一、异种器官移植用血管内皮细胞特异表达人CD59重组基因的构建（论文文献综述）
王明[1]（2018）在《牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰》文中研究说明外源基因在受体细胞或个体中持续稳定表达对于基础研究和转基因应用具有重要意义。传统转基因技术一般通过随机插入的方式将外源基因整合到基因组中,这种方法虽然简单直接,却存在着固有的缺陷。其整合位点和拷贝数的不确定性,往往使外源基因在动物个体中表达不稳定或表达差异过人,严重限制了转基因动物的应用与发展。近年来,基于同源重组的定点整合技术的发展,使外源基因可以以单拷贝形式整合至预定的基因组位点上，有效克服了传统转基因技术随机整合的缺陷。可是这个位点我们如何选择,才能保证外源基因良性插入并高效表达,并没有得到解决。在此基础上,科研人员提出“安全位点”定点转基因技术,该技术是指外源基因以单拷贝的形式定点插入到动物受体基因组中的“安全位点”,此位点既可以保证外源基因持续稳定表达,同时对动物自身基因组没有影响,保证受体动物的安全。Rosa26位点是动物基因组中应用最为广泛的“安全位点”,最早由 Friedrich和Soriano在小鼠中发现。对Rosa26的研究发现,该位点可以支持外源基因在胚胎发育各时期及个体所有组织中广谱性表达,且对胚胎发育、动物个体没有不良影响。目前,利用Rosa26位点建立的定点修饰小鼠模型已有几百种,在基因功能研究、疾病模型研究、药物开发等领域发挥着重要作用。继小鼠Rosa26发现后,人、大鼠、猪、家兔、羊的Rosa26位点先后被确定,通过研究发现,该位点在各物种中具有高度的同源性、保守性,均支持外源基因持续稳定高表达。牛,作为一种重要的农业经济动物,对其进行遗传改造,培育更加安全、具有更高牛乳品质、具有抗逆抗病等优良性状的品系是当前研究的热点。鉴定和定点修饰牛的安全位点Rosa26,不仅可以有效解决常规转基因修饰带来的诸多问题,更可以为制备外源基因稳定高表达的转基因大动物品系提供有效途径。本研究通过多重序列比对的方式,利用小鼠、大鼠、猪和人的Rosa26跨物种保守序列搜索牛的基因组数据库,在牛22号染色体上定位到一段同源性高达75%的序列,该序列区段上下游基因与已报道物种Rosa26 上下游基因一致。我们初步认为牛22号染色体上定位的序列为牛的Rosa26（bovine Rosa26,bRosa26）。3’RACE、5’RACE实验检测到该位点由两个外显子组成,编码一个转录本。RT-PCR、Q-PCR实验证实bRosa26在牛的各组织中广泛表达。将bRosa26启动子序列克隆至至绿色荧光蛋白表达载体上,瞬时转染多个组织来源的细胞系,均检测到绿色荧光蛋白的表达,在细胞水平上证实bRosa26启动子具有启动外源基因表达的活性。结合TALENs技术,本研究高效的将Cre重组酶介导的报告基因重组系统定点整合在bRosa26位点上,并利用TAT-Cre蛋白在细胞中实现了高效的Cre-loxP介导的重组反应。利用体细胞核移植技术,本研究成功制备bRosa26基因打靶胎儿和牛。RT-PCR、Q-PCR、Western Blot等实验证实,外源基因EGFP在胚胎发育各时期、个体各组织中稳定广泛表达,且其表达对bRosa26上下游600 Kb表达框内所有基因的表达未造成显着干扰,在个体水平上证实bRosa26位点是一个支持外源丛因广谱性表达的安全位点。本研究利用bRosa26基因打靶胎儿成功建立了成纤维细胞系,一对异源loxP位点的引入,可以基于重组酶介导的盒式交换（Recombination-mediated cassette exchange,RMCE）实现基因替换。利用此成纤维细胞系,我们高效地将绿色荧光蛋白EGFP替换为红色荧光蛋白tdDIMER,证实bRosa26位点可以介导高效的RMCE实现基因替换。本研究将三种广谱型启动子启动EGFP表达的打靶载体高效地定点整合在bRosa26位点上，在细胞水平上检测到EGFP均能持续稳定表达,且其表达对bRosa26上下游邻近基因的表达未造成显着干扰。其中CAG启动子启动EGFP的表达活性高于EF1a、PGK以及bRosa26内源启动子,证实bRosa26位点支持外源启动子启动外源基因的友好表达。本研究首次在牛的基因组中寻找并鉴定了安全位点Rosa26,结合TALENs技术成功对该位点实现了高效地定点修饰。结合穿膜肽TAT-Cre蛋白成功在牛细胞中实现了高效地Cre-loxP介导的重组反应。结合体细胞核移植技术成功制备了稳定表达EGFP胎儿成纤维细胞系及动物个体。同时,在建立的基于RMCE的基因替换成纤维细胞系中,实现了红色荧光蛋白的替换,这为后期任意基因通过RMCE技术定点整合至bRosa26,实现任意基因在牛中持续稳定高表达奠定了良好的基础。本研究克服了传统转基因技术的诸多弊端,极大地提高了外源基因在牛基因组中的整合效率,为在牛基因组中实现安全、精确的基因修饰建立了良好的工具,对基因定点修饰牛在产业化、商业化中的应用具有重要的推动意义。
陈海德[2]（2017）在《GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究》文中指出(1)GGTA1敲除猪的研究面临器官移植供体短缺的现状,异种移植是一种可行的替代方案。大量研究证明猪是合适的异种移植供体。使用猪进行异种移植仍然需要克服许多免疫排斥障碍,包括超急性免疫排斥反应（HAR）,急性体液异种排斥反应（AHXR）,急性细胞排斥反应（ACR）,凝血功能异常,慢性排斥反应（CR）和炎症反应等。基于相关致病机理的研究,研究人员认为制备基因修饰猪是克服异种移植免疫排斥障碍的有效措施。目前功能正常的猪多能干细胞系仍然没有建立,而基于同源重组进行的基因修饰在猪体细胞中效率较低,严重制约了相关研究的进展。最近几年出现了多种高效的基因定点修饰工具,包括锌指核酶（ZFN）,转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）以及CRISPR/Cas9。这些技术被成功地应用于各种模式生物中,我们也建立了基于ZFN和TALEN的猪基因修饰系统。我们首先使用ZFN制备GGTA1KO（GTKO）猪,然后在GTKO猪细胞中使用TALEN对猪白细胞抗原（SLAs）相关基因进行修饰。GGTA1参与形成的Ga1是引起HAR的主要异种抗原。在进化过程中,GGTA1在人类和旧世界猴中失去功能,导致他们的细胞表面没有Ga1抗原,所以他们血液中存在大量靶向Ga1抗原的天然抗体。为了克服HAR障碍,研究人员在猪体细胞上通过同源重组修饰GGTA1并结合体细胞核移植技术制备GTKO猪,通过异种移植实验表明GTKO猪可以显着抑制HAR的发生。但是这种技术不仅效率很低,而且会引入外源的抗药基因,无法满足后续大量基因修饰的需求。我们将靶向GGTA1编码区序列的ZFN质粒和抗药质粒通过瞬转手段导入胎猪成纤维细胞中,经过药物筛选获得了18个单拷贝敲除和4个双拷贝敲除的细胞克隆,效率分别为23.4%和5.2%。随后我们将获得的双拷贝敲除的细胞作为核供体进行体细胞核移植,产生克隆猪。经鉴定,一共获得3头GTKO猪。同时我们利用克隆胎儿建立了一个GTKO胎猪成纤维细胞系。通过细胞表面标记鉴定证明GTKO猪的细胞膜上Ga1抗原被完全清除。通过杀伤实验证明GTKO猪的细胞可以在与人血清共培养时不受抗体补体介导的免疫攻击。在GTKO猪的基础上,我们通过TALEN技术修饰猪的SLAs,将其中的部分基因替换为人类白细胞抗原（HLAs）中的部分基因。我们设计并验证了靶向SLA-1和-2的TALEN。同时我们设计并构建了相关的KI载体进行基因替换实验。通过PCR验证HLA-A基因成功替代SLA-1,并能在猪细胞中表达。这一策略在异种移植中的效果仍需要使用实验猪进行进一步的异种移植验证。（2）低免疫原性人多能干细胞的研究人多能干细胞（hPSCs）具有自我更新能力,并可以在一定条件下分化为机体内所有的细胞类型。所以研究人员尝试将hPSCs分化为各种组织细胞,用于移植替换病人身上受损的组织细胞。在人类同种异体组织器官移植的过程中,供受体细胞表面的HLAs不兼容会导致免疫排斥反应。HLAs分为HLA Ⅰ和HLA Ⅱ:CD8+T细胞识别HLA Ⅰ,参与直接靶细胞杀伤作用;CD4+T细胞识别HLA Ⅱ,分泌大量细胞因子参与调控免疫反应。我们实验室的工作重点在于使用定点基因修饰的方法降低hPSCs的免疫原性,以满足其临床使用的要求。我们实验室之前通过对B2M的KO已经建立了 HLA Ⅰ缺陷的hPSCs,证明了其免疫原性的降低,同时hPSCs的多能性和自我更新能力都没有显着的变化。在本研究中我们使用TALEN对HLA Ⅱ的关键调控基因CIITA进行KO,从而降低hPSCs及其分化获得的细胞中的HLA Ⅱ相关基因的表达。CIITA-/-hPSCs在自我更新和分化能力方面与WT hPSCs无明显差异。将CIITA-/-hPSCs分化为树突状细胞（DCs）后,CD83和CD86等表面蛋白标记物正常表达,但其结构型HLA Ⅱ表达显着下降。将CIITA-/-hPSCs分化为成纤维细胞后,在IFN-γ的刺激下诱导型HLA Ⅱ表达显着下降。将分化获得的CIITA--成纤维细胞与CD4+T细胞共培养,CD4+T的活化减弱。这些结果说明CIITA-/-hPSCs分化获得的组织细胞可能降低CD4+T细胞介导的免疫排斥反应。我们的研究将有利于推动hPSCs的临床应用,尤其是将hPSCs分化为结构型高表达HLAII的组织细胞进行移植替换,比如DCs和T细胞等。
霍海龙[3]（2016）在《版纳微型猪近交系5个潜在相关猪→人异种器官移植免疫排斥反应基因的克隆、表达及功能生物信息学分析》文中进行了进一步梳理当前器官移植治疗疾病面临的最大问题是供体器官严重缺乏,器官衰竭患者多因无法及时得到供体器官而死亡。异种器官移植已成为目前科学界和医学界公认的解决供体器官短缺的有效途径,猪已被认为是最理想的非人灵长类异种器官移植的供体。猪→人异种器官移植的主要屏障是超急性排斥反应（HAR）,α1,3半乳糖（α1,3Gal）是引起HAR的主要抗原。临床上将清除了 α1,3Gal的猪器官移植给狒狒,仍会发生排斥反应,提示在猪体内还存在其他非α1,3Gal异种抗原。为了早日实现猪→人异种器官移植的临床应用,广大医学和科研工作者把目光转向了非α1,3Gal基因的挖掘和功能研究。本试验以有望成为猪→人异种器官移植良好供体的版纳微型猪近交系（BMI）为研究材料,以与猪→人异种器官移植免疫排斥反应潜在相关的CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALMT2等5个非α1,3Gal基因为候选基因,从分子、蛋白、细胞水平同时入手,验证这5个基因与猪→人异种器官移植免疫排斥反应的相关性。首先从mRNA水平分离并鉴定这些基因的完全CDS编码区序列,并进行免疫相关多组织转录表达水平的qPCR检测分析,获得其在mRNA水平的表达情况;然后采用Western Blot方法进一步对相同组织进行验证,获得其在蛋白水平的表达情况;构建目的基因和绿色荧光报告基因GFP的融合表达载体,转染示踪进行细胞水平的验证;并对相关蛋白质进行基本信息、特征信息、结构域、功能位点、高级结构等功能生物信息学分析。结果表明猪CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因的全长CDS序列分别为1734 bp、1590 bp、894 bp、861 bp、1509 bp,并提交到GenBank获得了认证。qPCR分析和Western Blot验证表明CMAH mRNA和OXSR1 mRNA均在颌下腺组织中表达最高;CD80 mRNA在脾组织中表达最高;ASGR1 mRNA在肝脏中特异表达,在其它组织中不表达;B4GALNT2 mRNA在扁桃体中表达最高;揭示同一基因在不同组织和不同基因在相同组织中差异表达的现象,也说明基因主要在哪些组织发挥重要的功能,为下一步深入研究提供了线索,这些重要组织将是我们后续研究该基因功能以及进行基因敲除和基因修饰研究的靶组织。构建了CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因和绿色荧光蛋白AcGFP1真核融合表达载体,并将其转染猪肾上皮PK15细胞进行瞬时表达,均检测到了绿色荧光表达。在此基础上为了研究这些猪的基因与人免疫排斥反应的相关性,将这些真核融合表达载体转染人脐静脉内皮细胞HUVEC进行表达,均检测到了稳定表达的绿色荧光,表明CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因与猪→人异种器官免疫排斥反应相关。为进一步研究这些基因在猪→人异种移植排斥反应中的分子机制奠定了基础。为深入了解基因编码的蛋白质的相关功能性质,我们对相应蛋白质进行了功能生物信息学分析,包括分析其氨基酸组成、分子式、分子量、等电点、消光系数、半衰期、原子组成、不稳定系数、脂肪指数、亲水系数等蛋白质基本信息;疏水性、跨膜结构、卷曲螺旋、信号肽、固有无序性、亮氨酸富集的核输出信号、亚细胞定位等蛋白质的特征信息;结构域和功能位点（磷酸化和糖基化）;二级结构和三级结构等。这些蛋白质的基本信息、特征信息、结构域、功能位点以及高级结构的生物信息学分析为CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 5个蛋白质的进一步功能研究和验证提供了理论依据,也为下一步进行猪→人异种器官免疫排斥反应相关基因的联合敲除和基因修饰提供了参考数据。本研究填补了猪→人异种器官移植非超急性排斥反应α1,3Gal基因研究之外的空白,本研究结果可为版纳微型猪近交系猪→人异种器官移植利用提供基础数据资料,同时也为促进版纳微型猪近交系的开发和利用提供科学依据。
李和刚[4]（2011）在《猪IκBα打靶载体构建暨NFκB p65特征分析及p65RHD时空特异表达》文中提出目前,人类同种器官移植面临着供体器官短缺的问题。异种移植被认为是解决该问题的有效途径之一。猪与人在解剖学、生理学和生化指标等方面与人极其相似,使其成为人类异种移植供体来源的理想动物。然而,在实现异种移植之前,必须解决物种间的免疫屏障问题。异种移植最大障碍在于体液免疫,表现为超急性排斥反应和延缓性排斥反应。α1,3-GT基因敲除猪研制成功后,超急性排斥反应已基本得到克服,延缓性排斥反应作为异种器官移植的另一道必须克服的障碍已成为全世界异种移植研究的热点。转录因子NF-κB在延缓性排斥反应中发挥着重要的作用。IκBα是NF-κB的重要抑制因子。然而,IκBα可在炎性介质的刺激下被磷酸化而降解,从而导致NF-κB的激活。于是研究者找到了IκBα的一个突变体,可有效抵抗磷酸化。由于NF-κB信号转导在脊椎动物的生长和发育过程中起着关键的作用,在供体动物的胚胎时期就将IκBα突变体取代其野生型是不可行的。因此,针对猪IκBα的条件打靶是一个较好的选择。本研究的最终目的就是实现IκBα野生型及突变型在基因组水平的可控表达。本研究成功构建了一系列猪IκBα打靶载体,其中包括条件性打靶载体pFPC-C、pLHG-5、pLHG-6和普通敲除载体pLHG-4。本研究的最终目的就是实现IκBα野生型及突变型在基因组水平的可控表达。对中靶PIEC（猪血管内皮细胞系）的表型分析在一定程度上可作为预测个体水平变化的一个良好模型。具体研究结果如下：1.5’短臂的扩增及克隆以猪PIEC基因组DNA为模板,在猪IκBα基因转录起始位点上游设计引物,扩增并克隆到2.0kb片段。2.3’长臂的扩增及克隆以猪PIEC基因组DNA为模板,在猪IκBα基因第二外显子下游设计引物,扩增并克隆到6.0kb片段。3.猪IκBα基因定点诱变首先采用Stratagene公司单点突变试剂盒将猪IκBα基因32位丝氨酸位点突变为丙氨酸,接着试图在36位引入突变但未成功,最后改用重叠延伸PCR对36位进行突变。结果表明,两种突变方法结合使用,成功地将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸。4. IκBα野生型及突变型真核表达载体构建及真核表达实验以pcDNA3.1（+）为骨架构建IκBα野生型及突变型真核表达载体pcDNA3.1-Loxp-IκBα、pcDNA3.1-Loxp-mIκBα,并转染猪肾细胞PK15, RT-PCR检测结果表明上述两个表达框是有效的。5.含有突变型和野生型IκBαcDNA序列的Cre/Loxp系统构建及验证将IκBα完全表达框CMV-Loxp-IκBα-pA、正负筛选融合基因Tkneo、mIκBα非表达无启动子结构Loxp-mIκBα-pA顺序连接,获得含有突变型和野生型IκBαcDNA序列的Cre/Loxp系统,并在PIEC细胞中验证了该系统的有效性。6. pFPC-C条件性打靶载体构建将含有突变型和野生型IκBαcDNA序列的Cre/Loxp系统、5’短臂、3’长臂构建到打靶用载体pFPC-1中,获得IκBα时空特异性条件打靶载体pFPC-5’arm-CMV-Loxp-IκBα-pA-TKneo-Loxp-mIκBα-pA-3’arm （pFPC-C）。7.含内源启动子的条件打靶载体pLHG-5的构建将pFPC-C载体中的5’短臂和CMV启动子用IκBα内源启动子片段取代,即可获得含内源启动子的条件打靶载体pFPC-ITMFF-LA16-Swa I （pLHG-5）.8.单独锚定筛选标记基因的条件打靶载体pLHG-6的构建经多轮亚克隆实验,在筛选标记基因Tkneo两端添加Flp重组酶识别位点以单独锚定该基因,获得条件打靶载体pFPC-ITM-LA16 （pLHG-6）。9.普通打靶载体pLHG-4的构建设计引物对SA6-F、SA6-R,以PIEC基因组DNA为模板,扩增1833bp的SA6片段。合成两条单链寡核苷酸SceF、SceR,经高温变性、低温退火,得25bp左右的短双链DNA即Sce短片段。pFPC-C载体双酶切插入SA6片段,得pLHG-1. pUC-2N载体双酶切插入Sce片段,得pUC-2-Sce （pUC-2S）; pUC-2S载体双酶切插入EIN片段,得pUC-EIN。pUC-EIN载体双酶切得EIN片段,插入pLHG-1载体,得猪IκBα敲除载体pFPC-SA6-EIN-LA16 （pLHG-4）。10. pLHG-4基因打靶试验使用Amaxa核转仪及配套的哺乳动物内皮细胞核转试剂盒转染PIEC细胞。经比较选定效率最高的程序（T-023）进行pLHG-4转染实验。1mg/ml G418加压筛选10-14天提取基因组DNA,使用引物对PCRF3、PCRR3进行检测。本实验共获得G418抗性克隆1983个,所有克隆均呈现EGFP高表达。但未检测到PCR阳性克隆。近二十多年以来,NF-κB一直是诱导性转录因子的标准。NF-κB在免疫系统中发挥着种间高度保守的重要作用,它调控着针对各种病原的应答,即处于广阔网络交汇点的诱导因子和效应因子的表达。在NF-κB家族中,p65亚基至关重要。在含有TAD（转录激活区域）的三个亚基中,p65是唯一一个全身性表达的。p65亚基的缺失导致因肝变性所致胚胎死亡；相应的,缺失其它四个亚基中任何一个都仅仅导致免疫缺陷,并未表现出任何发育障碍。为了治疗炎症、自体免疫和移植排斥,有必要在维持p65抗凋亡功能的前提下抑制p65的活性。而p65RHD是一个较好的选择,它是将p65蛋白的DNA结合、核定位、二聚体化及结合IkB蛋白的区域（即Rel同源区）保留,将其它区域（主要是转录激活区域TAD）截去,从而获得一个截短型蛋白。过表达人P65RHD可抑制内皮细胞中促炎症基因的表达而不增加其对凋亡的敏感度。而在诸如炎症、慢性关节炎、同种和异种移植的病理条件下,内皮细胞的激活是一个常见现象。本研究对猪NFκB p65进行了全面的特征分析,并实现了猪p65RHD在猪血管内皮细胞系PIEC中的四环素可控表达。具体研究结果如下：1.pp65基因组结构分析将已公布的猪p65 CDS序列与猪HTG基因组DNA序列进行比对,推导出猪p65的外显子和内含子区域。pp65基因共有11个外显子,10个内含子。p65基因结构在人、小鼠和猪中是高度保守的。2.pp65的克隆、表达载体构建及序列分析分三段扩增到1704bp片段,即为pp65 CDS全长,双酶切克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1（+）中,得到pp65过表达载体pcDNA3.1（+）-pp65。猪、牛、人、小鼠间多序列比对鉴定到pp65的三个主要功能域：Rel同源区（RHD）、转录激活区1（TAD1）和转录激活区2（TAD2）。另外,系统进化分析显示pp65与牛进化关系最接近。3.猪NFκB p65亚基的表达及特征分析将表达载体pcDNA3.1（+）-pp65及荧光素酶报告基因载体分别共转染PIEC、3D4/21和PFF细胞。pp65的过表达明显激活（P<0.01）报告基因载体pNF-κB-Luc的荧光素酶活性。使用抗人、大鼠和小鼠p65蛋白的商业化单克隆抗体来检测pp65及pp65RHD。结果表明,PIEC、3D4/21、PFF及PAEC四种细胞的pp65均主要定位于细胞质,在有效转入pp65表达质粒的PIEC、3D4/21、PFF细胞中可检测到强烈的pp65过表达,PIEC的pp65RHD过表达也是大部分位于细胞质中。4. pp65RHD的过表达抑制NFκB将含有pp65 cDNA5’末端996bp片段的哺乳动物表达载体pIRES2-EGFP-pp65RHD和荧光素酶报告基因载体共转染PIEC、3D4/21和PFF细胞。报告载体pNF-KB-Luc的荧光素酶活性被pp65RHD的过表达显着抑制（P<0.01）。将pIRES2-EGFP-pp65RHD、pcDNA3.1 （+）-pp65和荧光素酶报告基因载体共转染PIEC、3D4/21和PFF细胞。相对于只转染pp65的细胞,共转染pp65和pp65RHD的细胞中报告载体pNF-KB-Luc的荧光素酶活性急剧下降（P<0.05）,表明pp65过表达所致NFκB激活受到pp65RHD的强烈抑制。5.猪pp65表达谱分析实时定量PCR分析表明,猪p65 mRNA水平的表达在不同组织中有明显的差别,肺、脾、肝和小肠中表达较高,肾、胃中表达量中等,心、背最长肌和腿肌中表达较低。6.SNP检测及关联分析经序列比对,检测到30多个多态位点。只选取位于第七外显子的同义SNP6382（T/C） （BglⅠ）和位于第八内含子7227bp处的8碱基对插入/缺失突变（NcoⅠ）作进一步研究。关联分析表明SNP BglⅠ与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平（PRRSV-AB）（0日龄P=0.0116；17日龄P=0.0021）、猪瘟病毒抗体阻断率（CSFV-AB）（0日龄P=0.0028；17日龄P=0.0146）、伪狂犬病毒抗体水平（PRV-AB）（0日龄P=0.0282；32日龄P=0.0401）显着相关。7. pTet-ICAM载体构建经重叠延伸PCR获得2.4kb的ICAM-2启动子全长,取代pTet-on advanced载体中的CMV启动子,获得内皮细胞特异性表达rtTA的载体pTet-ICAM。8. pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性表达及对NFκB的影响将pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性表达系统中的质粒载体pTet-ICAM、pTRE-pp65RHD-IRES2-EGFP瞬时共转染PIEC细胞,24h后添加Dox诱导,再过24h在荧光显微镜下观察。结果表明,该系统表现出基底表达低、诱导表达明显的特点,初步说明该可控表达系统是切实有效的。经G418、潮霉素B （HygB）连续两次稳定筛选,依次将两个载体pTet-ICAM、pTRE-p65RHD-IRES2-EGFP整合到PIEC细胞的基因组中,从而实现pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性稳定表达。选取其中较为典型的基底表达较低、诱导表达较高的7个单克隆27-6号、27-16号、27-19号、27-20号、27-21号、27-32号及27-34号用于后续试验。利用免疫组织化学技术检测27-20号、27-21号克隆pp65RHD蛋白水平的诱导表达。两个克隆的表达情况差异较大,27-21号单克隆p65RHD表达量较为均匀适中,27-20号单克隆pp65RHD表达呈集落状分布,局部表达很强且集中在细胞核中。使用NFκB报告载体法对本实验所得7个单克隆进行了检测。结果表明,pp65RHD的诱导表达不能抑制pp65过表达所致NFκB信号通路的激活,也不能抑制NFκB的基底活性。
张名媛,蒋钦杨,范晶,陈宝剑,覃永长,吴丹,杨柳,郭亚芬,兰干球,蒋和生[5]（2010）在《异种器官移植克服HAR的研究进展》文中提出异种器官移植是解决供体器官严重短缺的一种途径,而异种移植成功的最大障碍是异种免疫排斥反应,其中最严重的是超急性排斥反应（HAR）。本文就异种器官移植HAR的发生机理、克服免疫屏障的方法和发展趋势以及小型猪作为供体的研究等方面国内外的研究进展进行综述和讨论。
郭战军[6]（2010）在《以纳米材料作载体改进精子介导法建立异种移植供体模型的研究》文中研究表明精子介导基因转移（Sperm-mediated gene transfer, SMGT）是目前最简单的转基因动物生产技术,但该方法重复性差、实验结果不稳定。本研究对SMGT的几个关键环节进行了研究,以期建立稳定、高效的技术体系,同时利用该技术体系制备hHT/hDAF双基因转移小鼠模型,为进一步开展异种器官移植奠定基础。第一部分基于树枝状聚合物建立小鼠精子介导基因转移技术的研究目的研究外源DNA与精子相互作用后的定位及内化率是精子载体法制备转基因动物的关键环节,为建立小鼠精子介导基因转移技术奠定基础。方法以标记的DNA片段为示踪材料,就精子与树枝状聚合物（Dendrimers）共孵育后同外源DNA相互作用的基本特征及影响因素进行研究。结果小鼠精子同树枝状聚合物共孵育后可自发性结合外源DNA,外源DNA最初结合于顶体后区质膜外表面,随后部分内化进入细胞内。精子对外源DNA的结合和内化能力随供体的不同而差异明显,在35只小鼠中,结合率（DNase Ⅰ消化前）波动于4.6%～62.4%,内化率（DNase Ⅰ消化后）波动于2.1%-53.8%,个体间差异显着（P<0.01）。对于同一供体的精子而言,阻止DNA结合的最主要因素是精浆,与射出的原精液相比,洗涤后精子的结合率和内化率分别提高了3倍和5倍；其次精子获能也将导致结合率和内化率降低（P<0.01）。死精子不能完成外源DNA的内化过程,但反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率,而且阳性率与动物个体无关。上述结果提示,筛选合适的精子供体,采用优化的转染处理方法是提高精子载体方法效率的前提和保证。第二部分EGTA等影响SMGT效率的研究目的研究EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对精子活力和体外存活时间、精子顶体反应发生率、精子结合外源DNA能力以及内化DNA降解的影响,提高SMGT效率。方法以DIG标记DNA,以免疫组织化学法研究EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对SMGT效率的影响。结果核酶抑制剂ATA提高精子活力和体外存活时间,增强精子结合外源DNA能力,但ATA添加组精子结合的外源DNA在细胞内几乎全部被降解；EGTA和蛋白酶抑制剂PMSF对内化进入精细胞的外源DNA有良好的保护作用,然而二者阻止精子发生顶体反应；此外,PMSF提高精子对外源DNA结合能力,增强精子运动活性,而EGTA与此正好相反；同时在培养液中添加EGTA和ATA,精子活力、顶体反应发生率和外源DNA结合能力都较EGTA单独加入组有所改善,而且内化DNA的降解效应也被明显抑制。对于精子介导基因转移过程中,在培养液中同时加入EGTA和ATA,既有利于外源DNA结合以及内化DNA的完整性,又保证了精子的受精能力。第三部分hHT/GFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达目的构建α2-1,2岩藻糖苷转移酶（hHT）基因与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）基因融合表达载体pEGFP-C1-hHT,并在小鼠成纤维细胞表达,验证其有效性。方法提取人总RNA,反转录后以cDNA为模板PCR扩增hHHT基因,连接至pMD18-T载体后进行hindⅢ kpn Ⅰ双酶切,回收酶切片段后插入pEGFP-C1,构建融合表达载体后转染小成纤维细胞。结果成功克隆了hHT基因并构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48h后观察到GFP阳性细胞。对GFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot,检测hHHT基因的整合及表达情况。PCR结果表明hHT基因整合入小鼠基因组。Western blot检测到了hHT基因的表达。上述结果表明,成功构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT,并可应用于进一步转基因研究。第四部分hDAF/RFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达目的构建衰变加速因子（hDAF）基因与红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）基因融合表达载体pDsRed2-C1-hDAF的并在小鼠成纤维细胞表达的研究以验证其有效性。方法提取人总RNA,反转录后以cDNA为模板PCR扩增hDAF基因,连接至pMD18-T载体后进行EcoR Ⅰ、 Sma Ⅰ双酶切,回收酶切片段后插入pDsRed2-C1,构建融合表达载体后转染小鼠成纤维细胞。结果结果表明成功克隆了hDAF基因并构建了融合表达载体pDsRed2-C1-hDAF。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48h后观察到RFP阳性细胞。对RFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot,检测DAF基因的整合及表达情况。PCR结果表明hDAF基因整合入小鼠基因组。Western blot检测到了hDAF基因的表达。表明成功构建了融合表达载体pDsRed2-C1-hDAF,并可应用于进一步转基因研究。第五部分利用精子介导法建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型目的建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型,为探讨超急排斥反应（hyperacute rejection, HAR）及延迟性异种排斥反应（delayed xenograft rejection, DXR）的分子调控机制奠定基础。方法采用优化的精子介导法（Sperm-mediated gene transfer, SMGT）制备转基因胚胎,进行胚胎移植后建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型并进行分子生物学检验。结果结果表明应用树枝状聚合物（Dendrimers）优化SMGT后,2细胞胚GFP+RFP的阳性率达到4.51%,同对照组相比差异极显着（P<0.01）。选取标记基因GFP+RFP双阳性的胚胎进行移植后获得36只仔鼠,PCR及Southern blot检测结果表明,17只小鼠PCR结果呈hHT+hDAF双阳性,其中5只小鼠Southern blot结果呈]hHT+hDAF双阳性。上述结果证实成功建立了hHT/hDAF双基因转移小鼠模型。
王东梅[7]（2009）在《人HLA基因DRB1*0901在猪肾细胞中的表达及鉴定》文中认为器官移植是治疗晚期器官衰竭患者的有效措施,但由于可用的人体器官来源有限,一直限制着其广泛应用,随着器官衰竭患者的增加,供需矛盾越来越突出。利用动物器官不失为一条很好的解决途径。异种器官移植的理想器官供体是猪。虽然,存在种属间的不相容性,但由于猪的器官在解剖与生理方面与人的器官更为相近,被认为是最适宜的异种器官来源。由于种属间关系较远,人对猪的器官会发生排斥反应,包括超急性排斥反应（hyperacute rejection,HAR）,急性血管性排斥反应（acute vascular rejection,AVR）,及慢性排斥反应（chronic rejection,CR）。HAR的发生主要是由于受者体内存在的天然抗体,识别猪血管内皮细胞表面的Galα1,3Gal引起的。除了人、猿和旧大陆猴,几乎所有哺乳动物细胞表面均表达Galα1,3Gal抗原。AVR的发生与抗体也有密切的关系,包括抗Gal抗体和抗非Gal抗体。对CR的研究较少,但明确的是人体内的T细胞通过直接识别和间接识别途径,被激活后引发的炎症反应在CR中起到重要的作用。克服异种移植免疫排斥的研究有很多,其中去除猪细胞表面的Galα1,3Gal抗原、通过转基因技术在猪细胞上表达人的补体成分（如CD55,CD59等）和HLA-E,G分子等、使用药物抑制补体活性和免疫排斥反应等方法都取得了明显的疗效,获得了学术界的肯定。台湾的Jang-Ming Lee等将HLA-DPDQ基因导入猪,减少了慢性排斥阶段的细胞反应。人的MHC分子是HLA,即人白细胞抗原,分为Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ类分子,其中Ⅰ类包括HLA-A,-B,-C,-E,-G,-F等,Ⅱ类包括HLA-DR,-DP,-DQ等,Ⅲ类位于I类区域与I类区域之间,主要有补体C2、C4A、C4B（complement component C2、C4A、C4B）等,是与HLA无关的非HLA分子,仅习惯上列为Ⅲ类分子。HLA分子在调解免疫上发挥着重要作用,其中HLA-DRB1分子的作用更为突出。本研究的目的是探索HLA-DRB1分子在猪细胞上表达的可行性,为以后研究利用HLA-DRB1分子抑制免疫排斥反应打下基础。第一部分:HLA-DRB1*09的筛选目的:从人群中筛选到HLA-DRB1位点是09的个体。方法:使用HLA基因分型技术PCR-SSO和PCR-SBT,对人群的HLA-DRB1位点进行分型。结果:确定了表达HLA-DRB1*09的个体。结论:HLA分子生物学分型技术有效、快捷的找到了HLA-DRB1*09的个体,其HLA-DRB1基因型是090102和0101。第二部分:HLA-DRB1*0901及HLA-DRA基因真核细胞双表达载体的构建及鉴定目的:构建HLA-DRB1*0901及HLA-DRA基因真核细胞双表达载体,并对其是否表达鉴定。方法:用RT-PCR的方法从人外周血淋巴细胞的mRNA中逆转录扩增出HLA-DRB1*0901和HLA-DRA的cDNA, HLA-DRA经BglⅡ酶切插入真核表达载体pVITRO2的MCS1中,同时确认正反向,再在pVITRO2的MCS2中连入BamHⅠ酶切的HLA-DRB,确认正反向。将双表达载体转染猪肾细胞,western-blotting鉴定是否表达。结果:酶切和PCR分析鉴定,得到了pVITRO2-DRA-DRB1*0901双表达载体,western-blotting鉴定出有表达。结论:双表达载体pVITRO2可以在猪肾细胞中表达HLA-DRB1*0901。
吕承育[8]（2009）在《慢病毒介导RNA干扰α1，3GT、NF-κB控制异种心脏移植排斥反应研究》文中提出本研究构建了针对小鼠α1,3半乳糖基转移酶（α1,3 galactosyltransferase,α1,3GT）和核转录因-κB（nuclear factor-kappa B, NF-κB）RelA亚基基因的短发夹状RNA（small hairpin RNA, shRNA）慢病毒载体,通过体外转染小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA）的方法,研究RNA干扰α1,3GT和Re1A基因表达的效果,并筛选针对每种基因相对高效的shRNA慢病毒；通过经阴茎背静脉注射慢病毒载体的方法体内转染小鼠心脏,研究慢病毒载体的体内转染效率及对靶基因的体内抑制效果；并以获得的α1,3GT和Re1A表达减低的小鼠心脏为供体,建立稳定的小鼠-大鼠异种异位心脏移植模型,研究慢病毒介导的RNA干扰α1,3GT和RelA在小鼠-大鼠异种心脏移植模型中控制异种移植排斥反应的作用并探讨其机制。第一部分α1,3GT和RelA shRNA（?）曼病毒载体的构建及体外实验研究目的：构建针对小鼠α1,3GT和Re1A基因的shRNA慢病毒载体,探讨shRNA慢病毒载体的体外转染效率及对α1,3GT和Re1A基因的抑制效果,并筛选相对高效的shRNA慢病毒载体。方法：针对α1,3GT和RelA mRNA分别设计合成三条特异性shRNA,并分别构建并合成高滴度的携带α1,3GT和RelA shRNA质粒的重组慢病毒载体,设置空白对照组,阴性病毒对照组、三个α1,3GT-shRNA慢病毒干预组和三个RelA-shRNA慢病毒干预组,分别转染EOMA并优化转染条件；以荧光实时定时PCR和免疫荧光检测转染后EOMA中α1,3GT和Re1A及Galα1,3Gal抗原的表达情况。结果：针对α1,3GT和Re1A的shRNA质粒构建成功,并得到了高滴度携带α1,3GT和RelA shRNA质粒的重组慢病毒载体并可高效稳定转染EOMA;与对照组相比α1,3GT和RelA shRNA慢病毒干预组EOMA的α1,3GT和RelA mRNA转录水平均显着降低（p<0.0l）,α1,3GT-shRNA慢病毒干预组EOMA的Gala 1,3 Gal抗原水平较对照组显着降低（p<0.01）；其中α1,3GTi-3和RelAi-3 shRNA慢病毒干预组对目的基因的表达抑制最为明显。结论：应用成功构建的α1,3GT和RelA shRNA慢病毒载体可高效稳定转染EOMA,并可显着抑（?）（?）Jal,3GT、RelA基因及Galal,3Gal抗原的表达,α1,3GTi-3和RelAi-3 shRNA慢病毒为相对高效病毒,可进一步用于体内实验和动物实验。第二部分经阴茎背静脉注射慢病毒载体的小鼠体内实验目的：评价经阴茎背静脉注射shRNA慢病毒载体转染小鼠心脏的转染效果,探讨慢病毒介导的RNA干扰α1,3GT和Re1A的体内抑制效果。方法：设（1）生理盐水对照组、（2）阴性慢病毒组、（3）al,3GTi-3-shRNA慢病毒组、（4）RelAi-3-shRNA慢病毒组和（5）双病毒组,经阴茎背静脉注射干预小鼠心脏,于注射140h后取小鼠心脏及肝、脾组织,应用荧光显微镜观察组织冰冻切片EGFP绿色荧光的方法评价心脏转染效果及慢病毒载体在体内各脏器的分布情况；分别以实时定量荧光PCR、免疫荧光染色法和Westemblot检测转染后α1,3GT和Re1AmRNA、Galα1,3Gal抗原和RelA蛋白表达情况。结果：慢病毒干预组小鼠心脏绿色荧光强度明显强于盐水对照组,尤以心肌血管内皮为强；肝、脾组织亦有少量绿色荧光分布,但远较心脏组织为弱；shRNA慢病毒干预组目的基因（?）mRNA表达水平比对照组明显降低p<0.01),但单一病毒干预组与双病毒干预组间比较,目的基因的mRNA表达水平无显着性差异（p>0.05）;α1,3GTi-3-shRNA慢病毒组心脏血管内皮Galal,3Gal抗原表达水平比对照组明显降低；（4）、（5）组Re1A蛋白表达水平与对照比较明显降低（p<0.01）,但（4）、（5）组间比较无显着性差异（p>0.05）。结论：于体内经阴茎背静脉注射的方法可使慢病毒载体在小鼠心脏获得高效转染；应用成功构建的shRNA慢病毒载体可在体内有效抑制α1,3GT和Re1A基因表达,并可有效降低Galα1,3Gal抗原和Re1A蛋白的表达水平,可进一步应用于活体移植实验。第三部分RNA干扰α1,3GT、RelA在异种心脏移植模型中的实验研究目的：观察经阴茎背静脉注射shRNA慢病毒干预小鼠-大鼠异种异位心脏移植模型中排斥反应的影响,探讨其抗排斥反应的机制。方法：建立小鼠-大鼠异种异位心脏移植模型；以经阴茎背静脉注射shRNA慢病毒干预Balb/c小鼠心脏,140h后以之为供体,移植至F344大鼠颈部,共设（1）生理盐水对照组、（2）阴性慢病毒组、（3）α1,3GTi-3-shRNA’慢病毒组、（4） RelAi-3-shRNA’慢病毒组和（5）双病毒组,每组各8只；观察移植心脏存活情况；待供心停跳后,取供心标本,分别以实时定量荧光PCR、免疫荧光染色法和Westernblot检测供心α1,3GT和Re1AmRNA、Gala 1,3 Gal抗原和Re1A蛋白表达情况。结果：α1,3GTi-3-shRNA慢病毒组和双病毒组供心存活时间较对照组和RelAi-3-shRNA慢病毒组为长,其差异有显着性（p<0.01）,但此两组间比较,供心存活时间无显着性差异（p>0.05）；RelAi-3-shRNA慢病毒组供心存活其与对照组间无显着性差异（p>0.05）;各shRNA慢病毒干预组供心排斥后目的基因的mRNA水平与排斥前比较,无显着性差异p>0.05)；各shRNA慢病毒干预组相应目的基因的蛋白表达水平在排斥前后亦无显着性差异（p>0.05）,但对照组供心排斥后Re1A蛋白表达水平较排斥前明显升高（p<0.01）;而shRNA病毒干预组供心排斥后目的基因蛋白表达水平仍均较对照组为低,其差异有显着性（p<0.01）。结论：α1,3GTi-3-shRNA慢病毒干预供体,可以有效降低供体心脏α1,3GTmRNA和Gala 1,3 Gal抗原的表达水平,并在一定程度上抑制异种移植超急性排斥反应（hyperacute rej ection, HAR）,提示小鼠-大鼠异种心脏移植中存在HAR,且有Galα1,3Gal抗原参与；RelAi-3-shRNA慢病毒介导的RNA干扰亦可有效降低RelA mRNA和蛋白的表达水平,但在HAR阶段尚无显着延长移植供体生存期的作用。
兰宗宝,王修文,许惠艳[9]（2008）在《猪器官异种移植研究进展》文中研究指明随着临床医学的发展和免疫抑制剂的开发利用,同种器官移植已获得显着成效,但器官资源缺乏严重阻碍其广泛应用,因而异种器官移植受到高度重视,目前认为猪是较理想的异种器官来源。文章阐述了猪器官异种移植中的免疫障碍以及克服排斥策略、免疫耐受在异种移植中的应用、异种移植存在的生理活动障碍等问题,同时提出加强对转基因猪作为异种器官移植模型的研究,并尽快出台和完善异种器官移植相关伦理法规和指导原则等建议。
张志宏,马腾骧,王广有,张玥,李胜芝,李光三,刘思金[10]（2007）在《血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠抗超急性排斥反应能力》文中指出目的:检测血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠抗超急性排斥反应能力。方法:采用Langendorff心脏灌注装置,用20%稀释人血清灌注转基因小鼠离体心脏,观察其抗超急排斥反应能力。免疫组化方法检测灌注后心脏组织人IgM沉积情况。结果:与普通鼠对比,转基因小鼠离体心脏在用20%稀释人血清灌注期间心脏存活时间明显延长,且60min灌注期间内做功仍维持在最大值20%以上,显示转基因小鼠具有一定抗超急排斥反应能力。免疫组化显示C3c（免疫组化一抗）在转基因组心肌组织间、血管管壁仅有少量沉积,普通小鼠组大量沉积,显示普通小鼠心脏遭受较为强烈的超急排斥反应损伤。结论:血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠有一定的抗超急排斥反应能力。
二、异种器官移植用血管内皮细胞特异表达人CD59重组基因的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、异种器官移植用血管内皮细胞特异表达人CD59重组基因的构建（论文提纲范文）
（1）牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因大动物研究概况 |
| 1.1.1 转基因大动物的研究历史 |
| 1.1.2 转基因大动物的应用 |
| 1.1.3 大动物传统转基因技术 |
| 1.1.4 大动物转基因定点修饰技术 |
| 1.2 安全位点研究现状 |
| 1.2.1 安全位点Rosa26的发现及研究现状 |
| 1.2.2 安全位点Rosa26的定点修饰 |
| 1.2.3 安全位点Rosa26的应用 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系和实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 培养基及常用试剂配制 |
| 2.1.6 常用分析软件及网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR反应体系与程序 |
| 2.2.2 酶切、连接与转化 |
| 2.2.3 DNA纯化回收 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 基因组提取 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 蛋白提取 |
| 2.2.8 蛋白浓度测定 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 3'RACE/5'RACE |
| 2.2.11 SSA实验 |
| 2.2.12 TALENs质粒构建 |
| 2.2.13 T7E1检测TALENs效率 |
| 2.2.14 TAT-Cre的纯化 |
| 2.2.15 Western Blotting |
| 2.2.16 Southern Blotting |
| 2.2.17 细胞培养与筛选 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 牛Rosa26 (bovine Rosa26,bRosa26)位点的定位与表达分析_Toc510886805 |
| 3.1.1 bRosa26位点在基因组中的定位 |
| 3.1.2 3'RACE、5'RACE确定bRosa26转录本 |
| 3.1.3 RT-PCR、Q-PCR检测bRosa26 noncoding RNA在牛各组织中的表达 |
| 3.1.4 bRosa26-EGFP瞬时表达载体构建 |
| 3.1.5 bRosa26启动子体外启动EGFP表达分析 |
| 3.1.6 分析与讨论 |
| 3.2 TALENs真核表达载体的构建及活性分析 |
| 3.2.1 bRosa26位点TALENs设计与构建 |
| 3.2.2 SSA实验 |
| 3.2.3 T7E1实验 |
| 3.2.4 分析与讨论 |
| 3.3 TALENs介导bRosa26位点基因打靶 |
| 3.3.1 bRosa26位点基因打靶载体构建 |
| 3.3.2 TALENs介导bRosa26位点基因打靶细胞筛选与鉴定 |
| 3.3.3 TAT-Cre重组蛋白报告模型验证 |
| 3.3.4 细胞水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.5 胚胎发育、个体水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.6 分析与讨论 |
| 3.4 RMCE介导bRosa26-EGFP基因替换 |
| 3.4.1 bRosa26-EGFP胎儿成纤维细胞系的建立 |
| 3.4.2 RMCE替换载体的构建 |
| 3.4.3 RMCE替换克隆点的筛选 |
| 3.4.4 分析与讨论 |
| 3.5 bRosa26位点支持广谱型启动子启动外源基因表达研究 |
| 3.5.1 广谱型启动子启动EGFP打靶载体构建 |
| 3.5.2 细胞克隆点的筛选与鉴定 |
| 3.5.3 外源启动子启动EGFP表达情况分析 |
| 3.5.4 分析与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（2）GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第1部分 文献综述 |
| 第1章 基因修饰猪用于异种移植的研究进展 |
| 1.1 猪异种移植免疫障碍 |
| 1.2 促进异种移植发展的相关技术 |
| 1.3 组织器官异种移植的研究进展 |
| 1.4 展望 |
| 第2章 人多能干细胞移植的免疫障碍 |
| 2.1 人多能干细胞移植的意义 |
| 2.2 人多能干细胞的免疫原性 |
| 2.3 克服人多能干细胞移植免疫障碍的相关策略 |
| 2.4 展望 |
| 第2部分 实验研究 |
| 第3章 GGTA1敲除猪的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果和讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 低免疫原性人多能干细胞的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法(与3.2相同者,省略) |
| 4.3 实验结果和讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 过表达转录因子提高人多能干细胞造血分化能力 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法(与3.2,4.2相同者,省略) |
| 5.3 实验结果和讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 全文总结和展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
（3）版纳微型猪近交系5个潜在相关猪→人异种器官移植免疫排斥反应基因的克隆、表达及功能生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 1 引言 |
| 1.1 器官移植简介 |
| 1.2 供临床移植的器官供体严重缺乏 |
| 1.3 异种器官移植供体的选择 |
| 1.4 异种器官移植概况 |
| 1.5 版纳微型猪近交系(BMI)是潜在的猪→人异种器官移植供体 |
| 1.6 猪→人异种器官移植免疫排斥相关基因简介 |
| 1.6.1 猪胞苷磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因研究进展 |
| 1.6.2 猪氧化应激反应1(OXSR1)基因研究进展 |
| 1.6.3 猪共刺激因子CD80 (CD80)基因研究进展 |
| 1.6.4 肝脏去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)基因研究进展 |
| 1.6.5 β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶2(B4GALNT2)基因研究进展 |
| 1.7 本研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 购买试剂 |
| 2.1.2.1 RNA分析所需试剂 |
| 2.1.2.2 蛋白分析所需试剂 |
| 2.1.2.3 真核表达试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.3.1 RNA分析试剂 |
| 2.1.3.2 蛋白分析试剂 |
| 2.1.3.3 真核表达试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因扩增和序列分析 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 组织总RNA的提取和制备 |
| 2.2.3 组织总RNA质量和完整性检测 |
| 2.2.4 cDNA第一链合成 |
| 2.2.5 设计并合成PCR引物 |
| 2.2.6 PCR扩增及产物检测 |
| 2.2.7 PCR产物的回收纯化 |
| 2.2.8 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2与pMD18-T克隆载体连接 |
| 2.2.9 连接产物的转化、鉴定、质粒提取和序列测定 |
| 2.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因的表达研究 |
| 2.3.1 qPCR分析基因的多组织表达情况 |
| 2.3.1.1 引物设计 |
| 2.3.1.2 qPCR表达分析 |
| 2.3.2 Western Blot (WB)检测CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2蛋白的表达 |
| 2.3.2.1 组织总蛋白的提取 |
| 2.3.2.2 BCA法测总蛋白浓度 |
| 2.3.2.3 蛋白质变性 |
| 2.3.2.4 制作SDS-PAGE凝胶 |
| 2.3.2.5 Western Blot检测 |
| 2.3.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达分析 |
| 2.3.3.1 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALMT2真核表达引物设计 |
| 2.3.3.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达序列扩增 |
| 2.3.3.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达产物与pMD18-T重组克隆载体的构建 |
| 2.3.3.4 pIRES2-AcGFP1质粒的扩增、提取与保存 |
| 2.3.3.5 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2与pIRES2-AcGFP1重组真核表达载体的构建 |
| 2.3.3.6 培养转染用猪肾上皮PK15细胞 |
| 2.3.3.7 真核表达重组质粒转染PK15细胞 |
| 2.3.3.8 真核表达重组质粒转染的PK15细胞中总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.3.3.9 半定量PCR检测BMI CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 mRNA表达量的差异 |
| 2.3.3.10 培养转染用人脐静脉内皮细胞HUVEC |
| 2.3.3.11 真核表达重组质粒转染HUYEC细胞 |
| 2.4 蛋白质序列的生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因序列扩增与分析结果 |
| 3.1.1 组织总RNA检测结果 |
| 3.1.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因PCR扩增结果 |
| 3.1.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因序列测定结果 |
| 3.1.3.1 CMAH基因序列 |
| 3.1.3.2 OXSR1基因序列 |
| 3.1.3.3 CD80基因序列 |
| 3.1.3.4 ASGR1基因序列测定结果 |
| 3.1.3.5 B4GALNT2基因序列测定结果 |
| 3.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因的表达分析结果 |
| 3.2.1 qPCR分析的CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.1 qPCR分析的CMAH mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.2 qPCR分析的OXSR1 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.3 qPCR分析的CD80 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.4 qPCR分析的ASGR1 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.1.5 qPCR分析的B4GALNT2 mRNA多组织表达结果 |
| 3.2.2 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2蛋白表达情况 |
| 3.2.2.1 BCA法测总蛋白浓度标准曲线的绘制 |
| 3.2.2.2 Western Blot分析BMICMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2蛋白表达情况 |
| 3.2.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达结果 |
| 3.2.3.1 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2真核表达序列扩增结果 |
| 3.2.3.2 pMD1 8-T-CMAH/OXSR1/CD80/ASGR1/B4GALNT2(真核表达序列)重组质粒菌液PCR和双酶切鉴定结果 |
| 3.2.3.3 pIRES2-AcGFP1质粒的鉴定 |
| 3.2.3.4 pIRES2-AcGFP1、pMD18-T-CMAH/OXSR1/CD80/ASGR1/B4GALNT2(真核表达序列)真核表达序列双酶切结果 |
| 3.2.3.5 真核表达重组质粒菌液PCR和双酶切鉴定结果 |
| 3.2.3.6 真核表达重组质粒在真核细胞中的表达 |
| 3.2.3.7 细胞总RNA电泳检测结果 |
| 3.2.3.8 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2细胞mRNA表达分析结果 |
| 3.3 CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.1 CMAH蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.1.1 CMAH蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.1.2 CMAH蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.1.3 CMAH蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.1.4 CMAH蛋白质结构分析 |
| 3.3.2 OXSR1蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.2.1 OXSR1蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.2.2 OXSR1蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.2.3 OXSR1蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.2.4 OXSR1蛋白质结构分析 |
| 3.3.3 CD80蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.3.1 CD80蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.3.2 CD80蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.3.3 CD80蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.3.4 CD80蛋白质结构分析 |
| 3.3.4 ASGR1蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.4.1 ASGR1蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.4.2 ASGR1蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.4.3 ASGR1蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.4.4 ASGR1蛋白质结构分析 |
| 3.3.5 B4GALNT2蛋白质功能生物信息学分析 |
| 3.3.5.1 B4GALNT2蛋白质序列的基本信息分析 |
| 3.3.5.2 B4GALNT2蛋白质序列的特征信息分析 |
| 3.3.5.3 B4GALNT2蛋白质的结构域和功能位点分析 |
| 3.3.5.4 B4GALNT2蛋白质结构分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 所研究基因mRNA水平的多组织表达差异分析 |
| 4.2 所研究基因对应蛋白质的组织表达分析 |
| 4.3 所研究基因细胞水平的真核表达分析 |
| 4.4 所研究基因编码蛋白质的功能生物信息学分析 |
| 4.5 问题及展望 |
| 5 小结 |
| 5.1 主要研究结果 |
| 5.2 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 在读研究生期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（4）猪IκBα打靶载体构建暨NFκB p65特征分析及p65RHD时空特异表达（论文提纲范文）
| 第一部分 猪IκBα打靶载体构建 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 IκBα对NFκB信号通路调控及其在延缓性排斥反应中功能的研究进展 |
| 1.1.1 NFκB信号通路 |
| 1.1.2 NFκB信号通路在机体生长发育过程中的重要功能 |
| 1.1.3 IκBα对延缓性排斥反应中NFκB信号通路的调控 |
| 1.2 猪异种移植延缓性排斥反应的机理 |
| 1.2.1 猪异种移植排斥反应种类及研究进展 |
| 1.2.2 猪异种移植延缓性排斥反应发生的机理及解决途径 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 DNA样品 |
| 2.1.2 克隆及打靶载体 |
| 2.1.3 生化试剂及试剂盒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IκBα基因cDNA定点诱变 |
| 2.2.2 IκBα野生型及突变型真核表达载体构建及真核表达实验 |
| 2.2.3 含有突变型和野生型IκBα cDNA序列的Cre/Loxp系统构建 |
| 2.2.4 打靶载体长短臂扩增及克隆 |
| 2.2.5 IκBα条件性敲除打靶载体pFPC-C各元件拼接 |
| 2.2.6 含内源启动子的IκBα条件打靶载体的构建 |
| 2.2.7 普通打靶载体pLHG-4的构建 |
| 2.2.8 pLHG-4基因打靶试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 IκBα基因cDNA定点诱变 |
| 3.1.1 试剂盒定点突变 |
| 3.1.2 重叠延伸PCR法定点突变 |
| 3.1.3 克隆测序 |
| 3.2 IκBα野生型及突变型真核表达载体构建及真核表达实验 |
| 3.2.1 IκBα野生型及突变型真核表达载体构建 |
| 3.2.2 IκBα野生型及突变型真核表达实验 |
| 3.3 含有突变型和野生型IκBα cDNA序列的Cre/Loxp系统构建及验证 |
| 3.4 打靶载体长短臂扩增及克隆 |
| 3.4.1 猪血管内皮细胞PIEC培养及基因组DNA提取 |
| 3.4.2 5’短臂的扩增及克隆 |
| 3.4.3 3’长臂的扩增及克隆 |
| 3.5 IκBα条件性敲除打靶载体pFPC-C各元件拼接 |
| 3.6 含内源启动子的IκBα条件打靶载体的构建 |
| 3.6.1 猪IκBα基因内源启动子序列的扩增及克隆 |
| 3.6.2 含内源启动子的条件打靶载体pLHG-5的构建 |
| 3.6.3 单独锚定筛选标记基因的条件打靶载体pLHG-6的构建 |
| 3.7 普通打靶载体pLHG-4的构建 |
| 3.8 pLHG-4基因打靶试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 IκBα基因cDNA定点诱变 |
| 4.2 抑制异种移植延缓性排斥反应的途径 |
| 4.3 载体构建中寡核苷酸的充分利用 |
| 4.4 关于未得到阳性细胞克隆的思考 |
| 4.5 关于打靶策略的反思 |
| 5 小结 |
| 第二部分 猪NFκB p65特征分析及p65RHD时空特异表达 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 NFκB p65亚基研究进展 |
| 1.2 p65RHD功能鉴定及应用研究进展 |
| 1.3 NFκB信号通路血管内皮细胞时空特异性抑制 |
| 1.4 血管内皮细胞保护与异种移植 |
| 1.5 猪血管内皮细胞特异性启动子 |
| 1.6 四环素诱导表达系统的原理及应用 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 DNA样品 |
| 2.1.2 RNA样品 |
| 2.1.3 载体 |
| 2.1.4 试剂及试剂盒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养与处理 |
| 2.2.2 实验猪资源群体免疫性状的测定 |
| 2.2.3 猪NFκB p65(pp65)的克隆及表达载体构建 |
| 2.2.4 序列比对和进化树构建 |
| 2.2.5 转染、荧光素酶报告基因检测及免疫细胞化学检测 |
| 2.2.6 实时定量PCR法检测基因相对表达 |
| 2.2.7 多态位点鉴定及PCR-RFLP分型 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 2.2.9 pTet-ICAM载体构建 |
| 2.2.10 pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性表达 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 pp65基因组结构分析 |
| 3.2 猪NFκB p65(pp65)的克隆、表达载体构建及序列分析 |
| 3.3 猪NFκB p65亚基的表达及特征分析 |
| 3.4 pp65RHD的过表达抑制NFκB |
| 3.5 猪p65组织表达谱 |
| 3.6 多态检测及关联分析 |
| 3.7 pTet-ICAM载体构建 |
| 3.7.1 获取ICAM-2启动子全长 |
| 3.7.2 组装pTet-ICAM载体 |
| 3.8 pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性表达 |
| 3.8.1 pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性表达系统瞬时转染PIEC细胞系 |
| 3.8.2 pp65RHD四环素可控内皮细胞特异性表达系统稳定转染PIEC细胞系 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪NF-κB p65结构及功能特征 |
| 4.2 NFκB抑制因子的选择问题 |
| 4.3 NFκB时空特异性抑制失败的原因及可能的解决办法 |
| 4.4 p65RHD的亚细胞定位 |
| 4.5 PIEC细胞27-20号克隆特殊现象探讨 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 个人简历 |
| 附录2 免疫性状检测指标 |
| 附录3 免疫性状关联分析 |
| 附录4 序列 |
（6）以纳米材料作载体改进精子介导法建立异种移植供体模型的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 一、基于树枝状聚合物建立小鼠精子介导基因转移技术 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 药品试剂 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 DIG标记DNA片段准备 |
| 1.1.4 精子转染程序 |
| 1.1.5 末端标记DNA/Dendrimers复合物的制备 |
| 1.1.6 精子的免疫组化检查方法 |
| 1.1.7 试验设计 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 精子/Dendrimers/DNA共同孵育时间和DNA使用浓度的确定 |
| 1.2.2 来源于不同动物个体的精子与DNA孵育后的结合率和内化率比较 |
| 1.2.3 精子获能对外源DNA结合和内化的影响 |
| 1.2.4 细胞膜通透剂二甲基亚砜(DMSO)对外源DNA结合和内化的影响 |
| 1.2.5 死精子结合和内化外源DNA的特征 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、利用EGTA等提高精子介导效率的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 药品试剂 |
| 2.1.2 质粒pCMV-MCS-HT的制备 |
| 2.1.3 杂交探针的制备 |
| 2.1.4 EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对精子活力影响 |
| 2.1.5 EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对精子获能的影响 |
| 2.1.6 EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对精子结合外源DNA的影响 |
| 2.1.7 EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对内化DNA的影响 |
| 2.1.8 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对精子活力和体外存活时间影响 |
| 2.2.2 EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对精子体外获能的影响 |
| 2.2.3 EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对精子结合外源DNA的影响 |
| 2.2.4 EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对内化DNA的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、hHT/GFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要设备 |
| 3.1.3 实验试剂及其配制 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 真核表达载体pEGFP-C1-hHT的构建 |
| 3.2.2 GFP在小鼠成纤维细胞中的表达 |
| 3.2.3 小鼠成纤维细胞中hHT的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、hDAF/RFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 真核表达载体pDsRed2-C1-hDAF的构建 |
| 4.2.2 RFP在小鼠成纤维细胞中的表达 |
| 4.2.3 小鼠成纤维细胞中hDAF的检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、利用精子介导法建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转基因胚胎的制备 |
| 5.2.2 G_0小鼠的PCR检测 |
| 5.2.3 G_0代小鼠的Southern blot检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 精子介导转基因技术的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 异种移植用转基因猪临床前研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（7）人HLA基因DRB1*0901在猪肾细胞中的表达及鉴定（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 表达 HLA-DRB1*09 个体的鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 双表达载体的构建和在猪肾细胞中的鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 回顾与展望 |
| 参考文献 |
| 综述1 |
| 综述2 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）慢病毒介导RNA干扰α1，3GT、NF-κB控制异种心脏移植排斥反应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 靶向小鼠α1,3GT、RelA shRNA慢病毒载体的构建及体外实验研究 |
| 1.1 靶向小鼠α1,3GT、RelA shRNA慢病毒载体的构建 |
| 1.1.1 对象和方法 |
| 1.1.2 结果 |
| 1.1.3 讨论 |
| 1.1.4 小结 |
| 1.2 α1,3GT和Re1A慢病毒转染EOMA细胞实验研究 |
| 1.2.1 对象和方法 |
| 1.2.2 结果 |
| 1.2.3 讨论 |
| 1.2.4 小结 |
| 经阴茎背静脉注射慢病毒载体的体内研究 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| RNA干扰1,3 GT、RelA在异种心脏移植模型中的实验研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 α1,3GT、NF-κB与异种移植排斥反应 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（9）猪器官异种移植研究进展（论文提纲范文）
| 1 异种器官移植的免疫学障碍及克服排斥策略 |
| 1.1 超急性排斥反应 (HAR) |
| 1.1.1 降低或消除异种移植物抗原, 克服HAR发生 |
| 1.1.2 从补体方面克服HAR发生 |
| 1.1.3 多基因导入克服HAR |
| 1.2 急性血管性排斥反应 (AVR) |
| 1.3 细胞排斥反应 (CR) |
| 2 免疫耐受在异种器官移植中的应用 |
| 3 生理功能障碍 |
| 4 异种器官移植存在的问题与展望 |
四、异种器官移植用血管内皮细胞特异表达人CD59重组基因的构建（论文参考文献）
- [1]牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰[D]. 王明. 中国农业大学, 2018(02)
- [2]GGTA1敲除猪以及低免疫原性人多能干细胞的研究[D]. 陈海德. 浙江大学, 2017(11)
- [3]版纳微型猪近交系5个潜在相关猪→人异种器官移植免疫排斥反应基因的克隆、表达及功能生物信息学分析[D]. 霍海龙. 云南大学, 2016(06)
- [4]猪IκBα打靶载体构建暨NFκB p65特征分析及p65RHD时空特异表达[D]. 李和刚. 华中农业大学, 2011(05)
- [5]异种器官移植克服HAR的研究进展[A]. 张名媛,蒋钦杨,范晶,陈宝剑,覃永长,吴丹,杨柳,郭亚芬,兰干球,蒋和生. 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（下册）, 2010
- [6]以纳米材料作载体改进精子介导法建立异种移植供体模型的研究[D]. 郭战军. 天津医科大学, 2010(12)
- [7]人HLA基因DRB1*0901在猪肾细胞中的表达及鉴定[D]. 王东梅. 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2009(10)
- [8]慢病毒介导RNA干扰α1，3GT、NF-κB控制异种心脏移植排斥反应研究[D]. 吕承育. 天津医科大学, 2009(02)
- [9]猪器官异种移植研究进展[J]. 兰宗宝,王修文,许惠艳. 广西农业科学, 2008(03)
- [10]血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠抗超急性排斥反应能力[J]. 张志宏,马腾骧,王广有,张玥,李胜芝,李光三,刘思金. 天津医科大学学报, 2007(02)