抑制TGF-β1活化后的LX-2细胞的迁移,在9mg/L时抑制作用显着（P<0.01）;胶原收缩实验显示,TGF-β1组胶原收缩明显增加,而赶黄草总黄酮作用后的各组与单纯TGF-β1组相比较,胶原的收缩程度降低,作用效果呈剂量依赖。细胞液基质检测显示,赶黄草总黄酮可明显抑制活化后LX-2细胞液中FN和ColⅠ的升高（P<0.01）;流式细胞仪检测显示TGF-β1对细胞凋亡无明显影响,而赶黄草总黄酮可促进活化后的LX-2细胞凋亡,作用效果呈剂量依赖,在赶黄草总黄酮作用浓度达到9mg/L时有统计学意义（P<0.01）;western blot结果显示,TGF-β1活化的LX-2细胞中Bcl-2表达增加而Bax表达降低,但与未活化组比较无显着性差异;赶黄草总黄酮各组作用的LX-2细胞Bcl-2的表达显着降低而Bax的表达则明显增加（P<0.05）。4.赶黄草总黄酮对活化肝星状细胞TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的影响RT-PCR实验显示,赶黄草总黄酮可显着抑制LX-2细胞中α-SMA m RNA的表达（P<0.01）。另外,赶黄草总黄酮作用后,TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白Smad2、Smad3 m RNA表达均显着减少（P<0.01）;而Smad7的表达稍有增加,在药物浓度达到13mg/L时,差别具有统计学意义（P<0.05）。同样,western blot结果显示,赶黄草总黄酮作用后,Smad3、p-Smad2和p-Smad3的表达均不同程度减少,而Smad7的表达稍增加,且在9mg/L时具有统计学意义（P<0.01）。5.赶黄草总黄酮对活化肝星状细胞TGF-β1/Smads信号通路抑制后的影响采用特异性TGF-β1/Smads信号通路抑制剂LY2109761作用于LX-2后,胶原收缩结果显示,单纯用赶黄草总黄酮和单纯用LY2109761均可抑制胶原收缩（P<0.05）,而在使用LY2109761预处理后再给予赶黄草总黄酮,抑制效果大于单纯给药（P<0.01）;western blot实验结果显示,单纯使用赶黄草总黄酮和LY2109761均可抑制α-SMA、p-Smad2和p-Smad3的表达（P<0.05）,而LY2109761预处理后再给予赶黄草总黄酮,抑制效果大于单纯给药（P<0.01）。结论:1.肝苏颗粒具有抗肝纤维化作用,赶黄草总黄酮是其重要的有效物质。2.赶黄草总黄酮对TGF-β1活化的肝星状细胞LX-2具有抑制作用,可抑制增殖和降低基质分泌,机制与诱导凋亡和抑制TGF-β1/Smads信号通路有关。
张石蕾[7]（2020）在《肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体抗肝纤维化的作用及机制研究》文中研究说明目的:构建CPhGs脂质体,并表征其特性;考察CPhGs和CPhGs脂质体体外释放行为及体内药代动力学特征;采用体内实验,探讨CPhGs脂质体对BSA诱导的大鼠免疫性肝纤维化模型的防治作用及作用机制;采用体外实验,观察CPhGs脂质体对HSCs增殖、细胞凋亡、细胞周期及胶原分泌的影响,并进一步通过观察CPhGs脂质体对rrPDGF-BB刺激HSCs增殖的影响,从细胞和分子水平上探讨CPhGs脂质体对MAPK和FAK/PI3K/Akt信号传导通路的影响,揭示其抗肝纤维化的作用靶点,并阐明其发挥作用的分子机制。方法:（1）采用薄膜分散一次包封法、薄膜分散二次包封法、逆向蒸发法、真空冷冻干燥薄膜分散二次包封法制备CPhGs脂质体,使用透射电镜观察其形态,Malvern激光粒度分析仪测量其粒径,Zeta电位、HPLC法测量药物包封率、载药率,评价并确定其最佳制备方法。（2）以原料药为对照组,采用HPLC检测并阐明CPhGs脂质体的体外释药规律,LC-MS法测定CPhGs脂质体中松果菊苷在大鼠血浆中的血药浓度,分析药代动力学特征。（3）使用BSA建立免疫性肝纤维化大鼠模型,体内观察CPhGs脂质体及CPhGs原料药对BSA诱导的大鼠免疫性肝纤维化的影响,分析血清学指标、肝组织病理、免疫组化指标以及ECM蛋白、MAPK通路、炎症蛋白表达水平的变化,评价CPhGs脂质体抗肝纤维化的作用及可能的分子机制。（4）体外观察CPhGs脂质体对HSCs的增殖和细胞凋亡、细胞周期及对细胞活力、细胞毒性的影响,从细胞学水平阐述CPhGs脂质体抗肝纤维化的作用,研究CPhGs脂质体对rrPDGF-BB/FAK/PI3K/Akt信号通路的影响,探讨其抗肝纤维化的作用靶点,从分子水平阐明其作用机制。结果:（1）采用薄膜分散一次包封法制备的3个不同批次CPhGs脂质体包封率平均值为28.55%,载药率为2.73%;采用薄膜分散二次包封法制备的3个不同批次CPhGs脂质体包封率平均值为38.46%,载药率为3.71%;采用逆向蒸发法制备的3个不同批次CPhGs脂质体包封率平均值为33.88%,载药率为3.28%,薄膜分散二次包封法制备的CPhGs脂质体包封率和载药率均是最高;在以薄膜分散二次包封法制备的CPhGs脂质体基础上,利用真空冷冻干燥法制备了CPhGs脂质体冻干粉,复溶后CPhGs脂质体冻干粉外观形态良好,冻干前后纳米粒的粒径和包封率变化均不大,说明其稳定性良好,为后续实验提供足够的样品量。（2）体外释药结果显示,最适合CPhGs和CPhGs脂质体的模型分别是一级动力学和Higuchi方程,CPhGs脂质体没有显示任何突释效应;大鼠体内的药物代谢动力学相关参数表明,CPhGs原料药和CPhGs脂质体组在相同剂量灌胃给药的情况下,CPhGs脂质体给药后Cmax明显提高（P<0.05）,CPhGs脂质体组给药0.75h之后的血药浓度均远远大于原料药组（CPhGs脂质体组35.95±3.95 ng/ml vs CPhGs原料药组27.14±0.93 ng/ml）,给予CPhGs原料药后大鼠血浆中松果菊苷的浓度较低,CL为2.07±0.39 ml/h/kg,t1/2显着延长（CPhGs脂质体组5.33±0.43h vs CPhGs原料药组2.07±0.61h,P<0.05）,MRT显着延长（CPhGs脂质体组5.87±0.32h vs CPhGs原料药组2.80±0.47h,P<0.05）,Tmax显着增加（CPhGs脂质体组1.60±0.55h vs CPhGs原料药组0.60±0.22h,P<0.05）;CPhGs脂质体组大鼠血浆中24h内药时曲线下面积较CPhGs原料药组显着提高,为原料药组的273.30%。（3）体内药效学实验结果表明,CPhGs脂质体和CPhGs原料药干预均可使肝纤维化模型大鼠肝脏、脾脏指数降低,其中CPhGs脂质体组大鼠肝脏、脾脏指数与CPhGs原料药组相比显着降低;并且,相同剂量的CPhGs脂质体组大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA、γ-GT、TGF-β、肝纤维化四项LN、HA、PCⅢ、IV-C以及肝组织HYP含量总体上较CPhGs原料药组有明显的下降,大鼠肝脏病理损伤情况也有所改善;免疫组化和WB实验结果均显示CPhGs脂质体组ECM标志性分子α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平显着降低;与模型组、CPhGs原料药组以及空白脂质体组大鼠相比,CPhGs脂质体给药组大鼠肝组织MAPK信号通路相关蛋白p-ERK 1/2、p-JNK 1/3和p-P38以及炎症相关蛋白NF-κB、AP-1、Cox-2、HMGB1有所下调,IκBα有所上调。（4）体外药效学实验结果表明,CPhGs脂质体对HSCs的增殖抑制率随着药物浓度的升高逐渐升高,24h的IC50值为42.535μg/ml;CPhGs脂质体（29.45、14.72、7.36μg/ml）对HSCs没有明显的毒性作用（P>0.05）。流式细胞仪检测结果显示,浓度为29.45μg/ml的CPhGs脂质体可诱导HSCs晚期凋亡,晚期凋亡细胞比例高于早期凋亡细胞比例;在浓度为14.72μg/ml和7.36μg/ml的CPhGs脂质体组中,早期凋亡细胞比例要明显高于晚期凋亡细胞;细胞周期结果显示,与正常对照组相比,不同浓度的CPhGs脂质体处理HSCs后,G0/G1期细胞比例明显升高（P<0.05）,S期细胞比例明显降低（P<0.05）,G2/M期细胞比例明显降低（P<0.05）。与rrPDGF-BB组比较,不同浓度CPhGs脂质体组均可抑制rrPDGF-BB诱导的HSCs的增殖;荧光定量PCR结果显示,与rrPDGF-BB组相比,29.45、14.72、7.36μg/ml CPhGs脂质体组CollagenⅠ、α-SMA、TIMP-1的mRNA表达水平均降低,MMP-1 mRNA表达水平均增多（P<0.05）。在rrPDGF-BB刺激活化的HSCs中,CollagenⅠ和α-SMA mRNA表达水平显着提升,经三个剂量组的CPhGs脂质体干预均可以减少CollagenⅠ、α-SMA、TIMP-1的mRNA表达水平,尤其是29.45μg/ml高剂量CPhGs脂质体组效果最为明显。WB分析结果显示,与正常对照组比较,模型组CollagenⅠ、α-SMA蛋白表达水平显着升高（P<0.05）;与模型组比较,CPhGs脂质体7.36μg/ml、14.72μg/ml和29.45μg/ml三个剂量组中CollagenⅠ、α-SMA蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;三个剂量组的CPhGs脂质体处理HSCs 24小时后,HSCs中p-PI3K和p-Akt水平持续下降;和rrPDGF-BB刺激组相比,rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达组中FAK蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,而rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达对照组中FAK蛋白表达水平无显着变化;和rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达组相比,rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达对照组和rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达+CPhGs脂质体给药组磷酸化PI3K和磷酸化Akt蛋白表达水平显着下降（P<0.01）。结论:采用薄膜分散二次包封法制备得到CPhGs脂质体纳米粒,形态圆整、包封率较高、粒径分布小、稳定性好;体外释药实验结果表明,本研究所制备的CPhGs脂质体纳米粒在一定程度上有缓释作用,并且明显改变了CPhGs的药物动力学行为,减缓了药物的消除时间,提高了药物的生物利用度;CPhGs脂质体能不同程度降低肝纤维化大鼠的肝、脾指数,改善血清肝功能酶指标,降低血清肝纤维化标志物含量,减轻肝细胞变性及炎性细胞浸润,抑制胶原纤维的合成与沉积,通过MAPK通路及炎症因子蛋白表达抑制肝纤维化的发展变化;CPhGs脂质体给药组能在无细胞毒性的基础上明显减少HSCs的活化,剂量依赖性地抑制rrPDGF-BB刺激的HSCs的细胞增殖,能通过PDGF/FAK/PI3K/Akt通路对rrPDGF-BB刺激的HSCs中ECM蛋白表达产生调控。研究结果为CPhGs脂质体纳米粒在抗肝纤维化方面的应用提供了科学依据。
谢诗怡[8]（2020）在《八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及机制研究》文中研究说明研究背景胆汁淤积指肝内外各种原因造成胆汁形成和（或）排泄障碍,反流入血液的所引起一系列临床症状及肝损伤的临床综合症,可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝衰竭。根据胆汁淤积的发生部位可将其分为肝内和肝外胆汁淤积两大类,肝内胆汁淤积疾病主要有病毒性肝炎、酒精或非酒精性脂肪性肝炎、药物性肝损伤、妊娠肝内胆汁淤积、各种病因导致肝硬化、原发性胆汁性肝硬化/原发性硬化性胆管炎、原发性硬化性胆管炎及合并自身免疫性肝炎、药物性胆管病等;肝外胆汁淤积主要疾病和病因有胆管结石、先天性肝外胆管闭锁、胆总管/Oddi括约肌狭窄、胆管寄生虫病、胆总管囊肿、胆管及周围组织肿瘤压迫、胰腺癌、胰腺囊肿和慢性胰腺炎等。胆汁淤积使引起毒性胆汁代谢物质蓄积于肝内,出现胆汁淤积性病变,在多种细胞因子持续刺激下,肝实质细胞进一步受损,可发展为肝组织纤维化。肝纤维化主要病理改变为肝组织内细胞外基质的过度沉积,炎症反应是其重要机制之,在炎症因子作用下,纤维化介质与肝星状细胞膜上受体结合,实现肝星状细胞活化、增殖、转型,促进胶原、糖蛋白的合成,从而重构细胞外基质,导致肝纤维化,各种纤维化介质对细胞外基质的代谢有重要的调节作用,尤其是转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF—β1）、肿瘤坏死因子-α、血小板源生长因子以及IL-6等,在促进细胞的增殖、迁移和转化过程中起重要作用,同时激活的肝星状细胞释放活性氧类物质而反过来继续激活肝星状细胞以促进纤维化的发展。TGF—β1被认为是最强的促肝纤维化因子,在促肝纤维化中占关键地位,其纤维化作用为对细胞外基质的形成产生一定的刺激作用,降低细胞外基质蛋白酶的活化,胶原酶的活性,减少其降解,使成纤维细胞发生趋化作用,从而促进诱发组织器官逐渐发生纤维化,目前研究认为,TGF—β1主要通过TGF/Smad信号转导通路来发挥促纤维化的作用。Smads蛋白是目前所知的唯一TGF-β受体的胞内激酶底物,是TGF-β信号跨细胞膜传入细胞核内的关键下游蛋白,调节核内靶基因的转录,从而发挥TGF-β1的生物效应。八宝丹是我国治疗肝胆系疾病的重要中成药,具有清利湿热,活血解毒,去黄止痛的功效,近年来已有多项研究发现,八宝丹可保护肝脏细胞,降低血清肝功能、肝纤维化指标水平,改善黄疽,且不良反应较少,在临床上广泛应用于防治传染性病毒性肝炎、肝硬化等肝胆系疾病。进一步研究发现八宝丹可以改善肝纤维化大鼠的炎症反应及变性坏死,逆转肝纤维化,其抗纤维化机制尚未明确,是否通过影响转化生长因子β1实现肝纤维的逆转尚未有研究。Masson染色法利用胶原纤维含有碱性氨基酸,能与酸性染料进行结合而着色的特点对胶原纤维着色,光镜下胶原纤维呈亮蓝色或绿色,已有学者发现在Masson染色的作用下,慢性肝炎患者肝组织汇管区周围的Ⅰ型胶原蛋白比HE染色可更清晰的显示,进一步准确展示出慢性肝炎发展至肝纤维化的进程,可直观判定肝纤维化程度与范围。目前认为,肝脏纤维化主要与Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维有关,运用苦味酸-天狼星红染色法（Picric Sirius red,PSR）,在偏振光法显微镜下能够在一张切片上对不同类型的胶原纤维定性及定量诊断,明确胶原纤维的种类及分布,可早期及时诊断肝组织纤维化病理状态,如:Ⅰ型胶原表现为橘黄色或红色,镜下可见其纤维排列紧密,具有很强的双折光性;Ⅲ型胶原纤维为绿色的细纤维,为疏松网状结构,具有较弱的双折光性。作为常用的两种方法,其在评价肝脏纤维化方面的比较尚未见报道。故本研究以ANIT诱导小鼠建立胆汁淤积性肝病模型,应用上述两种不同的染色方法观察胶原沉积情况,初步比较苦味酸-天狼猩红染色法和Masson染色法两种方法在评价肝纤维化中的应用价值,并以八宝丹治疗,探讨其对胆汁淤积症小鼠的保护作用,通过免疫组织化学、RT-PCR研究TGF/Smad在小鼠肝组织中的表达情况,探讨八宝丹对TGF/Smad信号转导通路的影响,阐明其作用机制。目的观察八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及探讨其可能机制,为八宝丹治疗胆汁淤积性肝病提供理论依据。方法将15只昆明种雄性小鼠随机分为3组:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组,每组5只。除空白对照组小鼠外,其余两组小鼠均一次性予灌胃1%α—萘异硫氰酸酯（α-Naphthyl isothiocyanate,ANIT）橄榄油溶液,按照 100mg/Kg剂量建立胆汁淤积模型。空白对照组每日予生理盐水灌胃1次,胆汁淤积组每日予生理盐水灌胃1次,八宝丹治疗组每日予八宝丹生理盐水混悬液灌胃1次。给药10d后麻醉后取血及肝组织。检测各组小鼠血清中总胆汁酸（total bile acids,TBA）、总胆红素（total bilirubin,TBil）、直接胆红素（direct bilirubin,DBil）、谷氨酸氨基转移酶（alanine transaminase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase,AST）、碱性怜酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、谷氨酰转肽酶（丫-glutamyl transpeptidase,GGT）、白蛋白（albumin,ALB）、透明质酸（hyaluronic acid,HA）,层粘连蛋白（laminin,LN）,Ⅲ型前胶原（type Ⅲ procollagen,PC-Ⅲ）,Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen,C-Ⅳ）水平。肝组织采用苏木素-伊红染色（Hematoxylin and eosin,HE染色）、Masoon染色、苦味酸-天狼星红染色法观察其病理形态学改变;免疫组织化学法检测肝组织TGF-β1、Smad3蛋白表达;RT-PCR 检测肝组织 TGF-β1、Smad3 mRNA 表达。结果血清学指标（1）肝功能指标:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:ALT（42.44±4.93vs400.33±65.49 vs 144.16±38.66）、AST（171.09±22.30 vs 656.95±118.17 vs 315.81±75.65）、TBIL（6.31±0.91 vs 53.12±7.51vs 19.42±1.81）、DBIL（4.54±0.86 vs 48.49±7.08 vs 14.26±2.07）、ALP（158.82±39.18 vs 953.64±282.86 vs 535.99±131.42）、GGT（29.58±3.49 vs 159.49±24.78 vs 81.53±13.59）、TBA（39.01±3.05vs 339.47±167.73 vs 238.28±103.87）,各组间差异有统计学意义,P<0.01;ALB（30.77±2.24 vs 22.47±2.03 vs 25.14±2.38）,空白对照组与胆汁淤积组之间有统计学差异P<0.01,八宝丹治疗组与胆汁淤积组之间无统计学差异,P>0.01。（2）肝纤维化指标:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:HA（302.16±45.95vs 644.21±71.69 vs 443.79±47.06）、LN（135.13±49.31vs417.55±37.76 vs224.33±48.61）、PC-Ⅲ（12.15±1.87vs 24.94±2.02vs 16.15±1.03）、C-Ⅳ（37.12±2.00 vs74.98±4.34vs 54.92±4.44）,各组间差异有统计学意义,P<0.01。肝脏组织学（1）HE染色:空白对照组肝组织结构基本正常,肝细胞呈整齐排列;胆汁淤积组肝细胞大面积坏死,肝小叶结构大多破坏。八宝丹治疗组肝细胞形态结构较清晰,肝损伤明显改善,肝坏死面积减少。（2）Masoon染色:空白对照组可见少量胶原纤维。胆汁淤积组肝组织内大量蓝色胶原纤维沉积,已形成假小叶。八宝丹治疗组胶原纤维介于空白对照组及胆汁淤积组之间。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组纤维化面积（6.18±0.98vs39.37±3.89vs25.65±2.24）,各组间差异有统计学意义,P<0.01。（3）苦味酸-天狼星红染色:空白对照组小鼠肝组织少量Ⅰ、Ⅲ型胶原显色。胆汁淤积组:肝组织中可见明显增多的橘红色Ⅰ型胶原粗纤维,形成小叶间分隔,Ⅲ型胶原增多。八宝丹治疗组主要为绿色细丝纤维的Ⅲ型胶原增多,Ⅰ型胶原较胆汁淤积组少。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组纤维化面积（5.56±0.61vs38.21±3.28vs20.65±2.01）,各组间差异有统计学意义,P<0.01。免疫组化结果显示TGF—β1、Smad3蛋白在空白对照组肝组织中基本无阳性表达,胆汁淤积组表达显着增强,八宝丹治疗组阳性颗粒明显减少,染色程度减轻。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:TGF—β1蛋白（0.95±0.21 vs6.52±1.01vs4.17±0.72）;Smad3 蛋白（1.05±0.52vs6.89±1.29vs4.85±0.93）,各组间差异有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR结果显示TGF—β1、Smad3 mRNA在空白对照组肝组织表达较少,胆汁淤积组表达显着增多,八宝丹治疗组表达升高。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:TGF—β1 mRNA（0.44±0.05vs1.00±0.06vs0.66±0.02）;Smad3 mRNA（0.63±0.04vs0.93±0.05vs0.79±0.03）,各组间差异有统计学意义（P<0.01）。结论1.八宝丹可以降低ANIT诱导的胆汁淤积肝病小鼠血清中肝功能（TBA、TBil、DBil、ALT、AST、ALP、GGT）、肝纤维化指标（HA、LN、PC-Ⅲ C-Ⅳ）水平,减轻肝细胞病变及坏死,对胆汁淤积症有积极的治疗作用;减少肝胶原纤维沉积,预防肝纤维化。2.八宝丹可显着抑制的TGF—β1、Smad3 mRNA及蛋白的表达,抑制TGF-β1/Smad信号通路激活,与八宝丹的护肝作用有关。3.采用组织学染色法与HE染色评价肝纤维化程度,可同时明确当前肝脏损伤情况及肝纤维化程度。对比Masson染色法,苦味酸-天狼猩红染色对胶原纤维有更好的特异性,结果明显,利于分型,是一种较好的胶原纤维染色方法,具有更大的优势。
李炎桂[9]（2019）在《貉胆生药学鉴定、成分分析及其抗炎抑菌作用的研究》文中研究说明熊胆为熊科动物黑熊Ursus thibetanus的干燥胆,是我国传统名贵动物药材,有1300多年的医药学应用历史,历代中医古籍中含熊胆的方剂多达396首。本品为不规则碎片、颗粒和粉末,黄色至深棕色,有的呈深绿色或淡红色,半透明,有玻璃样光泽,质脆,易吸潮,气清香微腥,味极苦微回甜,有清凉感。熊胆初次记载于《新修本草》,气味苦寒、无毒,入肝胆心经,具有清热、平肝、明目功能,常用于惊风抽搐、目赤肿痛、咽喉肿痛等病症。熊胆的资源极其短缺,其研究和应用受到严重障碍。因此,寻找熊胆替代品中药材新资源,开展其临床前研究具有重要的社会、经济及生态意义。考虑熊胆粉来源性质,其可能替代品首先考虑动物胆类中药。貉是皮毛动物养殖品种中最容易饲养的品种,貉养殖规模较大。打皮完成后,大部分貉胆被丢弃,能否将貉胆变废为宝代替熊胆,有待于进一步研究。本文通过来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定、红外光谱、UPLC-MS/MS等方法对貉胆进行鉴别,比较貉胆和熊胆之间的异同点;通过对比分析貉胆粉和熊胆粉活性成分的异同,对比分析貉胆粉和熊胆粉抗炎抑菌药理作用的异同,为貉胆粉是否有代替熊胆粉的可行性提供依据和参考。具体结果如下:1.本文通过来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定、IR、UPLC-MS/MS等方法对貉胆进行鉴别。发现貉胆粉极容易获取,来源于犬科动物貉。貉胆胆仁脆,半透明,表面有光泽,断面光滑,光泽明显,粉末黄色、黄绿色,有腥气。显微镜下可观察到貉胆粉末有无色或黄色的透明或半透明晶体存在,棱角分明,有明显条纹。紫外光下可观察到貉胆粉末有明亮黄绿色荧光。通过TLC实验,发现貉胆粉可在对应胆酸和鹅去氧胆酸标准品位置找到对应斑点;通过UPLC-MS/MS实验,发现貉胆粉可在对应胆酸和鹅去氧胆酸标准品位置找到胆酸的6种离子碎片以及鹅去氧胆酸的5种离子碎片,确定貉胆粉具有胆酸和鹅去氧胆酸两种成分。通过IR实验,发现貉胆粉共有图谱特征吸收峰如下:1070cm-1、1669cm-1、2924cm-1、2997cm-1,和熊胆粉红外光谱一致,说明貉胆粉和熊胆粉中物质成分的化学键以及官能团组成相似。2.本文采用紫外可见分光光度计,对貉胆粉总胆酸含量测定,发现貉胆粉中的总胆酸含量远高于熊胆粉的。以胆酸和熊去氧胆酸含量计总胆酸,貉胆粉总胆酸含量分别为39.80%、36.06%,熊胆粉总胆酸含量分别是14.00%、14.73%。3.本文采用HPLC法对貉胆粉中21种氨基酸进行测定,发现貉胆粉共有16种氨基酸,熊胆粉中共有14种氨基酸。其中貉胆粉有7种人体必需氨基酸,熊胆粉中有6种人体必需氨基酸。貉胆粉中有药用氨基酸9种,熊胆粉中有8种药用氨基酸。二者共有的14种氨基酸中,貉胆粉中天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的含量均高于熊胆粉中对应氨基酸的含量。4.本文采用ICP-MS对貉胆粉和熊胆粉中65种无机元素含量进行测定,发现貉胆粉和熊胆粉共有的64种无机元素,其中貉胆粉中有44种元素含量不低于熊胆粉中的含量。貉胆粉中不含镍元素。5.本文通过药理实验证明貉胆粉具有显着抑制二甲苯诱发的小鼠耳肿胀的作用。貉胆粉和熊胆粉实验组中,发现抗炎效果随两种胆粉药液浓度的增加而增加。高、中剂量的貉胆粉和熊胆粉抗炎作用显着,同剂量间无显着差异。浓度为0.14g/ml的貉胆粉对沙门氏菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌无明显体外抑制作用,抑菌作用达不到熊胆粉的效果。
李文楷[10]（2019）在《黄芪汤抗DDC诱导的小鼠慢性胆汁淤积性肝损伤作用及机制研究》文中研究指明研究目的:胆汁淤积是以胆汁酸分泌或排泄异常为特征的常见病症。持续胆汁淤积加重肝脏损伤,可发展为肝纤维化、肝硬化、肝癌及胆管癌。以胆汁淤积为主要表现的肝脏疾病统称为胆汁淤积性肝病,然而目前临床用于治疗胆汁淤积性肝病的药物存在不足。黄芪汤始载于《太平惠民合剂局方》的经典方,具有“补气益虚损之功”,广泛用于肝纤维化、肝硬化等慢性肝病的治疗。我们前期研究证实黄芪汤具有抗急性肝内胆汁淤积作用,但黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积的影响以及可能的作用机制尚不清楚。因此,本研究采用1,4-二氢-2,4,6-三甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯（3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydroxychollidine,DDC）诱导的慢性肝内胆汁淤积（chronic intrahepatic cholestasis,CIHC）小鼠模型,运用非靶向/靶向代谢组学、16Sr DNA测序以及分子生物学方法,研究黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积性肝损伤的作用及潜在作用机制。通过本研究可为黄芪汤的临床应用及新药开发提供理论依据,同时也为慢性胆汁淤积性肝病的防治提供新思路。研究方法:1.观察DDC诱导剂量、周期对小鼠血生化、肝脏形态学等影响,优化CIHC小鼠模型。2.采用0.025%DDC的饲料诱导CIHC小鼠模型,观察黄芪汤低剂量（2g/kg）、高剂量（4 g/kg）连续给药4周、8周对小鼠血清生化指标、肝组织形态学以及肝纤维化指标的影响,评价黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积性肝损伤的保护作用。3.采用基于超高效液相结合二维线性离子阱静电轨道阱组合式高分辨质谱（UPLC-LTQ-Orbitrap）的非靶向代谢组学的方法,研究黄芪汤给药4周及8周对慢性肝内胆汁淤积小鼠肝脏代谢轮廓的影响,筛选和鉴定差异性代谢物,分析影响的代谢通路;采用基于UPLC-MS/MS的胆汁酸靶向代谢组学方法,研究黄芪汤给药4周和8周后对CIHC小鼠血清和肝脏胆汁酸谱的影响,分析黄芪汤对CIHC小鼠胆汁酸稳态的影响。4.采用Real-time PCR和Western blot方法,检测黄芪汤给药4周和8周对CIHC小鼠胆汁酸转运体、代谢酶、核受体、膜受体、核转录因子及相关炎症因子表达的影响。采用Western Blot方法研究黄芪汤对小鼠炎症、纤维化和胆管增生通路的影响,探索黄芪汤抗慢性胆汁淤积肝损伤的效应机制。5.采用16 Sr DNA测序方法,研究慢性胆汁淤积状态下小鼠肠道菌群的变化及黄芪汤连续干预8周后对肠道菌群的影响,筛选黄芪汤影响的差异菌群,将差异菌属与药效学指标以及血清胆汁酸水平进行相关性分析,探索黄芪汤影响的与胆汁淤积相关的候选肠道菌。结果:1.0.025%DDC饲料诱导CIHC的小鼠血清ALT、AST和TBA水平升高,死亡率低,优化了CIHC小鼠模型。2.黄芪汤给药4周可降低CIHC小鼠ALT、AST、TBA水平;黄芪汤给药8周可降低CIHC小鼠血清ALT的水平。HE染色显示黄芪汤给药4周和8周可明显改善CIHC小鼠胆管细胞增生、汇管区炎症细胞浸润、肝细胞变性坏死等肝组织损伤。天狼星红染色显示黄芪汤可降低胶原沉积,黄芪汤给药8周还降低α-SMA和Collagen I的表达及羟脯胺酸水平。结果表明黄芪汤具有抗DDC诱导的慢性胆汁淤积肝损伤作用,可抑制慢性胆汁淤积所致的肝纤维化水平。3.肝脏非靶向代谢组学结果显示,在正常、模型和黄芪汤给药组之间共鉴定出25种差异代谢物,其中4周可影响13种代谢物含量,黄芪汤给药8周可影响12种代谢物,通过KEGG分析发现,这些差异代谢物主要与初级胆汁酸生物合成等通路有关;胆汁酸靶向代谢组学结果显示,黄芪汤汤给药4周或8周后可降低CIHC小鼠血清和肝脏多种胆汁酸水平,改善CIHC小鼠胆汁淤积。5.黄芪汤给药4周可诱导胆汁酸外排转运体Mrp2、Mrp3、Mrp4、Ost-α的表达,给药8周可继续诱导Mrp4的表达,抑制胆汁酸摄取转运体Ntcp的表达,并能够诱导胆汁酸代谢酶Cyp2b10的表达。黄芪汤给药4周和8周均能够显着诱导核转录因子-E2-因子（Nrf2）的表达。结果表明黄芪汤可促进肝脏胆汁酸外排、抑制胆汁酸摄取、促进胆汁酸代谢,逆转胆汁酸稳态紊乱,而这些作用可能与其诱导Nrf2有关。6.黄芪汤给药8周能够明显降低CIHC小鼠肝脏炎症因子（IL-1β、TNF-α）、细胞粘附因子（ICAM-1）、趋化因子（MIP-2、MCP-1）和生长因子TGF-β的表达,抑制NF-κB炎症通路;还可明显减轻胆管细胞特异性标志物人细胞角蛋白19（Cytokeratin 19,CK-19）的表达以及肝组织Collagen I的表达,黄芪汤抑制胆管增生可能与其抑制NF-κB/IL-6/STAT3通路有关。7.经16 Sr DNA高通量测序发现,CIHC小鼠肠道菌群多样性明显下降、菌群丰富度明显降低,黄芪汤干预8周改善了CIHC小鼠菌群多样性及丰富度;经逐级筛选发现,在OTU分类学水平中黄芪汤可影响17个差异菌种,其中Prevotellaceae＿NK3B31＿group（OTU433）、Alistipes（OTU435）、Parabacteroides（OTU430）、Gordonibacter（OTU383）和Parabacteroides＿goldsteinii（OTU255）与CIHC小鼠药效学指标呈正相关关系,黄芪汤能够明显的降低CIHC小鼠肠道炎症基因的表达,抑制肠道炎症反应。结论:1、黄芪汤具有抑制DDC诱导的小鼠慢性胆汁淤积肝损伤和减轻小鼠肝纤维化作用。2、黄芪汤对DDC诱导的CIHC小鼠可促进胆汁酸外排转运体和代谢酶的表达,抑制胆汁酸摄取转运体表达,促进肝脏胆汁酸的外排及抑制胆汁的摄取,促进胆汁酸代谢逆转胆汁酸稳态紊乱,作用可能与诱导Nrf2表达有关。3、黄芪汤可抑制抑制NF-κB炎性通路,减轻CIHC小鼠肝脏炎症反应,减轻肝细胞损伤;黄芪汤还可抑制IL-6/STAT3通路,抑制CIHC小鼠胆管增生和纤维化。4、黄芪汤可增加CIHC小鼠肠道菌群多样性及丰富度,调节肠道菌群组成,改善胆汁淤积小鼠肠道菌群紊乱,抑制肠道炎症反应,发挥抗胆汁淤积肝损伤作用。
二、猪胆汁性肝纤维化的形成机制研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪胆汁性肝纤维化的形成机制研究（论文提纲范文）
（1）基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词语注释表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肝纤维化的形成 |
| 1.2 肝纤维化的诱因 |
| 1.2.1 酒精性肝损伤 |
| 1.2.2 非酒精性脂肪性肝损伤 |
| 1.2.3 病毒性肝炎 |
| 1.3 多种病理机制参与肝纤维化进程 |
| 1.3.1 肝内巨噬细胞活化影响肝纤维化进程 |
| 1.3.2 氧化应激加速肝纤维化进程 |
| 1.3.3 肝脏炎症加速肝纤维化进程 |
| 1.4 调控肝纤维化的信号转导途径 |
| 1.4.1 FXR在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.2 LXRs在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.3 TGF-β信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.4 P2X7r-NLRP3信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.5 PI3K-Akt信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.5 .肝纤维化治疗药物研究 |
| 1.5.1 中药治疗肝纤维化 |
| 1.5.2 西药治疗肝纤维化 |
| 1.6 人参的肝保护作用 |
| 1.7 本课题研究思路 |
| 第二章 人参皂苷25-OCH_3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 动物给药方案 |
| 2.2.4 细胞培养与药物处理 |
| 2.2.5 血清生化分析 |
| 2.2.6 组织石蜡包埋 |
| 2.2.7 H&E染色 |
| 2.2.8 Masson三色胶原染色 |
| 2.2.9 Sirius Red染色 |
| 2.2.10 免疫荧光染色 |
| 2.2.11 免疫组织化学染色 |
| 2.2.12 TUNEL检测 |
| 2.2.13 蛋白印迹实验 |
| 2.2.14 RT-PCR实验分析 |
| 2.2.15 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 25-OCH_3-PPD改善TAA诱导的肝损伤 |
| 2.3.2 25-OCH_3-PPD减弱与肝星状细胞激活相关的促纤维化细胞因子的转录 |
| 2.3.3 25-OCH_3-PPD可降低肝组织中炎症因子水平 |
| 2.3.4 25-OCH_3-PPD抑制P2X7r调节NLRP3炎症小体 |
| 2.3.5 25-OCH_3-PPD调节PI3K/Akt磷酸化改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.6 25-OCH_3-PPD调节LKB1/AMPK-SIRT1信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.7 25-OCH_3-PPD促进LXRs和FXR活性改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.8 25-OCH_3-PPD阻断TAA诱导的小鼠肝细胞凋亡 |
| 2.3.9 25-OCH_3-PPD通过调节P2X7r-NLRP3抑制肝星状细胞的活化 |
| 2.3.10 25-OCH_3-PPD调节活化的肝星状细胞中LXRs与磷酸化PI3K/Akt的表达 |
| 2.3.11 抑制活化的HSCs中炎症因子表达是25-OCH_3-PPD改善肝纤维的关键 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 20S-原人参三醇通过调FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 动物给药方案 |
| 3.2.4 细胞存活率 |
| 3.2.5 细胞培养与药物处理 |
| 3.2.6 血清生化分析 |
| 3.2.7 组织石蜡包埋 |
| 3.2.8 H&E染色 |
| 3.2.9 免疫荧光染色 |
| 3.2.10 蛋白印迹实验 |
| 3.2.11 RT-PCR实验分析 |
| 3.2.12 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 M4能够抑制肝星状细胞的活性与增殖 |
| 3.3.2 M4调节活化HSC中ECM的平衡 |
| 3.3.3 M4增加活化的HSC中FXR的表达并与P2X7r抑制有关 |
| 3.3.4 M4抑制活化的HSC中促炎细胞因子的表达 |
| 3.3.5 FXR是M4阻断P2X7r进一步改善肝纤维化和炎症的重要靶点 |
| 3.3.6 M4改善TAA诱导小鼠肝损伤 |
| 3.3.7 M4对TAA诱导小鼠肝纤维化的改善作用 |
| 3.3.8 M4通过FXR/P2X7r信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 3.3.9 M4降低TAA诱导的小鼠肝纤维化肝脏中促炎细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 发表论文目录 |
| 致谢 |
（2）肝纤维化小鼠模型的建立及血清生物标志物群的筛选研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 不同类型的肝纤维化小鼠模型的建立与评价 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 药品与试剂 |
| 2.3 实验动物 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 溶液配制 |
| 3.2 动物实验方法 |
| 3.2.1 CCl_4诱导的急性肝纤维化模型 |
| 3.2.2 CCl_4诱导的慢性肝纤维化模型 |
| 3.2.3 高脂高糖饮食诱导的早期肝纤维化模型 |
| 3.2.4 高脂高糖饮食诱导的晚期肝纤维化模型 |
| 3.2.5 胆管结扎诱导胆汁淤积性肝纤维化模型(BDL模型) |
| 3.3 血清生化指标检测 |
| 3.4 病理切片分析 |
| 3.5 实时荧光定量PCR分析基因表达 |
| 3.5.1 肝组织样本处理 |
| 3.5.2 Total RNA的提取 |
| 3.5.3 逆转录(RT) |
| 3.5.4 实时荧光定量 PCR(qRT-PCR) |
| 3.6 数据统计分析 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 CCl_4诱导的急性肝纤维化模型 |
| 4.2 CCl_4诱导的慢性肝纤维化模型 |
| 4.3 高脂高糖饮食诱导的早期肝纤维化模型 |
| 4.4 高脂高糖饮食诱导的晚期肝纤维化模型 |
| 4.5 胆管结扎诱导胆汁淤积性肝纤维化模型 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 第二章 肝纤维化小鼠模型的血清代谢组学研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 药品与试剂 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 溶液配制 |
| 3.2 样本处理 |
| 3.2.1 血清样本前处理 |
| 3.2.2 质控(QC)样本前处理 |
| 3.3 仪器分析方法 |
| 3.3.1 色谱条件 |
| 3.3.2 质谱条件 |
| 3.3.3 质量轴调谐与校正和质量控制 |
| 3.4 数据处理方法 |
| 3.4.1 数据预处理 |
| 3.4.2 多元统计分析 |
| 3.4.3 物质鉴定 |
| 3.4.4 生物标志物筛选 |
| 3.4.5 代谢通路分析 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 质控(QC)样本考察 |
| 4.2 各组肝纤维化模型血清代谢轮廓分析 |
| 4.3 多元统计分析 |
| 4.4 生物标志物的鉴定与筛选 |
| 4.5 潜在肝纤维化共同代谢物和代谢通路分析 |
| 4.6 肝纤维化模型代谢标志物含量分析 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 肝纤维化临床非侵入性诊断方法研究 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（3）七叶皂苷钠通过降低4EBP1的磷酸化水平抑制梗阻性黄疸大鼠小胆管增生的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 特殊类型淤胆性肝纤维化动物模型的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）mTOR信号通路介导Omega-3多不饱和脂肪酸防治肝纤维化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝纤维化的研究进展 |
| 1.1.1 肝纤维化的简介 |
| 1.1.2 肝纤维化的细胞和分子机制 |
| 1.1.3 肝纤维化的常用治疗方法 |
| 1.2 ω-3 PUFAs的研究进展 |
| 1.2.1 ω-3PUFAs的来源与组成 |
| 1.2.2 ω-3PUFAs的生理作用 |
| 1.2.3 ω-3PUFAs与慢性疾病 |
| 1.3 CCl_4诱导肝纤维化模型的研究进展 |
| 1.3.1 CCl_4的分子结构与理化性质 |
| 1.3.2 CCl_4诱导肝纤维化的分子机制 |
| 1.4 mTOR信号通路的研究进展 |
| 1.4.1 mTOR信号通路的由来与分子组成 |
| 1.4.2 mTOR信号通路的信号转导调节机制 |
| 1.4.3 mTOR信号通路与相关疾病 |
| 1.5 本课题的研究意义及主要工作 |
| 1.6 课题来源 |
| 第二章 建立CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 数据处理 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型的初步鉴定 |
| 2.4.2 CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型的马松三色染色鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 ω-3 PUFAs饮食干预对肝纤维化的防治作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 数据处理 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 ω-3 PUFAs饮食干预显着改善纤维化肝组织损伤 |
| 3.4.2 ω-3 PUFAs饮食干预减少肝细胞凋亡并促进肝细胞增殖 |
| 3.4.3 ω-3 PUFAs饮食干预显着抑制HSCs的活化 |
| 3.4.4 ω-3 PUFAs饮食干预显着减少胶原纤维及促纤维化蛋白表达 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 ω-3 PUFAs饮食干预对mTOR信号通路的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 数据处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文与专利 |
| 致谢 |
（5）IL-35和P4HA2在自身免疫性肝病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 第一部分 IL-35 促进IgG4 相关疾病中Th9 细胞介导的IgG4 类别转换 |
| 1.1 .引言 |
| 1.2 .材料与方法 |
| 1.3 .结果 |
| 1.4 .讨论 |
| 第二部分 P4HA2 在自身免疫性肝病中调控胆管反应并促进胆汁淤积性肝纤维化的机制研究 |
| 2.1 .引言 |
| 2.2 .材料与方法 |
| 2.3 .结果 |
| 2.4 .讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文及获得的奖励 |
（6）肝苏颗粒抑制肝星状细胞的活化作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 检索方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 肝苏颗粒文献检索结果 |
| 2.2 赶黄草文献检索结果 |
| 2.3 肝苏颗粒研究病种分类 |
| 2.4 赶黄草研究病种分类 |
| 2.5 肝苏颗粒治疗肝纤维化的情况 |
| 2.6 肝苏颗粒药效物质的研究情况 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一节 赶黄草总黄酮指纹图谱及含量鉴定研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验药物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 指纹图谱实验 |
| 2.1.1 指纹图谱色谱条件 |
| 2.1.2 溶液的制备 |
| 2.2 赶黄草总黄酮含量测定方法 |
| 2.2.1 芦丁对照品溶液配制 |
| 2.2.2 供试品溶液制备 |
| 2.2.3 显色剂溶液的制备 |
| 2.2.4 测定法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 赶黄草总黄酮指纹图谱 |
| 3.2 赶黄草总黄酮含量测定结果 |
| 第二节 赶黄草总黄酮对肝星状细胞的抑制作用研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 .细胞复苏与传代 |
| 2.1.1 细胞复苏 |
| 2.1.2 细胞传代 |
| 2.2 肝星状细胞活化模型的建立 |
| 2.2.1 MTT实验 |
| 2.2.2 ELISA实验 |
| 2.3 赶黄草总黄酮作用浓度的筛选 |
| 2.4 赶黄草总黄酮对活化后的LX-2细胞活力、细胞迁移、胶原收缩、分泌功能和凋亡的测定 |
| 2.4.1 活化后LX-2细胞活力测定 |
| 2.4.2 活化后LX-2细胞迁移试验 |
| 2.4.3 活化后LX-2细胞胶原收缩试验 |
| 2.4.4 活化后LX-2 细胞分泌ColⅠ、FN含量测定 |
| 2.4.5 活化后LX-2细胞凋亡测试 |
| 2.5 赶黄草总黄酮对活化后的LX-2 相关蛋白m RNA表达的作用 |
| 2.5.1 RNAiso Plus提取总RNA |
| 2.5.2 cDNA反转录 |
| 2.5.3 PCR扩增 |
| 2.6 赶黄草总黄酮对活化后的LX-2相关蛋白表达的作用 |
| 2.6.1 样品提取 |
| 2.6.2 BCA蛋白浓度测定法测蛋白浓度 |
| 2.6.3 western blot步骤 |
| 2.7 赶黄草总黄酮对TGF-β1/Smads通路抑制后的LX-2 的作用 |
| 2.7.1 对胶原收缩的作用 |
| 2.7.2 对相关蛋白表达的作用 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 TGF-β1 诱导LX-2 细胞活化模型的浓度筛选结果 |
| 3.2 赶黄草总黄酮作用浓度的筛选结果 |
| 3.3 对TGF-β1 活化后的LX-2 细胞的活力、迁移能力、胶原收缩、分泌功能和凋亡的影响 |
| 3.3.2 对活化后LX-2细胞迁移的影响 |
| 3.3.3 对活化后LX-2细胞胶原收缩的影响 |
| 3.3.4 对活化后LX-2 细胞分泌Col I和 FN含量的影响 |
| 3.3.5 对活化LX-2细胞凋亡的影响 |
| 3.4 对TGF-β1 活化的LX-2 细胞相关蛋白表达的影响 |
| 3.4.1 对活化后LX-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 对活化后LX-2 细胞TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.5 对TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白m RNA水平的影响 |
| 3.6 对TGF-β1/Smads通路抑制后的LX-2 细胞的影响 |
| 3.6.1 对胶原收缩的作用 |
| 3.6.2 对相关蛋白表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 :综述 肝纤维化中西医研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录2 :在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（7）肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体抗肝纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的制备及评价研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对BSA致大鼠肝纤维化的保护作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 CPhGs脂质体的制备方法 |
| 1.3 空白脂质体的制备 |
| 1.4 肝纤维化大鼠模型的建立与分组 |
| 1.5 血清肝功能指标的检测 |
| 1.6 血清TGF-β、肝纤四项及肝组织HYP检测 |
| 1.7 肝组织标本大体观 |
| 1.8 肝组织病理学检测 |
| 1.9 免疫组化 |
| 1.10 聚合酶链式反应 |
| 1.11 蛋白免疫印迹 |
| 1.12 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对HSCs增殖、凋亡、周期的影响及分子机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略表 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）貉胆生药学鉴定、成分分析及其抗炎抑菌作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 动物胆类中药材鉴定的研究现状 |
| 1.1 来源(原植物、动物和矿物)鉴定 |
| 1.2 性状鉴定 |
| 1.3 显微鉴定 |
| 1.4 理化鉴定 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 动物胆类中药材化学成分研究现状 |
| 2.1 动物胆中胆汁酸类成分 |
| 2.2 动物胆中氨基酸类成分 |
| 2.3 动物胆中胆色素类成分 |
| 2.4 动物胆中无机元素 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 动物胆药理作用研究现状 |
| 3.1 动物胆类中药材药理作用研究现状 |
| 3.2 动物胆中有效成分药理作用研究现状 |
| 3.3 讨论 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 貉胆的生药学鉴定研究 |
| 1.1 实验材料与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 貉胆粉和熊胆粉中总胆酸含量比较 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 貉胆粉和熊胆粉中氨基酸成分比较 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 貉胆粉和熊胆粉中无机元素含量比较 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 貉胆粉和熊胆粉的抗炎抑菌作用比较 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）黄芪汤抗DDC诱导的小鼠慢性胆汁淤积性肝损伤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 DDC诱导的小鼠慢性胆汁淤积模型优化 |
| 1.材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药物及试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 含DDC饲料制备和DDC橄榄油溶液的配置 |
| 2.2 动物实验及样本采集 |
| 2.3 血生化指标检测(ALT、AST和TBA) |
| 2.4 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 0.1%DDC饲料喂养对实验小鼠模型进程的影响 |
| 3.2 DDC剂量和给药方法对实验小鼠模型进程的影响 |
| 4.讨论 |
| 第二章 黄芪汤抗DDC诱导的小鼠慢性胆汁淤积药效学评价 |
| 1.材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 引物 |
| 1.5 仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 黄芪汤的制备与质量控制 |
| 2.2 药物配置 |
| 2.3 动物分组及实验 |
| 2.4 肝功能指标检测 |
| 2.5 肝病理检测 |
| 2.6 肝脏羟脯胺酸含量测定 |
| 2.7 Real-time PCR检测小鼠肝脏纤维化相关基因表达 |
| 2.8 免疫组化分析纤维化相关蛋白的表达 |
| 2.9 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 黄芪汤的质量控制 |
| 3.2 黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积小鼠血生化指标的影响 |
| 3.3 黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积小鼠肝脏形态学的影响 |
| 3.4 黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积小鼠肝纤维化的影响 |
| 3.5 黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积小鼠胆管增生的影响 |
| 4.讨论 |
| 第三章 黄芪汤抗DDC诱导的慢性胆汁淤积的代谢组学研究 |
| 第一节 黄芪汤抗慢性胆汁淤积的非靶向代谢组学分析 |
| 1.材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 样品 |
| 2.方法 |
| 2.1 样品预处理和制备 |
| 2.2 色谱-质谱条件 |
| 2.3 数据处理分析 |
| 2.4 方法学考察 |
| 3.结果 |
| 3.1 小鼠肝组织代谢轮廓与变量提取 |
| 3.2 多变量统计分析与方法学评价 |
| 3.3 潜在代谢物的筛选与鉴定 |
| 3.4 代谢通路分析 |
| 4.讨论 |
| 第二节 黄芪汤抗慢性胆汁淤积的胆汁酸靶向代谢组学分析 |
| 1.材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 样品 |
| 2.方法 |
| 2.1 胆汁酸标准品的配置 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 液相-质谱条件 |
| 2.4 方法准确度考察 |
| 2.5 数据处理 |
| 2.6 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 多变量统计分析 |
| 3.2 黄芪汤对肝内胆汁淤积小鼠血清中胆汁酸谱的影响 |
| 3.3 黄芪汤对肝内胆汁淤积小鼠肝脏中胆汁酸谱的影响 |
| 4.讨论 |
| 第四章 黄芪汤抗DDC诱导的慢性胆汁淤积的效应机制研究 |
| 第一节 黄芪汤对DDC诱导的胆汁淤积小鼠胆汁酸转运体、代谢酶、相关受体以及核转录因子表达的影响 |
| 1.材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 样品 |
| 2.方法 |
| 2.1 Real-time PCR |
| 2.2 western blot |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 黄芪汤对DDC诱导胆汁淤积小鼠肝脏核受体、膜受体及核转录因子-E2-因子的影响 |
| 3.2 黄芪汤对DDC诱导胆汁淤积小鼠肝脏胆汁酸转运体表达的影响 |
| 3.3 黄芪汤对DDC胆汁淤积小鼠胆汁酸代谢酶表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 第二节 黄芪汤对DDC诱导胆汁淤积肝脏炎症反应和纤维化通路的影响 |
| 1.材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 样品 |
| 2.方法 |
| 2.1 RT-PCR |
| 2.2 Western blot |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 黄芪汤对模型小鼠肝脏炎症和纤维化相关因子表达的影响 |
| 3.2 黄芪汤对慢性胆汁淤积小鼠NF-κB/IL-6/Stat-3 通路的影响 |
| 4.讨论 |
| 第五章 黄芪汤改善DDC诱导的慢性胆汁淤积小鼠肠道菌群紊乱和肠道炎症反应的研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 样品 |
| 2.方法 |
| 2.1 粪便DNA抽提、纯化与PCR扩增 |
| 2.2 粪便PCR样品纯化和Illumina Miseq测序 |
| 2.3 数据处理 |
| 2.4 肠道组织PCR测定 |
| 2.5 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 粪便样品稀释曲线、样品聚类分析及主坐标分析 |
| 3.2 黄芪汤对DDC诱导胆汁淤积小鼠肠道菌群多样性的影响 |
| 3.3 黄芪汤对DDC诱导胆汁淤积小鼠肠道微生态菌群结构的影响 |
| 3.4 肠道菌群变化与环境因子关联分析 |
| 3.5 黄芪汤对DDC诱导胆汁淤积小鼠肠道紧密连接蛋白和炎症相关基因表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:文献综述 代谢组学在胆汁淤积性肝病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅱ:在校期间发表论文及参加会议 |
四、猪胆汁性肝纤维化的形成机制研究（论文参考文献）
- [1]基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究[D]. 宋健. 延边大学, 2021(02)
- [2]肝纤维化小鼠模型的建立及血清生物标志物群的筛选研究[D]. 程龙浩. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]七叶皂苷钠通过降低4EBP1的磷酸化水平抑制梗阻性黄疸大鼠小胆管增生的研究[D]. 汪先凯. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]mTOR信号通路介导Omega-3多不饱和脂肪酸防治肝纤维化的研究[D]. 王荣华. 广东工业大学, 2020
- [5]IL-35和P4HA2在自身免疫性肝病中的作用及机制研究[D]. 张珺. 上海交通大学, 2020(01)
- [6]肝苏颗粒抑制肝星状细胞的活化作用及机制研究[D]. 余蕾. 成都中医药大学, 2020(02)
- [7]肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体抗肝纤维化的作用及机制研究[D]. 张石蕾. 新疆医科大学, 2020(07)
- [8]八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及机制研究[D]. 谢诗怡. 南方医科大学, 2020(01)
- [9]貉胆生药学鉴定、成分分析及其抗炎抑菌作用的研究[D]. 李炎桂. 吉林农业大学, 2019(03)
- [10]黄芪汤抗DDC诱导的小鼠慢性胆汁淤积性肝损伤作用及机制研究[D]. 李文楷. 上海中医药大学, 2019(03)