一、Relationship between structure and function of JWA in the modulation of cell differentiation（论文文献综述）
韩卓[1]（2021）在《维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究》文中认为维生素C（Vitamin C,VitC）是人和动物必需的营养物质。科学界对于VitC功能几乎所有的认识都基于它作为电子供体,即作为天然还原剂的化学性质,主要表现在VitC能够清除细胞代谢过程中产生的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）,保护重要的生物大分子免于氧化损伤,维持细胞的正常功能。对VitC研究的一次重大突破,在于发现VitC是亚铁离子(ferrous ion,Fe2+)和2-氧戊二酸盐（2-oxoglutarate）依赖型双加氧酶(Fe2+-and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases,Fe2+/2OGDDs)家族关键的“辅因子”,维持Fe2+/2OGDDs在细胞内的活性。进一步研究揭示,VitC能作为辅因子调节Fe2+/2OGDDs家族中与表观修饰有关的酶的催化活性,其中包括DNA羟化酶TET（ten-eleven translocation（TET）family of DNA hydroxylases）和具有Jumonji-C结构域的组蛋白去甲基化酶（Jumonji-C domain-containing histone demethylases）。这一发现直接加速了VitC在干细胞和再生医学领域中的研究,越来越多的证据表明VitC能够通过调控表观修饰酶的活性来提升细胞重编程的效率和质量,也能参与调节干细胞的自我更新和定向分化。有研究曾提出,VitC作为辅因子的生物学功能,本质上依然以VitC固有的还原性为基础,但VitC对表观修饰酶功能调控的特殊性却暗示VitC很可能还存在其他的作用机制,说明我们目前对VitC功能的认识很可能还存在很大空白,大大限制了VitC的应用价值。2014年,本课题组研究发现,VitC通过激活Janus kinase（JAK）2/signal transducer and activator of transcription（STAT）2信号途径,在小鼠胚胎干细胞中诱导Nanog基因的表达。我们曾初步证实,钠离子依赖型VitC转运蛋白2（sodium-dependent vitamin C transporter 2,SVCT2）能够介导VitC对JAK2和STAT2的信号激活,并参与对下游基因的调控,提示VitC与细胞信号转导有关联。在此基础上,本研究以小鼠F9畸胎瘤干细胞系为主要研究对象,首次证明VitC具有“生物信号分子”的作用,完善了对VitC生物学功能的认知。研究可分为两大阶段,第一阶段揭示VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能;第二阶段研究VitC激活的JAK2信号传递途径具有的调控作用及其对VitC生物学功能的补充。主要的研究内容和结果列举如下:1.发现和探究VitC转运蛋白SVCT2的受体功能。首先,通过蛋白质免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）和免疫印迹,我们证明SVCT2特异性结合JAK2而不结合JAK1、JAK3和TYK2。然后,通过基序预测和突变体策略,研究SVCT2蛋白序列中介导JAK2结合和激活的关键结构基序。结果显示,位于SVCT2羧基末端的618-621位氨基酸序列以及连接第8～9号跨膜螺旋的胞质侧肽段中的418-422位氨基酸序列是负责结合JAK2的关键基序,介导VitC对JAK2的激活。通过磷酸化位点预测和突变体策略,研究JAK2对SVCT2潜在的磷酸化作用及其对招募STAT2的影响。结果显示,VitC激活的JAK2催化SVCT2羧基端Tyr626发生磷酸化,介导SVCT2对STAT2的招募,进一步诱导JAK2和STAT2的磷酸化。之后,通过双荧光素酶报告（Dual Luciferase Reporter）实验,我们还证明SVCT2响应VitC处理增强STAT2的转录因子活性,且依赖JAK2的激活。综上,本研究证实SVCT2是VitC的“受体样转运蛋白”,具有JAK2偶联受体的典型特征。此外,本研究还证明VitC对JAK2的激活与VitC在细胞内的积累无关。2.研究SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间的关联。通过co-IP和免疫印迹,研究SVCT2介导的VitC运输对JAK2激活的影响。结果显示,抑制SVCT2对VitC的运输作用会抑制SVCT2对JAK2的磷酸化激活。通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography）实验,研究SVCT2对JAK2的激活是否反过来影响SVCT2对VitC的运输。结果显示,抑制JAK2的激活也会削弱SVCT2对VitC的运输能力。这部分研究证明,SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间紧密偶联、不可分割,是一个完整的生物学事件。3.研究VitC激活JAK2与清除ROS之间的关系。首先,通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）和免疫印迹,研究VitC抑制ROS的作用对激活JAK2的影响。结果显示,VitC对JAK2的激活并不依赖对ROS的抑制。接下来,我们研究VitC激活的JAK2是否反过来影响VitC对ROS水平的调控。结果显示,VitC抑制细胞内ROS的水平且部分依赖JAK2的活性。随后的研究进一步证明,VitC激活的JAK2催化其固有底物脯氨酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase,PDHK1）发生磷酸化,活化的PDHK1又催化脯氨酸脱氢酶E1α亚基（E1 alpha subunit of pyruvate dehydrogenase,PDHA1）Ser232发生磷酸化,抑制PDHA1的活性,降低细胞氧化代谢效率,进而抑制ROS的产生。4.研究JAK2的激活对VitC表观调控功能的影响。通过免疫荧光、点杂交和免疫印迹,研究VitC激活的JAK2对5hm C水平的调控。结果显示,抑制JAK2的激活会抑制VitC对5hm C水平的促进。通过磷酸化位点预测和突变体策略,我们首次证明TET3是JAK2的激酶底物。VitC和SVCT2激活的JAK2直接催化TET3 Tyr1375发生磷酸化。后续研究证实Tyr1375的磷酸化增强了TET3的酶活性并影响其对靶基因的选择,表明VitC不仅仅以辅因子身份调控TET酶的功能。另外,VitC激活的JAK2催化其固有底物组蛋白H3第41位酪氨酸残基发生磷酸化,而后者有利于开放染色质状态的建立。通过微球菌核酸酶消化实验,我们证明VitC确实能够提高基因组DNA的可接近性,且依赖于JAK2的激活。5.研究JAK2的激活对VitC在细胞多能性和分化调控中的影响。通过碱性磷酸酶染色、表达谱m RNA测序和实时定量PCR,研究VitC激活的JAK2对F9细胞的多能性,以及对多能性和分化相关基因表达的影响。结果显示,在F9细胞中,VitC对细胞多能性没有明显影响,但倾向于促进分化发育相关基因（特别是与神经成熟相关基因）的表达,且依赖于JAK2的激活;只有在JAK2活性被抑制的条件下,VitC更倾向于促进细胞的多能性,并诱导一系列多能性相关基因（但不包括Nanog）的表达。进一步的研究发现,VitC激活的JAK2实际上通过两条作用相反的途径分别调控两类下游基因的表达,即通过依赖STAT2的途径调控少数特定多能性相关基因（比如Nanog）的表达;通过不依赖STAT2的途径调控与分化相关基因的表达。综上,本研究发现VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能,并证明激活JAK2是VitC发挥调控作用的重要途径。这是对VitC生物学作用突破性的发现,为其生理和药理功能的研究带来新的思考,对VitC在疾病治疗和再生医学等众多领域的应用具有一定的指导意义。
邱丹萍[2]（2018）在《RNF185通过降解JWA促进胃癌转移的分子机制研究》文中指出胃癌已经成为危害人类健康的重大公共卫生问题。在全球范围内,胃癌的发病率位于第五位而死亡率位于第三位,是人类常见的消化道恶性肿瘤之一。而转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因,据统计显示大约90%的恶性肿瘤患者的死亡是由于转移所导致。但是目前的临床治疗方法都无法完全阻止胃癌复发和转移。肿瘤转移是恶性肿瘤进程中的重要特征,是多步骤的复杂过程。但是目前在肿瘤生物学中肿瘤转移过程的本质仍了解不多,导致临床上缺乏能够有效抑制肿瘤转移的治疗方法。目前已经有很多研究表明蛋白翻译后修饰与肿瘤的转移相关,这意味着蛋白翻译后修饰相关分子可能成为抗肿瘤转移的靶点以及肿瘤患者预后与生存的生物标志物。在哺乳动物细胞中,蛋白的降解主要是依赖于泛素-蛋白酶体途径。泛素-蛋白酶体途径是一个三酶级联,包括E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。E3泛素连接酶可以特异性的靶向降解蛋白,但是如果E3泛素连接酶功能丧失以及不正确的靶向降解,则会导致许多疾病的发生。目前已经有许多研究发现泛素化与包括胃癌在内的恶性肿瘤转移相关。有研究发现MDM2和TRAF6等许多E3泛素连接酶在癌症中发挥癌基因的作用。但是目前它们相应的抑制剂Nutlin-3与EGCG已经应用于临床前研究。因此,靶向泛素-蛋白酶体途径可以作为抗肿瘤治疗的新策略。JWA基因,又名ARL6IP5,前期本课题组发现JWA参与细胞应答,保护正常细胞免受DNA损伤。JWA通过SP1阻断MMP2信号通路从而抑制胃癌血管生成。在HER2阳性的胃癌细胞中,JWA通过MAPK信号通路来抑制细胞迁移。除此之外,在许多肿瘤中JWA表达比癌旁组织低,例如黑色素瘤,肝癌和胃癌,同时还发现肿瘤组织中JWA表达较低的患者生存状况较差。这些研究均表明JWA在胃癌中发挥抑癌基因的作用我们预测发现RNF185可能会泛素化降解JWA,并且也在后续的实验中得到验证,为了探讨RNF185通过JWA调控胃癌转移的作用机制,通过构建胃癌细胞的体外模型以及小鼠体内转移模型,结果显示RNF185通过泛素化降解JWA促进胃癌转移。目的:探讨RNF185通过JWA调控胃癌转移的作用机制以及寻找JWA泛素化位点方法:（1）免疫印迹实验检测RNF185与JWA在胃癌细胞以及组织中的表达。（2）免疫共沉淀以及免疫荧光实验检测RNF185与JWA的相互作用以及细胞中的定位。（3）RNF185高表达质粒以及RNF185 si RNA在胃癌细胞在进行转染,免疫印迹实验检测JWA的表达情况,免疫共沉淀实验检测JWA的泛素化情况,穿孔与划痕实验检测细胞的迁移情况。（4）通过回复实验,在胃癌细胞中转染HA-RNF185以及Flag-JWA,穿孔与划痕实验检测细胞的迁移情况。（5）构建JWA突变质粒,Flag-JWA（K31R）,Flag-JWA（K151R）,Flag-JWA（K158R）,FlagJWA（K185R）,Flag-JWA（ALL）。通过免疫印迹,免疫共沉淀和穿孔实验寻找JWA的泛素化位点。（6）构建RNF185稳定高表达的BGC823细胞株,小鼠尾静脉注射,通过免疫组化实验检测小鼠胃癌细胞肺转移情况以及RNF185与JWA表达情况。结果1.JWA可能通过泛素-蛋白酶体途径降解。在胃癌细胞BGC823和SGC7901中,加入CHX处理,观察到内源性JWA蛋白水平随时间而降低。此外,当用MG132处理细胞时,JWA的蛋白增加。在BGC823和SGC7901细胞中转染Flag-JWA,结果显示外源性JWA蛋白在CHX处理后,随时间也会发生减少,并且在MG132处理后,外源性的JWA蛋白也会增多。2.JWA与RNF185存在相互作用。通过网站预测发现一个E3泛素连接酶RNF185可能与JWA相互作用。免疫共沉淀实验验证在BGC823和HGC27细胞中RNF185和JWA之间存在相互作用。免疫荧光实验显示在BGC823细胞中RNF185和JWA共定位于细胞质中。3.RNF185在蛋白水平负调控JWA。在BGC823或SGC7901细胞中转染HARNF185,免疫印迹实验显示JWA蛋白表达降低至对照细胞的43%与38%。在HGC27细胞转染RNF185 si RNA,结果显示JWA蛋白表达增加至对照组的2.91-4.91倍。通过免疫印迹实验检测了9个胃癌与胃粘膜上皮细胞系（R=-0.67,p<0.05）和22个胃癌原发性肿瘤组织（R=-0.42,p<0.05）中JWA与RNF185蛋白水平,两个结果皆显示RNF185与JWA呈负相关。进一步构建了Kaplan-Meier生存曲线,结果显示具有RNF185高表达的患者预后差（N=99,log-rank检验,P<0.01）。将RNF185和JWA合并为一个新变量时,并将患者分为3组:高RNF185和低JWA组;低RNF185和高JWA;其他。结果显示,RNF185高和JWA低的患者预后较差（N=99,log-rank检验,P<0.01）。4.RNF185促进JWA泛素化降解。胃癌细胞BGC823与SGC7901转染HARNF185后,再用CHX处理,结果表明RNF185高表达会促进JWA的蛋白稳定性降低,进一步利用BGC823/DDP细胞和HGC27细胞,发现转染RNF185 siRNA后,再加入CHX处理,JWA的蛋白稳定性增加。免疫共沉淀实验结果显示在胃癌细胞中JWA会发生泛素化,并且RNF185高表达进一步增强了0.46倍的JWA泛素化,而RNF185敲低明显减弱了34%的JWA泛素化。免疫荧光实验结果显示JWA在内质网与线粒体上都存在共定位,但是高表达RNF185后JWA与内质网的共定位减少,但是与线粒体的共定位未有明显改变,表明RNF185主要降解内质网上的JWA蛋白。5.RNF185通过下调JWA表达促进胃癌细胞迁移。穿孔实验结果显示BGC823和SGC7901细胞高表达RNF185后细胞迁移分别增加至相应对照细胞的2.07倍与2.08倍,划痕实验表明在高表达RNF185后细胞迁移增加至1.63与1.74倍。穿孔实验证明HGC27和MGC803细胞敲减RNF185后细胞迁移分别降低至对照细胞的64%-79%与53%-57%。划痕实验也证明RNF185敲减后细胞迁移减少至60%-63%与68%-69%。进一步使用回复实验,在BGC823细胞中将HA-RNF185和Flag-JWA质粒共转染,穿孔和划痕实验显示高表达JWA可以逆转由于RNF185高表达所导致的胃癌细胞迁移增加。6.JWA的K158位点是其在胃癌细胞中泛素化所必需的。将Flag-JWA（WT）,四个单泛素化位点突变体（Flag-JWA（K31R）,Flag-JWA（K151R）,Flag-JWA（K158R）,Flag-JWA（K185R））和一个多泛素化位点突变体Flag-JWA（ALL）分别转染到HGC27细胞中,加入CHX处理,免疫印迹实验结果显示在胃癌细胞中Flag-JWA（K158R）和Flag-JWA（ALL）突变体没有发生降解。将Flag-JWA（WT）和Flag-JWA（K158R）突变体转染到BGC823和SGC7901细胞中,再用CHX处理,结果显示Flag-JWA（K158R）突变体比Flag-JWA（WT）更稳定。通过免疫共沉淀实验检测Flag-JWA的泛素化,发现Flag-JWA（K158R）突变体泛素化水平是Flag-JWA（WT）的35%。穿孔实验表明,转染Flag-JWA（K158R）突变体比转染Flag-JWA（WT）的HGC27细胞迁移减少40%。在BGC823和SGC7901细胞中高表达RNF185可以增加Flag-JWA（WT）的降解,但是不能增加Flag-JWA（K158R）突变体降解。穿孔实验表明,Flag-JWA（K158R）突变体也可以逆转由RNF185高表达所诱导的细胞迁移增加。7.在体内RNF185通过下调JWA表达而促进胃癌转移。利用慢病毒构建稳定高表达RNF185的BGC823细胞（LV-RNF185）和相应的对照细胞（LV-NC）,通过尾静脉将胃癌细胞注射小鼠体内。40天后,处死小鼠并且检查肺脏中肿瘤形成情况,结果显示LV-RNF185组比LV-NC组有更多和更大的肿瘤转移灶形成。肺组织切片的HE染色检查也显示LV-RNF185组小鼠中转移灶面积增加至LV-NC组的3.20倍。免疫组化实验显示LV-RNF185组中的JWA表达远低于LVNC组。结论:本研究首次证实RNF185可以通过泛素-蛋白酶体途径降解JWA促进胃癌转移,此外我们也发现JWA的泛素化位点是K158位点。本研究成果提示RNF185可以作为治疗胃癌转移的潜在新靶标。
任晓慧[3]（2017）在《铅致原代培养大鼠皮质神经细胞氧化应激损伤及JWA mRNA表达改变》文中认为铅是一种化学性质稳定的重金属毒物,神经系统是铅毒作用的重要靶器官。铅暴露可降低细胞中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶的活性及谷胱甘肽等抗氧化物质的含量,引起细胞氧化损伤,因此铅的神经毒性与氧化应激及其所致氧化损伤密切相关。JWA是活跃的环境应答基因,广泛参与调控多种环境因素诱导的氧化应激,保护细胞免受氧化损伤。目前尚未见JWA在铅毒性中作用的相关报道,本研究以体外培养的新生大鼠皮质神经细胞为研究对象,研究JWA在铅神经毒性中的表达变化及可能机制。目的:观察铅对大鼠大脑皮质神经细胞中各氧化应激指标以及JWA基因表达的影响,探讨JWA基因参与神经细胞铅氧化应激作用可能机制,为进一步从分子水平探讨铅的神经毒性机制提供新的线索和依据。方法:取新生24 h内的SD大鼠皮质神经细胞进行原代培养并用免疫细胞化学方法鉴定;将体外生长良好的皮质神经细胞,分别用终浓度为0μmol/L、31μmol/L、54μmol/L、92μmol/L、150μmol/L醋酸铅神经细胞维持培养液处理一定时间,MTT法检测细胞存活情况,并检测细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、过氧化氢酶（CAT）活力和谷胱甘肽（GSH）含量,QRT-PCR技术检测皮质神经细胞JWA mRNA的表达量。结果:（1）形态学观察和免疫组织化学鉴定发现,体外原代培养的皮质神经细胞在培养第7 d左右生长状态良好,神经细胞所占比例较高,可用于之后铅损伤模型的建立。（2）随着醋酸铅浓度的逐渐升高,培养的大鼠皮质神经细胞数量逐渐减少。染铅24 h和48 h,92μmol/L和150μmol/L醋酸铅组同其他剂量组间差异有统计学意义（P<0.05）,92μmol/L醋酸铅作用下平均OD值分别为0.218±0.008和0.181±0.006,而150μmol/L醋酸铅作用下平均OD值分别为0.199±0.008和0.166±0.009。筛选出醋酸铅的适宜作用浓度为92μmol/L,适宜作用时间为24 h。（3）不同浓度醋酸铅分别作用皮质神经元6 h、12 h、24h、48 h,SOD活力、CAT活力和GSH含量较对照组均有明显下降（P<0.05）,而MDA含量较对照组均有明显升高（P<0.05）,皮质神经细胞内SOD活力、CAT活力和GSH含量与染铅剂量呈负相关关系（P<0.01）,MDA含量与染铅剂量呈正相关关系（P<0.01）。（4）随着铅含量的升高,各铅处理组细胞JWA mRNA的表达水平呈逐渐下降趋势（P<0.05）;铅处理的同时加入适当的超氧化物歧化酶,JWA mRNA的表达量差异无统计学意义（P>0.05）,而铅处理同时加入适量的过氧化氢酶,JWA mRNA的表达量升高,且差异有统计学意义（P<0.05）;JWA mRNA表达量与SOD活力、CAT活力和GSH含量呈正相关关系,与MDA含量呈负相关关系（P<0.01）。结论:铅暴露可导致原代培养的大鼠皮质神经细胞发生氧化应激损伤并影响基因JWA的表达。
钱婧[4]（2015）在《JWA调节HER2阳性胃癌细胞迁移的分子机制及临床意义研究》文中指出背景与目的:肿瘤转移,作为恶性肿瘤的重要生物学特征之一,是一个复杂的多步骤过程,包括肿瘤细胞脱离原发灶,浸润周围组织,进入到循环系统中,逃避免疫监督,游出脉管系统、定植到靶器官并不断增殖而形成转移灶等。在这一过程中肿瘤细胞的迁移能力几乎贯穿于肿瘤转移的各个过程,是肿瘤转移的限速步骤。迁移又分为定向迁移和非定向迁移。定向迁移,即趋化运动,在肿瘤细胞的转移和侵袭中起重要作用。人类表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor-2,HER2）,是表皮生长受体家族成员之一,HER2阳性（过表达或扩增）的乳腺癌,易进展、侵袭性强,预后差。但靶向治疗药物曲妥珠单抗的应用显着提高了患者的总生存时间及无病生存时间。此外,HER2阳性亦发生于10-30%的胃癌中,HER2过表达在胃癌细胞中也被观察到与转移表型密切相关。尽管HER2过表达在胃癌患者亦可从曲妥珠单抗中获益,但其反应率仅约乳腺癌患者的一半,这可能与胃癌的异质性及其特殊的分子基因谱及调节网络有关,因此研究HER2阳性胃癌的转移机制将有助于为抗肿瘤新药的研发提供思路。JWA,作为一种微管相关蛋白（MAP）,通过直接与微管蛋白结合来调节其动力稳定性,参与细胞凋亡过程。此外,最近的研究表明,JWA可能作为一种抑癌基因,影响转移的多个步骤。在黑色素瘤中,干涉JWA后,肿瘤细胞的迁移、粘附、侵袭、新生血管生成都显着增强。此外,之前研究证实,JWA参与三氧化二砷（As2O3）和佛波酯（PMA）对宫颈癌细胞迁移及细胞骨架的调节。然而,JWA对肿瘤细胞迁移行为的生物学作用、机制及其临床应用价值未完全阐明,尤其是HER2阳性胃癌中暂无人报道。本研究旨在将JWA与EGF诱导的肿瘤细胞趋化运动相关联,探讨其对胃癌细胞迁移能力的影响,初步明确JWA在HER2阳性胃癌细胞趋化运动中的作用机制。同时研究JWA对HER2阳性胃癌患者的临床价值。方法:本研究选用NCI-N87及HGC-27细胞作为HER2阳性的胃癌细胞模型,分别过表达和干涉JWA表达,结合多种分子生物学手段,具体方法如下:1.用EGF诱导的趋化运动实验检测JWA高、低表达对胃癌细胞的运动能力影响。用鬼笔环肽-FITC染色后进行免疫荧光实验,检测EGF刺激后JWA对纤维状肌动蛋白（F-actin）分布及聚合的影响。2.采用Ed U实验检测JWA表达对细胞增殖能力的影响。3.实时定量PCR及Western Blotting方法检测JWA对HER2、EGFR和ERBB3总蛋白和磷酸化蛋白、m RNA水平的影响。采用Western Blotting检测HER2下游的PI3K/AKT信号及MEK/ERK信号的活化程度,用磷酸化抗体采用磷酸化PAK抗体及G-LISA实验检测控制细胞运动的关键激酶Rac1/Cdc42与PAK1的激活。采用HER2低表达质粒及特异性抑制剂回复HER2水平后,采用Transwell、免疫荧光实验、G-LISA实验、Western Blotting方法检测HER2蛋白及其下游通路、细胞迁移能力的改变。4.实时定量PCR检测JWA缺失细胞中HER2上游转录因子m RNA水平的改变。采用Western Blotting、浆核分离方法验证JWA缺失或多表达后PEA3总蛋白及核蛋白水平的改变。荧光素酶报告基因实验及凝胶迁移阻滞实验（EMSA）检测JWA对PEA3与HER2启动子的结合能力及HER2启动子转录活性的调节作用。用si RNA沉默PEA3后采用Western Blotting、Transwell、G-LISA实验验证PEA3在JWA介导的HER2调节及迁移抑制中的作用。5.用荧光素酶报告基因实验及Western Blotting实验结合MEK抑制剂及PI3K抑制剂检测JWA调节PEA3活化的机制。6.在HER2阴性BGC-823细胞中Western Blotting、Transwell方法检测JWA是否抑制EGF诱导的细胞迁移及HER2、PEA3表达。7.在10对新鲜胃癌及癌旁组织中Western Blotting方法检测JWA与HER2的相关性。8.利用由128例晚期胃癌患者组成的组织芯片进行免疫组化,进一步明确JWA与HER2表达的相关性、两者与临床病理特征的关系及其临床预后意义。结果:本研究通过证实了:1.JWA抑制EGF诱导的细胞迁移和肌动蛋白细胞骨架重排。当过表达JWA时,EGF诱导的细胞迁移作用明显减弱,肌动蛋白细胞骨架重排减弱,板状伪足及丝状伪足的伸展受限,但在无EGF作为趋化因子时,JWA对迁移的抑制作用并不明显。2.Ed U实验显示JWA对增殖作用不显着。排除了增殖对迁移能力的影响。3.JWA对EGF诱导的细胞迁移的抑制作用依赖于JWA对HER2表达的抑制及其下游的PI3K/AKT信号的调节,从而减弱Rac1/Cdc42与PAK1的激活,影响细胞运动。但对EGFR和ERBB3无明显调节作用。4.HER2负性转录因子PEA3的激活是JWA介导的HER2下调所必须分子。与载体对照组相比,过表达JWA组细胞HER2的转录因子PEA3 m RNA水平上调,核内蛋白水平增加,PEA3与HER2近端启动子的结合能力增强,HER2启动子的活性显着减弱,但突变PEA3与HER2近端启动子的结合位点后,HER2启动子的活性虽明显减弱,但过表达JWA对HER2启动子活性无明显影响。在过表达JWA的细胞中沉默PEA3后,可部分回复JWA所致的迁移抑制作用及几乎完全恢复HER2蛋白的下调。5.JWA调控的PEA3/HER2需要ERK活化。JWA可激活MEK/ERK通路,从而维持PEA3蛋白表达,并活化其功能。使用MEK抑制剂处理过表达JWA的细胞后,可显着阻碍PEA3的表达,部分回复JWA抑制的HER2启动子活性。MEK抑制剂处理细胞,AKT磷酸化水平增强,但JWA过表达可部分减弱这种增强效应;而PI3K抑制剂明显减弱ERK磷酸化。这表明,JWA可依赖或不依赖PEA3/HER2来调节细胞运动。6.在HER2阴性BGC-823细胞中,JWA不影响HER2表达。尽管JWA仍然影响其迁移能力,但是JWA对HER2表达和活化的影响很小。但是当外源性过表达HER2后,过表达JWA组的HER2蛋白水平较对照组明显降低,其抑制的程度随外源性HER2表达水平升高而增加,表明JWA对HER2的调节是细胞特异的,它可能依赖于细胞HER2的水平。7.10对新鲜胃癌及癌旁组织中Western Blotting方法检测JWA与HER2显示出负相关关系。8.由128例晚期胃癌患者组成的组织芯片中,HER2和JWA蛋白表达之间显示出明显负相关性关系。JWA和HER2的表达都与组织学类型、淋巴结转移、肝脏转移有关。JWA低表达是晚期胃癌一个独立的不良预后因素,但在研究的总人群中HER2过表达不是一个独立预测因子。根据JWA和HER2的染色得分,患者可分为3组:两者均高或均低表达,JWA高且HER2低表达,低JWA且高HER2,患者JWA低表达且HER2高表达表现出比其它两组更差的预后。调整其他危险因素后,JWA和HER2的组合仍然是晚期胃癌一个强有力的预后标志。当用JWA表达水平（JWA低表达或高表达）分层,对于JWA低表达组,HER2高表达的患者较HER2低表达的患者表现出显着更短的生存时间。但在JWA高表达的患者中,HER2阳性和阴性组的生存时间间未见统计学差异。结论:综上所述,JWA可通过介导MEK/ERK/PEA3信号的激活,下调HER2的表达,调节HER2阳性胃癌细胞的运动。此外,JWA也可作为晚期胃癌一个有用的预后标记物,帮助分层HER2阳性患者的亚组,以便更好地识别不利的预后,及时予以个体化治疗。这项研究阐明了一个新的HER2上游调控因子JWA及其与HER2所致的迁移行为的关系,并初步探索了JWA调节HER2的分子机制,发现了JWA在HER2阳性患者的晚期胃癌中的预后价值,为抗转移药物提供新的靶点和新的预测因子。
吴郁[5]（2011）在《DNA修复蛋白JWA在小鼠衰老中的作用及机制研究》文中研究指明随着人口年龄结构改变,老龄化趋势日益凸显。由于人口老化带来生产力下降,并增加罹患年龄相关疾病如癌症及神经退行性疾病的风险,人口老龄化问题已经引起全世界范围的关注。在细胞及分子水平上,老化是损伤和修复间平衡的结果。损伤随着年龄的增长不断积累,而对损伤进行修复的效率却不断下降,并最终导致组织器官功能的改变或丧失。机体针对不同损伤类型存在许多种修复途径,包括碱基切除修复、核苷酸切除修复、非同源末端连接及同源重组等。这些通路中基因功能的突变或缺失通常导致早衰。JWA是一种广谱的环境应答基因,在多种应激条件下JWA表达升高。前期的研究已证实JWA参与氧化应激诱导的DNA损伤修复；在氧化应激条件下,JWA从细胞浆易位到细胞核,而且和XRCC1和LIG3共定位；在氧化应激诱导的BER修复过程中,JWA正调控XRCC1, LIG3的表达。之前的结果提示我们JWA是一个潜在的DNA损伤修复分子,但JWA是否参与DNA双链损伤修复,在整体水平上JWA具有什么样的生理功能如是否参与调控机体老化我们依然不知道。目的：探讨JWA是否更广泛的参与DNA损伤修复并从整体水平上影响机体的各项生命进程,从而为更加深入的了解JWA的功能提供新的科学依据。方法：采用VP16和CPT处理细胞产生DNA双链损伤,检测JWA的表达及其细胞内定位情况；采用基于Cre-LoxP条件性基因剔除策略构建全身性JWA基因剔除小鼠；使用PCR、RT-PCR、基因测序及蛋白印迹从DNA、RNA及蛋白水平上鉴定JWA基因剔除小鼠基因型；采用肉眼观察、生长队列观察、体重测量等观察JWA基因剔除对小鼠基本指标如寿命、体重、外观的影响；采用X线摄影、显微摄影技术（Micro-CT）、HE染色等分析JWA基因缺失对小鼠不同组织器官病理形态的影响；采用FACS及ELISA分析JWA基因缺失对免疫功能细胞及生长因子水平的影响；采用开阔场实验评估JWA基因缺失对小鼠活动能力的影响；采用SA-β-gal分析及流式分析术分析JWA基因缺失对细胞衰老的影响；采用基因芯片技术分析JWA基因缺失对基因表达谱的影响；采用寡核苷酸依赖的转录因子活性分析技术分析JWA基因缺失对转录因子活性的影响；采用生物信息学工具GSEA、DAVID及oPOSSUM分析JWA基因缺失基因表达谱中基因集富集情况、GO分布情况；我们进一步采用EMSA、Q-PCR、报告基因、免疫印迹及免疫沉淀等方法检测JWA对NF-κB信号通路的影响。结果：1.VP16及CPT诱导JWA表达分别升高2.4和2.3倍（P<0.05）,部分JWA蛋白在DNA损伤过程中从胞浆易位到胞核,进入细胞核的JWA与DNA损伤位点共定位,免疫荧光实验发现细胞损伤越重,进入细胞核的JWA越多。2.通过基因型鉴定表明采用Cre-LoxP基因剔除小鼠策略可以成功获得JWA基因第二外显子剔除的JWA基因缺失小鼠。3.JWA基因剔除小鼠提早出现体重减轻（P<0.05）、骨骼畸形（JWA+/+小鼠侧弯Cobb’s角为6.5±1.2,JWA-/-小鼠侧弯Cobb’s角为25±2.5,P<0.001。而JWA+/+小鼠后凸Cobb’s角为32.7±1.6,JWA-/-小鼠后凸Cobb’s角为80.7±5.8,P<0.001）、骨质疏松（JWA-/-小鼠骨密度为635.56±25.5mgHA/ccm,而JWA+/+小鼠骨密度为662.43±15.67mgHA/ccm,P<0.05）、皮下脂肪层及免疫器官萎缩、活动能力下降（JWA-/-小鼠在10 min内跑动的距离为29.5±17.21m,JWA+/+小鼠为62.3±23.99m,P=0.012）、IGF-1水平降低及寿命缩短（JWA-/-小鼠一年生存率为22.7%,与JWA+/+小鼠相比,P=0.0003）等表型。4.JWA基因剔除小鼠肝脏组织中β-Gal染色阳性细胞比例为10.6±2.6%,而JWA+/+肝脏衰老细胞比例为0.29±0.49%,P<0.01;P6代JWA-/-MEF细胞中衰老细胞的比例为27.4±2.7%,而JWA+/+细胞中比例为17±2.4%,P<0.01；JWA基因缺失MEF细胞G2期细胞比例为22.4±2.8%,比例显着高于JWA+/+细胞中的比例12.8±0.7%,P<0.05；JWA基因缺失MEF细胞中凋亡细胞所占的比例为2.3±0.67%,明显低于JWA+/+MEF细胞中的比例6.27±1.12%,P<0.01；p53、p16、p21等分子在JWA基因缺失的肝脏及MEF细胞中表达升高；高通量分析结果显示部分衰老相关分泌因子在JWA基因缺失小鼠的脾脏、肝脏及MEF细胞中表达上升。5.彗星实验发现损伤细胞的比例在JWA基因缺失的原代脾脏细胞及MEF细胞中增多；JWA基因缺失小鼠中端粒酶活性水平下降但JWA基因缺失不影响体内活性氧族生成。6. GSEA分析发现NF-κB及E2Fs转录因子下游基因在JWA基因缺失的脾脏中富集,p值均小于0.01,leading edge分析显示大部分NF-κB的靶基因在JWA基因缺失后是上调的,而大部分E2Fs的靶基因则是下调的。7. OATFA分析发现一系列转录因子的活性在JWA基因缺失的肝脏组织中发生改变,进一步运用oPOSSUM分析发现在这些转录因子中,NF-κB转录因子（Rela, c-Rel）可能起着重要作用。8.DNA损伤状态下,JWA基因缺失细胞中NF-κB的转录活性增强,表现为报告基因活性增强、靶基因Bcl-xL、Icam1、IL1a、Nfkb1、Nfkb2及Nfkbia表达上调,而恢复JWA表达可有效逆转靶基因Icam1、IL1a及Bcl-xL的表达。JWA与IKKβ形成复合物,在DNA损伤的情况下两者的相互作用明显增强。干涉p65的表达可逆转氧化应激所致JWA基因缺失MEF细胞的细胞衰老。而且,DNA损伤状态下,JWA基因缺失增加细胞内的糖基化水平。抑制细胞糖基化,逆转DNA损伤状态下JWA基因缺失所致的NF-κB信号通路的激活。结论：基于JWA广泛地参与多种类型的DNA修复过程,本实验通过Cre-loxp条件性基因剔除策略,成功构建了条件性JWA基因全身剔除小鼠,首次发现.JWA基因剔除小鼠出现早衰,这可能是JWA基因缺失导致DNA损伤积聚,端粒酶活性降低并激活NF-κB信号通路和引起细胞衰老导致的。我们的工作为全面认识JWA的生理功能提供了新的科学依据,也将为衰老的干预提供新的潜在靶点。
张燕[6]（2009）在《JWA通过线粒体凋亡通路影响肿瘤细胞耐药性》文中研究说明在肿瘤治疗中,化疗占据了相当重要的位置,但肿瘤细胞的耐药大大降低了化疗药物的疗效,导致化疗失败,肿瘤复发。目前有关耐药机制还不完全清楚,主要与以下几个方面有关:（1）药物外排作用相关蛋白表达增强,其中P-糖蛋白最为经典;（2）在细胞凋亡途径中任何一个环节的异常都将影响化疗药物的效果;（3）抗肿瘤药物能够引起MAPK信号转导系统的激活及肿瘤多药耐药性（MDR）的产生;（4）其它,如肿瘤细胞损伤后自我修复能力增强,肿瘤细胞解毒系统增强,肿瘤新生血管的形成等。最近的研究表明细胞凋亡和抗凋亡的关键途径的异常是肿瘤耐药发生和发展的关键因素之一,使得肿瘤耐药和细胞凋亡的研究更加引人注目。近几年来,随着分子机制研究的深入,基因技术已应用于多种肿瘤的研究中,应用基因治疗来逆转肿瘤的多药耐药性已成为一种可能。JWA基因编码一种新的微管相关蛋白（microtubule-associated protein,MAP）,该蛋白不仅参与多条分化和/或凋亡所涉及的信号通路,参与细胞对刺激的应答,同时也参与细胞凋亡的调节。基于细胞凋亡与肿瘤多药耐药性的密切关系,我们推测JWA可能通过调节肿瘤细胞的凋亡过程,从而影响其多药耐药性的产生。本研究采用细胞分子生物学实验技术,以人绒毛膜癌JAR细胞及其耐药细胞JAR/VP16为模型,探讨JWA参与细胞耐药可能的机制,为其逆转肿瘤的耐药性提供实验依据。另外,还初步阐明了JWA参与耐药的信号转导通路,为进一步阐明JWA基因的结构、功能及其相互关系奠定基础。一、JWA是VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡的必需分子用Hoechst 33258染色和Annexin V-PE流式细胞术两种方法测定VP16诱导JAR、JAR/VP16细胞凋亡,结果发现细胞凋亡率随VP16浓度的增加而增加,JAR细胞凋亡率明显高于JAR/VP16细胞。同时应用Western Blot检测JWA蛋白表达,发现JWA蛋白在JAR细胞中的表达明显高于在JAR/VP16细胞中的表达。提示JWA可能与细胞凋亡有关。为了探讨JWA是否为VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡的必需分子,我们成功构建了JWA低表达细胞株（siJWA-JAR）,采用Annexin V-PE流式细胞术检测1×10-3 g/L VP16处理JWA低表达细胞株48 h后的凋亡率,结果发现与空转组相比,凋亡率明显下降。提示JWA确实参于VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡过程。二、JWA通过线粒体通路调节VP16诱导的细胞凋亡为进一步探讨JWA调节VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡的机制,我们首先需要了解JWA的作用与哪条凋亡通路有关。通过检测VP16处理对照细胞C1-JAR和siJWA-JAR中特异性天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶Caspase-8,Caspase-9的差异,发现Caspase-9在siJWA-JAR中剪切片段显着减少,而Caspase-8无显着变化,说明JWA在VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡中主要通过Caspase-9通路（即线粒体通路）而非死亡受体通路。进而应用罗丹明123标记,流式细胞仪检测VP16处理C1-JAR和siJWA-JAR后线粒体膜电位变化的差异。在siJWA-JAR中,VP16诱导的线粒体膜电位损伤被明显抑制,从而进一步证明JWA是通过线粒体通路影响VP16诱导细胞凋亡的。三、JWA对VP16诱导细胞凋亡信号分子的影响用1×10-3 g/L VP16处理JAR、JAR/VP16、C1-JAR和siJWA-JAR 48 h,采用Western Blot检测MAPK信号分子的变化。结果发现,JAR/VP16和siJWA-JAR细胞中P38、JNK的磷酸化几乎被完全抑制;而它们的本底水平（非磷酸化分子）无明显变化,表明JWA与P38及JNK细胞凋亡信号分子有关。四、JWA通过JNK通路调节P-糖蛋白（P-gp）的表达为了深入探讨JWA是否通过JNK通路调节P-糖蛋白的表达。用1×10-3 g/L VP16处理JAR、JAR/VP16、C1-JAR和siJWA-JAR 48 h,采用Western Blot检测p-JNK、p-c-Jun和P-gp蛋白的表达情况,结果发现,JAR/VP16和siJWA-JAR细胞中,JNK和c-Jun的磷酸化几乎被完全抑制;而P-gp表达增加。为了进一步确定JNK能否调节P-gp的表达,我们采用20 nM SP600125作用于JAR和JAR/VP16细胞48 h后,SP600125抑制了p-JNK、p-c-Jun的表达,而P-gp表达增加。说明JWA确实通过JNK通路调节P-糖蛋白的表达。综上所述,本研究发现:（1）在JAR和JAR/VP16细胞中,JWA能调节VP16引起的线粒体损伤,从而引起一系列凋亡相关信号转导的发生;（2）JWA是VP16活化P38,JNK通路且与线粒体膜电位,Caspase-9活化密切相关的重要分子。JWA参与VP16诱导凋亡的信号通路可能为:VP16→JWA→MAPK家族（P38,JNK）→线粒体膜电位→Caspase-9→凋亡。（3）P-糖蛋白的表达可能受JWA的调节,通过JNK信号通路,影响转录因子c-Jun的活性,从而调节P-糖蛋白的表达。JWA参与调节P-糖蛋白的信号通路可能为:JWA→JNK→c-Jun→P-gp。
梁盈[7]（2008）在《维甲酸诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中核基质蛋白的变化研究》文中研究指明本论文以维甲酸（retinoic acid,RA）处理人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,鉴定RA对人神经母细胞瘤细胞的终末分化诱导效果。在此基础上,综合应用亚细胞蛋白质组学分析、免疫细胞化学、细胞分子生物学等技术,对在SK-N-SH细胞诱导分化过程中核基质蛋白的变化进行了较为系统的研究。分析鉴定和确证了与神经母细胞瘤细胞增殖分化相关的特异核基质蛋白,并研究特异核基质蛋白与人神经母细胞瘤细胞相关癌基因、抑癌基因在细胞内的共定位关系与变化,探索它们在神经母细胞瘤细胞诱导分化过程中的调控作用,以期能够在较为整体水平上进一步认识神经母细胞瘤细胞癌变与逆转机理问题,从而找出神经细胞增殖与分化相关的靶向性蛋白。实验结果显示,经1μmol/L RA处理之后,人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的增殖受到抑制,细胞生长抑制率达57.93%,细胞发生了G0/G1期阻滞。光镜和电镜观察结果显示,经1μmol/L RA处理后的SK-N-SH细胞形态和超微结构发生恢复性变化,细胞呈极性状、伸出多个轴突树突状突起、细胞逐渐变小变圆并融合在一起形成类似神经节样结构,并出现核质比例减小,细胞体积减小,细胞表面微绒毛减少,细胞核形态趋于规则、核仁数目减少,细胞核内异染色质减少、常染色质增多,细胞内线粒体和粗面内质网增多、高尔基体结构更为典型等变化;免疫细胞化学检测结果显示,经RA诱导处理后,SK-N-SH细胞内癌基因c-myc、c-fos表达产物减少,抑癌基因p53、p27表达产物增多;同时,RA能够促进SK-N-SH细胞的神经元特异性标志物NSE、Synaptophysin、MAP2的表达。选择性抽提整装光镜和电镜观察显示,经RA处理的SK-N-SH细胞核基质纤维和中间纤维数量和层次更加丰富,分布更为均匀,单丝成份增多,与核纤层联系更为紧密,形成贯穿整个核质区域的较为规则的纤维网络。双向凝胶电泳与MALDI-TOF质谱分析共鉴定出41个在RA诱导分化前后表达差异的核基质蛋白,其中在分化的SK-N-SH细胞中表达上调的蛋白点为:Vimentin、MTMR2、SUMO-3等;表达下调的蛋白为TRPV2、Nucleophosmin、Prohibitin等;处理后消失的蛋白为ATP synthase beta chain、PSB3;处理后新出现的蛋白为LGI1、SYCE1。蛋白质印迹杂交与免疫荧光显微镜观察确证了Nucleophosmin（NPM）、Prohibitin（PHB）、Vimentin和hnRNP A2/B1在SK-N-SH细胞分化过程中的表达变化及其在核基质上的定位。激光共聚焦显微镜观察显示NPM、PHB和hnRNP A2/B1与癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内均存在一定的共定位关系,并且它们的表达水平和细胞定位在诱导分化前后均发生了改变。激光共聚焦显微镜观察结果还显示NSE、SYP和MAP2与癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内也存在一定的共定位关系,它们的表达水平和细胞定位在诱导分化前后也发生了变化。研究结果表明,1μmol/L RA能有效抑制人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的增殖活动,改变SK-N-SH细胞形态与超微结构特征,下调癌基因c-myc、c-fos和上调抑癌基因p53、p27等的表达,从而对人神经母细胞瘤细胞的分化具有显着诱导效果。在SK-N-SH细胞分化过程中,其核基质-中间纤维系统构型产生了与正常细胞相似的恢复性变化,并且出现了多种差异表达的核基质蛋白,其中NPM、PHB、Vimentin和hnRNP A2/B1为不同诱导分化物诱导多种肿瘤细胞分化后出现的共同差异核基质蛋白。而功能性共同差异核基质蛋白NPM、PHB、hnRNP A2/B1和神经元特异表达标志物NSE、SYP、MAP2与c-Myc、c-Fos、P53、Rb等均存在共定位关系并在SK-N-SH细胞分化过程中出现分布和位移变化的现象。由此证实了RA能够干预SK-N-SH细胞相关癌基因、抑癌基因的活性,改变一些与基因表达调控和细胞信号转导相关的重要核基质蛋白的表达,进而阻滞细胞周期,促使人神经母细胞瘤细胞分化。这为我们在较为整体的水平上深入研究肿瘤细胞诱导分化的调控机制以及阐明细胞癌变与逆转机理提供了科学依据和探索研究的新方向,并为神经母细胞瘤的诊断和抗癌药物的研究提供了新的靶向性蛋白。
李春平[8]（2008）在《一、JWA基因多态性与膀胱癌易感性的关系及其功能研究 二、dJWA与果蝇酒精耐受关系的研究》文中进行了进一步梳理膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤。近年来,全球膀胱癌发病率呈上升趋势,尤其在中国,其上升趋势更为明显。膀胱癌形成是一个多因素和多阶段的过程,是环境危险因素和遗传因素共同作用的结果。流行病学调查显示,环境危险因素的暴露在膀胱癌发病中具有重要的作用。尽管很多人接触相同的致癌危险因素,但仅有少数人最终发生膀胱癌,提示人群中存在肿瘤易感性。国内外大量研究发现肿瘤易感性可能和多种基因多态性相关。JWA（GenBank:AF070523,1998）是周建伟等从培养的原代人气管和支气管上皮细胞中分离并克隆的,受ATRA诱导的新的细胞骨架样基因。本课题组多年来一直围绕JWA基因的结构、功能及其相互关系开展研究工作,取得了一系列原创性有意义的研究成果。先后证实JWA是一种新的微管相关蛋白（microtubule-associated protein,MAP）,不仅参与全反式维甲酸（ATRA）诱导的细胞分化调节,而且与多种细胞分化、凋亡诱导剂（如TPA,4HPR和As2O3等）的生物学作用有关,涉及相应的信号通路,而且活跃地参与细胞对应激刺激（如冷应激和热应激）的应答。Ingley等发现了第一个与JWA同源的基因ARL-6（AF133912）。两者氨基酸序列同源性达93%,而该基因的作用主要涉及PARP与DNA损伤和修复。本课题组最近的研究表明细胞内JWA的表达对于其抵抗氧化应激造成的DNA损伤有一定的保护作用,并且JWA是XRCC1和PARP1的上游调节因子,可能参与氧化应激诱导的碱基切除修复过程,其功能与调节细胞内XRCC1-PARP1信号通路有关;另外,JWA参与了MAPK信号通路,与细胞的迁移和运动有关,而细胞迁移是恶性肿瘤细胞浸润和转移的必要条件。这些结果强烈提示JWA可能是参与调节肿瘤细胞分化的重要信号分子,是一个潜在的抑癌基因。本研究主要用PCR-SSCP方法鉴定了JWA基因的四个多态性位点,并在膀胱癌病例-对照研究中分析JWA基因多态性与膀胱癌危险性的关系,以及JWA基因在膀胱和膀胱癌组织中的表达水平。初步探讨了JWA-76G＞C变异可能影响的转录因子,为最终阐明和完善JWA基因作为潜在的抑癌基因这一假设提供新的证据。一、JWA基因多态性位点的鉴定及-76G＞C变异的功能分析本研究在100名正常的中国汉族人群中,用PCR-SSCP方法筛选、鉴定JWA基因的多态性位点。结果证实了两个SNPs（723T＞G,rs7038and 454C＞A,rs10489）并且发现了另外两个新的SNPs（-76G＞C and380G＞A）。报告基因结果显示,变异的-76C等位基因型报告基因在不处理或B（a）P处理后,与-76G等位基因型的报告基因相比,其转录活性分别下降了4倍或12倍多。为了证明JWA基因是否在翻译水平应答B（a）P,我们用Western blot方法检测了B（a）P处理前后NIH-3T3细胞中JWA表达水平。结果发现B（a）P暴露能显着诱导JWA蛋白表达增加。这些结果提示-76C变异使得JWA对B（a）P引起的活性氧刺激不应答。我们还在不同种族人群中检测了-76G＞C多态性位点的基因型和等位基因分布频率,发现该位点基因型和等位基因频率有种族差异。二、JWA多态性与膀胱癌危险性的关系在膀胱癌病例-对照研究中,我们发现-76G＞C变异和454C＞A变异都能显着增加膀胱癌危险陛,而723T＞G变异则与膀胱癌危险性降低有关。连锁不平衡分析显示-76G＞C和454C＞A两个多态性位点是连锁不平衡的,在做单倍体型分析后,发现随着变异等位基因数的增加,膀胱癌危险性也随着显着增加。进一步分层分析结果显示,膀胱癌发生危险性在高年龄组、吸烟人群组和饮酒人群组都更加明显。鉴于-76G＞C变异有一定的功能作用,能影响JWA基因对氧化应激的应答水平,我们检测了该多态性位点与吸烟╱饮酒之间有无基因-环境交互作用;结果提示携带-76GC基因型的吸烟者或饮酒者膀胱癌危险性显着增加,然而,在基因-环境交互作用的分析中,我们未发现它们之间作用有统计学意义的证据,这可能受到本研究效率的限制。为了检测-76G＞C变异是否会影响组织中JWA的蛋白表达水平,我们运用免疫组化方法在JWA-76G＞C不同基因型的膀胱组织或膀胱癌组织中检测JWA蛋白的表达水平,结果发现-76GG基因型的组织JWA蛋白水平明显高于-76GC基因型的组织。这些结果提示JWA作为一个潜在的抑癌基因,其多态性位点与膀胱癌易感性有密切联系。三、初步鉴定JWA-76G＞C变异影响的转录因子我们首先用Alibaba 2软件对-76G＞C多态性位点所在的DNA序列进行转录因子结合基序预测,结果提示76G＞C变异可能使的原C/EBPα结合位点变成了C/EBPβ结合位点,进一步采用胶泳动率迁移实验（EMSA）证实,在H2O2和B（a）P处理组,均发现有核蛋白和-76GG探针结合。用Southwestern实验证实,此核蛋白的分子量为43 kD左右。初步确认JWA-76GΚC变异影响的转录因子为C/EBPα。四、构建JWA -76GC或-76CC基因型的正常细胞株为了进一步探讨JWA基因-76GΚC多态性变异在细胞中的作用,我们拟构建JWA -76CC或-76GC基因型的正常细胞株。经过多次改进实验技术和更换细胞株后,我们仍未能获得-76CC或-76GC基因型的正常细胞株。综上所述,本研究鉴定了JWA基因四个多态性位点:-76G＞C,380G＞A,454C＞A和723T＞G;对-76G＞C多态性的功能研究中发现,-76C变异能显着性降低JWA基因对氧化应激的应答,其机制可能是影响了核因子C/EBPα与JWA基因启动子的结合能力。在膀胱癌病例对照研究中发现,-76G＞C变异和454C＞A变异都能显着增加膀胱癌危险性,而723T＞G变异则与膀胱癌危险性降低有关。-76G＞C变异可引起膀胱癌组织中JWA蛋白水平降低。另外,由于种种原因,我们构建JWA -76GC或-76CC基因型的细胞株实验未能获得成功。酒精滥用已经是一个严重的公共卫生问题,不断的摄入酒精可导致酒精耐受,随后产生依赖性,最后成瘾。然而,酒精耐受和成瘾的机制还没有完全清楚。果蝇已经成为研究酒精耐受分子机制的常用动物模型。JWA,一个新的微管结合蛋白,参与调节细胞应激、细胞内氨基酸转运等。有研究提示该基因可能参与吗啡耐受和依赖的形成。本研究探讨了JWA是否参与果蝇酒精耐受的机制。我们首先确认了果蝇基因组的JWA同源基因,CG10373（dJWA）;然后用显微注射法构建了anti-dJWA和cDNA-dJWA果蝇种系。用RT-PCR和Real-time PCR方法检测了dJWA在不同果蝇种系的表达水平。最后用酒精蒸汽暴露装置检测了dJWA对果蝇酒精暴露产生急性耐受的影响。JWA基因结构上保守,人源性的JWA与果蝇dJWA有41.4%的氨基酸同源和53.6%的DNA序列同源。RT-PCR和Real-time PCR结果显示anti-dJWA和cDNA-dJWA果蝇种系构建成功。在果蝇醉酒实验中我们发现,w1118果蝇和cDNA-dJWA果蝇暴露于酒精蒸汽2次后就产生了酒精耐受现象,但是anti-dJWA果蝇却没有出现酒精耐受现象。同样,我们在果蝇酒精镇静复苏实验中也发现了anti-dJWA果蝇酒精耐受现象消失了,并且比其他两种果蝇对酒精更加敏感（第二次暴露后约有20%的果蝇死亡）。另外,我们发现酒精暴露前后乙醇脱氢（ADH）基因的mRNA水平没有显着性差异,而果蝇中dJWA低表达时,hangover基因的转录水平也下调了。综上所述,我们的结果提示果蝇的dJWA基因在酒精耐受过程中起重要作用。低表达dJWA的果蝇经过多次暴露于酒精蒸汽不能产生酒精耐受现象。结合先前的研究结果,我们认为JWA可能是酒精耐受和药物成瘾发生机制中的一个非常重要的功能性分子机制。本研究的结果为酒精耐受和成瘾相关的研究提供了新的思路。
唐剑[9]（2008）在《核基质蛋白在人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化过程中的变化研究》文中研究表明本研究以环六亚甲基双乙酰胺（HMBA）处理人肝癌SMMC-7721细胞,鉴定HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞的诱导分化效果。在此基础上,综合应用蛋白质组学、免疫细胞化学、细胞分子生物学等技术,对SMMC-7721细胞诱导分化前后核基质蛋白表达变化进行系统研究,分析鉴定和确证与肿瘤细胞增殖分化相关的特异核基质蛋白,并研究特异核基质蛋白与人肝癌细胞相关癌基因、抑癌基因产物在细胞内的共定位关系与变化,探索它们在肿瘤细胞诱导分化过程中的调控作用。以期能够在较为整体的水平上阐明肝癌细胞诱导分化的调控机制,并进一步认识细胞癌变与逆转机理和细胞增殖与分化的调控原理问题。实验结果显示,5 mmol/L HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖活动具有抑制作用,诱导处理7天后,细胞生长抑制率达50%,细胞倍增时间延长1.8倍,G0/G1期细胞比例由40.6%上升为70.6%,S期细胞比例由27.4%下降为6.9%,细胞周期被阻滞于G0/G1期;光镜和电镜观察结果显示,经5 mmol/LHMBA处理后的SMMC-7721细胞出现核质比减小,细胞体积增大,细胞表面微绒毛减少,细胞核形态趋于规则,核仁数目减少,核内异染色质减少,常染色质增多,线粒体嵴数目增多,内质网和高尔基体更为典型、发达等变化;免疫细胞化学检测结果显示,经诱导处理后,SMMC-7721细胞内癌基因c-fos、c-myc、c-erbB-2、bcl-2以及mtp53表达产物减少,抑癌基因Rb、p21、p27表达产物增多;选择性抽提整装光镜和电镜观察显示,经HMBA处理的SMMC-7721细胞核基质纤维和中间纤维数量和层次更加丰富,分布更为均匀,单丝成份增多,与核纤层连系更为紧密,形成贯穿整个核质区域的较为规则的纤维网络;双向凝胶电泳与MALDI-TOF质谱分析共鉴定出9个在HMBA诱导分化前后差异表达的核基质蛋白,其中表达上调的有4个,分别是p27BBP、BTF2-p44 subunit、tubulin beta 2C、sin3b;表达下调的有4个,分别是突变型pystl、DKFZp434K1815 variant、laminin-binding protein、nucleophosmin:新出现的一个蛋白是SFRS1;蛋白印迹杂交、免疫荧光显微镜和免疫胶体金标记电镜观察确证了nucleophosmin和prohibitin在SMMC-7721细胞诱导分化前后细胞核基质中的表达变化及其在核基质上的定位;激光共聚焦显微镜观察显示nucleophosmin和prohibitin与癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内均存在一定的共定位关系,并且它们的表达水平和细胞定位在诱导分化前后发生了变化。研究结果表明,5 mmol/L HMBA能有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖活动,改变SMMC-7721细胞形态与超微结构特征,下调癌基因c-los、c-myc、c-erbB-2、bcl-2、mtp53和上调抑癌基因Rb、p21、p27等的表达,从而对人肝癌细胞的分化具有显着诱导效果。在SMMC-7721细胞分化过程中,其核基质.中间纤维系统构型产生了与正常细胞相似的恢复性变化,并且出现了多种差异表达的核基质蛋白,其中nucleophosmin和prohibitin为不同诱导分化物诱导多种肿瘤细胞后出现的共同差异核基质蛋白。而nucleophosmin和prohibitin与c-Myc、c-Fos、pRb、mtp53等均存在共定位关系并在SMMC-7721细胞分化过程中出现分布和位移变化的现象。由此证实了HMBA能够干预SMMC-7721细胞相关癌基因、抑癌基因的活性,改变一些与基因表达调控和细胞信号转导相关的重要核基质蛋白的表达,进而阻滞细胞周期,促使人肝癌细胞分化。这为我们在较为整体的水平上深入研究肿瘤细胞诱导分化的调控机制以及阐明细胞癌变与逆转机理提供了科学依据和探索的新方向,并为肿瘤的诊断和抗癌药物的开发提供潜在的靶向性蛋白。
陈海蓉[10]（2007）在《JWA调节肿瘤细胞迁移的分子机制》文中提出肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一，也是临床治疗的难题，其中细胞迁移是肿瘤浸润和转移的必备条件。目前，对于调节细胞迁移和侵袭的相关机制仍知之甚少。细胞内细胞骨架蛋白的动态组装、细胞和细胞外基质之间的黏着变化、周围基质的重塑等以及这些反应在迁移侵袭过程中的协调都涉及复杂的信号调节。JWA（AF070523）基因是本课题组周建伟等发现并克隆的新基因，其编码蛋白是一种新的微管结合蛋白。那么，JWA基因是否涉及肿瘤细胞迁移和侵袭的相关分子机制呢?为此，本研究将致力于探讨JWA基因在人类肿瘤细胞迁移中的作用。目的探讨JWA基因在肿瘤细胞迁移过程中的作用以及相关的分子机制，为进一步深入了解肿瘤的发生、发展和预后，为肿瘤的预防、诊断和治疗提供新的科学依据。方法HeLa（人宫颈癌细胞）、B16（小鼠黑色素瘤细胞）以及HCCLM3（高转移潜能的人肝癌细胞）都是体外研究肿瘤细胞迁移和侵袭的良好实验模型。本研究利用这些细胞在特定的促癌或抑癌剂诱导下细胞骨架肌动蛋白丝重组和迁移能力改变的特性，建立系列体外迁移模型。细胞迁移能力从以下几方面进行评价：（1）通过观察细胞肌动蛋白丝的重组来评价肿瘤细胞迁移能力的改变；（2）通过划痕试验，检测细胞的不定向迁移来评价肿瘤细胞迁移能力；（3）采用穿孔试验，检测细胞的定向迁移来评价肿瘤细胞迁移能力。使用凝胶酶谱和Western blot方法检测JWA及FAK、COX-2等细胞迁移相关基因的表达。并且利用JWA反义寡核苷酸技术下调JWA的表达，以进一步探讨JWA基因在促癌或抑癌剂诱导细胞迁移中的机制。使用免疫荧光技术，探讨JWA在促癌或抑癌剂诱导下调控肌动蛋白丝重组的功能。结果（1） JWA是新的微管相关蛋白，为了解JWA是否类似于传统的MAP，具有肌动蛋白丝结合蛋白的功能，用JWA反义寡核苷酸处理细胞，经G418筛选后，得到稳定的JWA表达缺陷水平的HeLa细胞株（As-HeLa细胞），再观察对细胞肌动蛋白丝重组的影响。结果显示在稳定JWA表达缺陷的HeLa细胞株中，肌动蛋白丝开始重组，细胞的边缘随之伸出一些突触，提示JWA可能是微管和肌动蛋白丝结合蛋白，调节细胞骨架组装。（2）在此基础上，进一步利用促癌剂佛波酯（phorbol ester，PMA）和抑癌剂三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）分别诱导HeLa细胞株肌动蛋白丝重组的细胞模型：8 nM PMA分别处理细胞6，12和24h，免疫荧光显示，在稳定转染JWA空载体（HeLa-vector细胞）的细胞株中，PMA处理6h后，细胞边缘仍未发现突触的形成，肌动蛋白丝并未出现解聚，提示空载体细胞的肌动蛋白丝未发生明显的解聚聚合。而PMA处理12h后，观察到细胞学形态发生改变，肌动蛋白丝开始重组。同样的处理条件下，在稳定转染JWA表达缺陷载体的细胞株中，PMA处理6h后，细胞边缘伸出一定量的突触，提示肌动蛋白丝已经开始重组。PMA处理12h后，肌动蛋白丝发生更加明显的解聚聚合。与转染空载体的细胞相比，JWA表达缺陷的细胞肌动蛋白丝的重组明显加速。10μM As2O3处理细胞10，30和60min，免疫荧光同样观察到，JWA表达缺陷的细胞比空载体细胞提前出现肌动蛋白丝的解聚聚合，进一步提示JWA参与细胞肌动蛋白丝的重组过程，并且在促癌或抑癌剂诱导的细胞肌动蛋白丝的解聚聚合中起作用。（3）为了解JWA是否参与肿瘤细胞的迁移，HeLa细胞转染pEGFP-C1，pEGFP-C1-JWA或pEGFP-C1-AsJWA质粒，G418稳定筛选后，得到空载体，JWA高表达（HeLa-JWA细胞）和反义JWA稳定转染的细胞株，免疫印迹鉴定，建立划痕和细胞穿孔试验模型，观察JWA对细胞迁移能力的影响。在划痕模型中结果显示，JWA表达缺陷可促进细胞的伤口愈合，而JWA高表达则抑制伤口的愈合，表明JWA在细胞的非定向迁移中起作用。同样，细胞穿孔实验结果显示，JWA表达缺陷可促进细胞的迁移，而高表达的细胞则起抑制迁移的作用，表明JWA在细胞的定向迁移中起作用。我们用细胞穿孔模型检测了在HCCLM3和B16细胞株中JWA的作用，结果观察到类似的现象，进一步提示JWA在肿瘤细胞的迁移中起重要的作用，JWA可抑制细胞的迁移。（4）为建立As2O3诱导细胞迁移的模型，首先用细胞增殖分析试剂盒分析As2O3的细胞毒性。结果显示，不同浓度的As2O3处理空载体和反义JWA稳定转染的HeLa细胞48h后，有血清处理的细胞均出现明显的细胞毒性，2μM As2O3处理的HeLa细胞大约50％出现生长抑制现象；但在无血清的情况下，As2O3浓度低于2μM诱导并未观察到抑制增殖和促进凋亡现象。提示在有血清的情况下，As2O3细胞毒性更大，所以选择无血清状态下As2O3（1μM）作为模型药物用于研究细胞迁移。（5）不同浓度As2O3对细胞迁移作用有着不同的影响：用0.5，1和2μM As2O3处理空载体细胞0，1和2d后，划痕结果显示As2O3有显着抑制HeLa细胞伤口愈合的作用，且呈剂量依赖性关系。进一步研究发现，PMA（80 nM）能够显着增强As2O3抑制细胞迁移的作用，而对As2O3诱导的细胞凋亡和生长抑制没有显着影响。PMA（80 nM）与不同浓度的As2O3（0，0.5，1和2μM）序贯处理空载体细胞24h后，划痕试验结果显示As2O3呈剂量依赖性的抑制PMA诱导的HeLa细胞的伤口愈合。在相同的处理条件下，细胞穿孔试验也显示同样的结果。（6）为探讨JWA参与细胞迁移的调控机制，考虑到药物诱导迁移的有效性及对细胞的毒性作用，我们选用PMA（80 nM）与1μM As2O3序贯处理空载体和反义JWA稳定转染的HeLa细胞。结果表明PMA能够显着增强HeLa细胞的迁移能力，而As2O3则明显抑制PMA诱导的HeLa细胞迁移，JWA基因表达下调后，能显着减弱As2O3对HeLa细胞迁移的抑制作用，同时促进PMA诱导的细胞迁移，这些结果进一步证明JWA可能作为信号分子参与细胞迁移的信号通路调控。（7）在此基础上，为了解JWA是否为模型药物诱导的细胞迁移信号通路所必须，在上述药物诱导迁移的细胞模型中，用western blot检测丝裂原活化蛋白激酶信号通路（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路级联中各级信号分子，即Raf-MEK-ERK和其磷酸化的表达，结果显示在As2O3和PMA影响HeLa细胞迁移模型中，Raf-MEK-ERK信号途径被激活（即Raf、MEK、ERK磷酸化），JWA基因表达下调后，MEK和ERK不能被磷酸化，但Raf的磷酸化未受到影响，以上结果强烈提示JWA确有可能通过影响ERK信号通路而调控细胞迁移；其影响环节在于对MEK的调节；PKC可能作为JWA的上游调控因子之一，磷酸化JWA，影响ERK信号通路，进而调控细胞迁移。（8）为阐明JWA在模型药物激活的MEK-ERK信号通路中的作用，我们设计了JWA回复模型。JWA表达缺陷的HeLa细胞瞬转pEGFP-C1-JWA的质粒后得到JWA回复的HeLa细胞（As-HeLa-rescue细胞）。回复模型中，PMA（80 nM）加或不加As2O3（1μM）处理空载体和JWA回复的细胞24h后，用western blot检测Raf-MEK-ERK的磷酸化。结果显示，JWA回复细胞中，As2O3和PMA诱导的MEK-ERK信号途径被激活，MEK和ERK的磷酸化被回复，但Raf的磷酸化回复并未受到影响，进一步证明JWA通过MEK-ERK级联影响细胞迁移。（9） PMA和As2O3独立作用时均能激活MEK／ERK信号通路，但两者对HeLa细胞迁移的影响完全相反（PMA促进迁移，As2O3抑制迁移）。为了解JWA是否参与激活了ERK不同的磷酸化位点，进而激活其下游不同的底物，我们用western bolt检测了迁移模型中As2O3和PMA诱导的ERK下游不同的底物黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）和环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达。结果显示As2O3可下调FAK的表达水平而PMA可上调COX-2的表达水平。进一步检测JWA在PMA调节COX-2的表达和As2O3调节FAK表达中的作用，结果显示，在As2O3和PMA影响HeLa细胞迁移模型中，用PMA（80 nM）处理JWA表达缺陷细胞株后，其相应的ERK下游底物COX-2的表达水平显着上调。而As2O3（1μM）处理则引起其相应的ERK下游底物FAK表达的上调。这些结果证明JWA与PMA／As2O3激活的MEK-ERK通路，分别调节其相应的ERK下游底物COX-2／FAK的表达，最终引起迁移的不同效应。（10）用JWA回复模型进一步验证JWA在PMA调节COX-2的表达和As2O3调节FAK表达中的作用。用PMA（80 nM）加或不加As2O3（1μM）处理空载体和JWA回复的细胞24h后，用western blot检测COX-2和FAK的表达。结果显示，随着JWA表达水平的回复，COX-2和FAK的表达均被回复。以上结果提示JWA在PMA和As2O3诱导的MEK-ERK-下游底物通路中起重要作用。（11）为探讨JWA是否在MAPK级联中起类似激酶分子的作用，我们设计了系列JWA磷酸化位点突变体。利用基因突变技术，构建了JWA编码区PKC磷酸化位点1、2以及两位点同时突变的三种pEGFP-N1载体，稳定转染，获得相应的三种HeLa细胞株，分别命名为As-HeLa-P1，As-HeLa-P2和As-HeLa-P12细胞株。PMA（80 nM）加或不加As2O3（1μM）序贯处理JWA空载体和磷酸化位点突变细胞24h后，用western blot检测MEK，ERK和其相应的下游分子FAK和COX-2的磷酸化水平。结果显示在As-HeLa-P1 HeLa细胞中，As2O3和PMA仍可诱导MEK和ERK的磷酸化。PMA诱导的COX-2和As2O3诱导的FAK表达被回复。但在As-HeLa-P2 HeLa细胞中，MEK和ERK的磷酸化水平下降。有趣的是，在As-HeLa-P12细胞中，JWA磷酸化位点突变后，As2O3或PMA刺激均不能引起MEK和ERK的磷酸化。甚至，PMA诱导的COX-2和As2O3诱导的FAK表达水平均不能回复。但JWA磷酸化位点突变并不影响Raf的磷酸化。总之，这些结果说明JWA在As2O3和PMA引起的MEK-ERK通路中起重要作用，提示JWA在MAPK通路中可能是介于Raf和MEK的磷酸化底物。（12）为进一步证实JWA磷酸化在迁移中所起的作用，用PMA（80 nM）力口或不加As2O3（1μM）分别处理As-HeLa-P12和As-HeLa-rescue细胞后，细胞穿孔试验检测其迁移能力的改变。结果显示，在As-HeLa-rescue细胞中，As2O3和PMA诱导的迁移被回复，As-HeLa-P12细胞中结果则相反。因此，JWA蛋白磷酸化位点突变对调节细胞迁移起着重要的作用，但确切证据有待进一步研究提供。讨论JWA参与肿瘤细胞迁移的调节，是促癌或抑癌剂诱导细胞迁移信号转导通路中共同的信号分子，在MAPK信号通路以及肌动蛋白丝的重组过程中起重要的作用。JWA可能是细胞内控制肿瘤细胞转移新的分子标志物。JWA可以抑制HeLa，HCCLM3和B16等肿瘤细胞的迁移，可能在信号通路中同时调控微管和肌动蛋白丝两大细胞骨架系统，引起迁移。在HeLa细胞中，JWA通过调节细胞骨架肌动蛋白丝的重组抑制细胞的迁移；在抑癌剂As2O3和促癌剂PMA诱导的肌动蛋白丝的变化中，JWA均起重要的调节作用。JWA还参与MEK-ERK-下游底物的信号通路，可能通过激活ERK的不同磷酸化位点，使促癌或抑癌剂诱导的细胞迁移产生不同的终效应。JWA磷酸化在MAPK信号通路介导的细胞迁移中起重要作用，JWA表达与MEK和ERK的磷酸化有关，但不影响Raf，功能上类似于一个MAPKKK分子。对JWA基因功能深入、全面的探讨有助于我们进一步了解肿瘤的发生、发展和预后，为肿瘤的预防、诊断和治疗奠定理论基础。
二、Relationship between structure and function of JWA in the modulation of cell differentiation（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Relationship between structure and function of JWA in the modulation of cell differentiation（论文提纲范文）
（1）维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 维生素C性质及其生物学功能的研究进展 |
| 1.1.1 维生素C的发现、生物合成及利用 |
| 1.1.2 维生素C的运输及机体稳态调节 |
| 1.1.3 维生素C的抗氧化性 |
| 1.1.4 维生素C是二价铁离子和α-氧戊二酸盐依赖性双加氧酶家族蛋白的关键辅因子 |
| 1.1.5 维生素C促进细胞重编程 |
| 1.1.6 维生素C是一个低甲基化诱导因子 |
| 1.1.7 维生素C的潜在抗癌机制 |
| 1.1.8 维生素C与其他疾病的关系及潜在治疗作用 |
| 1.1.9 维生素C在调控细胞信号通路方面的初探索 |
| 1.1.10 维生素C已知的生物学功能具有两面性 |
| 1.2 钠离子依赖型维生素C转运蛋白SVCTs的研究进展 |
| 1.2.1 SVCTs的结构、定位和运输作用 |
| 1.2.2 SVCT1和SVCT2 表达和功能的调控 |
| 1.2.3 SVCT2 在调控细胞分化和细胞功能成熟中的作用 |
| 1.3 非受体型酪氨酸激酶JAK2 的研究进展 |
| 1.3.1 JAK激酶家族蛋白的结构和功能简介 |
| 1.3.2 JAK2 激酶活性的调控 |
| 1.3.3 非经典细胞核内JAK2 信号转导途径研究进展 |
| 第二章 维生素C转运蛋白SVCT2 受体功能的探究 |
| 2.1 材料、试剂与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 2.1.6 细胞培养 |
| 2.1.7 真核表达载体构建 |
| 2.1.8 细胞转染 |
| 2.1.9 免疫印迹 |
| 2.1.10 蛋白质免疫(共)沉淀(Immunoprecipitation (IP)/co-Immunoprecipitation (co-IP)) |
| 2.1.11 总RNA提取、反转录和实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR) |
| 2.1.12 双荧光素酶报告实验(Dual Luciferase Reporter Assay,DLR) |
| 2.1.13 细胞内VitC含量测定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SVCT2 响应VitC处理特异性激活JAK2和STAT2 |
| 2.2.2 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导与JAK2 的互作 |
| 2.2.3 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导对JAK2 的磷酸化激活 |
| 2.2.4 VitC对 JAK2 的激活与VitC的胞内积累无关且呈现振荡性 |
| 2.2.5 VitC诱导SVCT2 Tyr~(626)发生磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.6 SVCT2 Tyr626的磷酸化介导对 STAT2 的招募 |
| 2.2.7 SVCT2 响应VitC处理增强STAT2 的转录因子活性 |
| 2.2.8 SVCT2对JAK2 的激活依赖对VitC的运输 |
| 2.2.9 SVCT2对VitC的充分运输依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.10 DHA和 GLUT1/3 不能激活JAK2/STAT2 信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 VitC激活的JAK2 信号途径调节细胞内ROS的水平 |
| 3.1 材料、试剂与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与耗材 |
| 3.1.4 主要试剂配方 |
| 3.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 3.1.6 细胞培养 |
| 3.1.7 细胞转染 |
| 3.1.8 免疫印迹 |
| 3.1.9 细胞内ROS含量测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VitC对 JAK2 的激活与对 ROS的抑制无关 |
| 3.2.2 VitC抑制ROS的水平且部分依赖JAK2 的激活 |
| 3.2.3 激活JAK2 有助于SVCT2对ROS的抑制 |
| 3.2.4 VitC诱导PDHK1和PDHA1 的磷酸化且依赖JAK2 的活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞表观调控 |
| 4.1 材料、试剂与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与耗材 |
| 4.1.4 主要试剂配方 |
| 4.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 4.1.6 细胞培养 |
| 4.1.7 真核表达载体构建 |
| 4.1.8 细胞转染 |
| 4.1.9 免疫印迹 |
| 4.1.10 IP/co-IP |
| 4.1.11 5mC和5hmC免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)实验 |
| 4.1.12 点杂交(dot blot,DB)实验 |
| 4.1.13 微球菌核酸酶消化实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 VitC诱导F9 细胞基因组5hm C的积累且部分依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.2 VitC激活的JAK2 催化 TET3 Tyr~(1375)发生磷酸化 |
| 4.2.3 Tyr~(1375)的磷酸化提高TET3 的酶活性 |
| 4.2.4 VitC诱导组蛋白H3 Tyr~(41)的磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.5 VitC提高F9 细胞DNA的可接近性且依赖JAK2 的激活 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞多能性和分化调控 |
| 5.1 材料、试剂与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与耗材 |
| 5.1.4 主要试剂配方 |
| 5.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 5.1.6 细胞培养 |
| 5.1.7 细胞转染 |
| 5.1.8 免疫印迹 |
| 5.1.9 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色实验 |
| 5.1.10 总RNA提取、反转录和RT-q PCR |
| 5.1.11 表达谱m RNA测序及数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 VitC和 JAK2 抑制剂处理下F9 细胞表达谱m RNA测序分析 |
| 5.2.2 VitC在 JAK2 活性抑制的条件下促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.3 激活JAK2 不利于VitC促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.4 VitC诱导多能性相关基因Nanog、Esrrb、Prdm14和Prdm16 的表达且依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.5 VitC诱导神经成熟相关基因的表达且严格依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.6 VitC激活的JAK2 分别通过依赖 STAT2 和不依赖 STAT2 的途径诱导多能性相关基因和分化相关基因的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 研究有待改进之处 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）RNF185通过降解JWA促进胃癌转移的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、主要仪器 |
| 二、实验动物来源及饲养 |
| 三、人群样本来源 |
| 四、细胞及培养 |
| 五、主要试剂 |
| 六、引物合成 |
| 七、试剂配制 |
| 八、实验方法 |
| 结果 |
| 一、JWA通过泛素-蛋白酶体途径降解 |
| 二、JWA与RNF185存在相互作用 |
| 三、RNF185在蛋白水平负调控JWA |
| 四、RNF185促进JWA泛素化降解蛋白酶体 |
| 五、RNF185 通过下调JWA表达促进胃癌细胞迁移 |
| 六、JWA的K158位点是其在胃癌细胞中泛素化所必需的 |
| 七、在体内RNF185 通过下调JWA表达而促进胃癌转移 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（3）铅致原代培养大鼠皮质神经细胞氧化应激损伤及JWA mRNA表达改变（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3.1 PBS缓冲液 |
| 2.3.2 细胞培养液的制备 |
| 2.3.3 阿糖胞苷溶液的制备 |
| 2.3.4 0.4%台盼蓝溶液的配制 |
| 2.3.5 4%多聚甲醛的配制 |
| 2.3.6 DAB显色工作液 |
| 2.3.7 5 mg/ml四噻唑兰（MTT）溶液配制 |
| 2.3.8 不同浓度醋酸铅溶液的配制 |
| 2.3.9 0.1% DEPC水 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 新生大鼠皮质神经细胞的原代培养 |
| 2.4.2 免疫组化鉴定大鼠大脑皮质神经细胞 |
| 2.4.3 MTT筛选醋酸铅的适宜作用浓度 |
| 2.4.4 铅致原代培养大鼠皮质神经细胞氧化应激反应 |
| 2.4.5 QRT-PCR检测JWA mRNA在细胞中的表达水平 |
| 2.4.6 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 原代培养大鼠皮质神经细胞的形态学观察 |
| 3.2 大鼠皮质神经细胞的免疫组织化学鉴定 |
| 3.3 MTT检测各染铅组皮质神经细胞的存活情况 |
| 3.4 铅暴露对大鼠皮质神经细胞内SOD、MDA、CAT及GSH的影响 |
| 3.4.1 铅暴露对大鼠皮质神经细胞内SOD活力的影响 |
| 3.4.2 铅暴露对大鼠皮质神经细胞内MDA含量的影响 |
| 3.4.3 铅暴露对大脑皮质神经细胞内CAT活力的影响 |
| 3.4.4 铅暴露对大脑皮质神经细胞内GSH含量的影响 |
| 3.4.5 各氧化应激指标与铅剂量的相关性分析 |
| 3.5 铅暴露对大鼠皮质神经细胞JWA mRNA表达的影响 |
| 3.6 JWA mRNA表达水平与氧化应激损伤的相关性分析 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 新生大鼠皮质神经细胞培养及铅损伤模型的建立 |
| 4.1.1 神经细胞取材部位和取材时间的选择 |
| 4.1.2 神经细胞培养基的选择分析 |
| 4.1.3 影响皮质神经元体外培养成活率的多种因素 |
| 4.1.4 建立铅损伤模型及筛选醋酸铅的适宜作用浓度与作用时间 |
| 4.2 铅暴露对大鼠皮质神经细胞的氧化应激损伤 |
| 4.3 JWA基因在铅致氧化应激损伤的原代培养大鼠皮质神经细胞中的表达 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）JWA调节HER2阳性胃癌细胞迁移的分子机制及临床意义研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一. 主要仪器 |
| 二. 细胞来源及培养 |
| 三. 肿瘤样本的来源 |
| 四. 主要试剂 |
| (一) 实验中使用的化学试剂 |
| (二) 质粒及siRNA的来源 |
| (三) 实验中使用的抗体 |
| 五. 检测指标及方法 |
| (一) 细胞迁移实验 |
| (二) G-LISA活性检测试验 |
| (三) Western blot |
| (四) 瞬时转染实验 |
| (五) 免疫荧光实验 |
| (六) RT-PCR和Real-timePCR |
| (七) 荧光素酶双报告基因实验 |
| (八) 凝胶电泳迁移阻滞实验(EMSA) |
| (九) 芯片染色及评分 |
| (十) 统计分析 |
| 结果 |
| 一. 筛选合适的细胞模型 |
| 二. JWA抑制表皮生长因子诱导的细胞迁移 |
| 三. JWA抑制表皮生长因子诱导的细胞骨架重排 |
| 四. JWA调节HER2表达及其下游AKT信号 |
| 五. HER2是JWA抑制细胞运动所必需的分子 |
| 六. PEA3参与JWA介导的HER2下调 |
| 七. PEA3 在由 JWA 抑制肿瘤细胞运动性必不可少的作用 |
| 八. JWA 调控的 PEA3/HER2 需要 ERK 活化 |
| 九. HER2阴性胃癌细胞中JWA不调节HER2表达 |
| 十. 胃癌JWA/HER2的表达和临床病理 |
| 十一. 胃癌 JWA/HER2 的表达和临床病理 |
| 十二. JWA 低表达和 HER2 高表达可联合预测不良预后，且 JWA 可对 HER2阳性晚期胃癌进行危险分层 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）DNA修复蛋白JWA在小鼠衰老中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（6）JWA通过线粒体凋亡通路影响肿瘤细胞耐药性（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）维甲酸诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中核基质蛋白的变化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 肿瘤细胞诱导分化机理研究及其深入方向 |
| 1.1 肿瘤细胞诱导分化机理研究的重要意义 |
| 1.2 肿瘤细胞诱导分化的研究现状及进展 |
| 1.3 肿瘤细胞诱导分化机理研究所存在的问题 |
| 1.4 肿瘤细胞诱导分化机理研究的深入方向 |
| 2 核基质与核基质蛋白研究 |
| 2.1 核基质的结构与功能 |
| 2.2 核基质蛋白 |
| 2.3 核基质蛋白和细胞增殖分化的研究 |
| 3 细胞核基质异常与细胞癌变的关系 |
| 4 神经母细胞瘤细胞诱导分化研究及其存在问题 |
| 5 本论文具体研究工作及其科学意义 |
| 材料和方法 |
| 1 试剂与材料 |
| 2 主要仪器 |
| 3 细胞培养与诱导分化处理 |
| 3.1 人神经母细胞瘤细胞培养 |
| 3.2 诱导分化剂与诱导分化处理 |
| 4 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞诱导分化过程中生长曲线的测定 |
| 5 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞诱导分化前后细胞周期分布的测定 |
| 6 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色及光镜观察 |
| 7 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的扫描及透射电镜样品制备观察 |
| 7.1 扫描电镜样品制备观察 |
| 7.2 透射电镜样品制备观察 |
| 8 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞相关癌基因、抑癌基因表达产物的免疫细胞化学检测 |
| 8.1 相关癌基因表达产物的免疫细胞化学检测 |
| 8.2 相关抑癌基因表达产物的免疫细胞化学检测 |
| 9 人神经母细胞瘤分化标志物的观察 |
| 9.1 NSE表达样品的制备与观察 |
| 9.2 Synaptophysin表达样品的制备与观察 |
| 9.3 MAP2表达样品的制备与观察 |
| 10 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞核基质-中间纤维系统的选择性抽提样品的制备与观察 |
| 10.1 核基质-中间纤维系统的选择性抽提 |
| 10.2 核基质-中间纤维系统的整装光镜样品制备与观察 |
| 10.3 核基质-中间纤维系统的整装扫描电镜样品制备与观察 |
| 10.4 核基质-中间纤维系统的整装透射电镜样品制备与观察 |
| 11 核基质蛋白的提取 |
| 12 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 13 凝胶染色及图像分析 |
| 13.1 凝胶染色 |
| 13.2 凝胶图像分析 |
| 14 诱导分化前后差异核基质蛋白的胶内酶解 |
| 15 质谱分析及数据库检索 |
| 16 Western Blotting检测 |
| 17 免疫荧光染色 |
| 18 激光共聚焦显微镜样品的制备与观察 |
| 实验结果 |
| 1 RA对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化的诱导效果 |
| 1.1 RA诱导分化前后SK-N-SH细胞的生长曲线观察结果 |
| 1.2 RA诱导分化过程中SK-N-SH细胞周期的测定结果 |
| 1.3 RA诱导分化前后SK-N-SH细胞形态和超微结构的观察结果 |
| 1.4 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞相关癌基因、抑癌基因表达的影响 |
| 1.5 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化特异标志物表达的影响 |
| 2 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞诱导分化过程中核基质-中间纤维系统构型的影响 |
| 2.1 核基质-中间纤维系统的光镜观察结果 |
| 2.2 核基质-中间纤维系统的扫描电镜观察结果 |
| 2.3 核基质-中间纤维系统的透射电镜观察结果 |
| 3 RA诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中核基质蛋白表达的变化 |
| 3.1 双向电泳与凝胶图像分析结果 |
| 3.2 质谱鉴定与数据库查询结果 |
| 4 SK-N-SH细胞经RA诱导分化前后特异核基质蛋白表达变化的确证 |
| 4.1 差异表达核基质蛋白Western-blot结果 |
| 4.2 核基质蛋白免疫荧光染色观察结果 |
| 5 RA诱导SK-N-SH细胞分化过程中特异核基质蛋白与相关癌基因、抑癌基因的共定位观察 |
| 5.1 NPM与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 5.2 PHB与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 5.3 hnRNP A2/B1与癌基因c-myc、C-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 6 RA诱导SK-N-SH细胞分化过程中神经细胞特异表达标志物与相关癌基因、抑癌基因的的共定位观察 |
| 6.1 NSE与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 6.2 SYP与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 6.3 MAP2与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 讨论 |
| 1 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的诱导分化效果 |
| 1.1 RA对SK-N-SH细胞增殖与细胞周期的影响 |
| 1.2 RA对SK-N-SH细胞形态与超微结构的影响 |
| 1.3 RA对SK-N-SH细胞相关癌基因与抑癌基因表达的影响 |
| 1.4 RA对SK-N-SH细胞分化标志物表达的影响 |
| 小结: |
| 2 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中核基质构型变化的影响 |
| 3 差异表达核基质蛋白与RA诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化的关系 |
| 3.1 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞诱导分化前后差异表达的核基质蛋白 |
| 3.2 共同差异表达核基质蛋白的功能分析 |
| 3.3 其他差异表达核基质蛋白的功能分析 |
| 小结 |
| 3.4 共同差异核基质蛋白在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中与相关基因产物的关系 |
| 4 神经细胞特异表达蛋白在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中与相关基因产物的关系 |
| 4.1 NSE与SK-N-SH细胞中相关癌基因及抑癌基因产物的关系 |
| 4.2 Synaptophysin与SK-N-SH细胞中相关癌基因及抑癌基因产物的关系 |
| 4.3 MAP2与SK-N-SH细胞中相关癌基因及抑癌基因产物的关系 |
| 小结: |
| 5 RA诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化的调控机制 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 图版及说明 |
| 参考文献 |
| 缩略语及中英文对照 |
| 在学期间发表论文 |
| 致谢 |
（8）一、JWA基因多态性与膀胱癌易感性的关系及其功能研究 二、dJWA与果蝇酒精耐受关系的研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 第一部分 JWA基因多态性与膀胱癌易感性的关系及其功能研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 dJWA与果蝇酒精耐受关系的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录:相关论文 |
| 致谢 |
| 综述 |
（9）核基质蛋白在人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化过程中的变化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1.肿瘤细胞诱导分化机理研究及其深入方向 |
| 2.核基质与核基质蛋白研究 |
| 3.核基质异常与细胞癌变 |
| 4.肝癌细胞诱导分化研究及其存在问题 |
| 5.本论文具体研究工作及其科学意义 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与材料 |
| 2.主要仪器 |
| 3.细胞培养与诱导分化处理 |
| 4.人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化过程中生长曲线的测定 |
| 5.人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化前后细胞周期分布的测定 |
| 6.苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色及光镜观察 |
| 7.人肝癌SMMC-7721细胞的扫描及透射电镜样品制备观察 |
| 8.人肝癌SMMC-7721细胞相关癌基因c-fos、c-myc、bcl-2、c-erbB-2及抑癌基因p53、rb、p21、p27表达产物的免疫细胞化学检测 |
| 9.人肝癌SMMC-7721细胞核基质-中间纤维系统的选择性抽提 |
| 10.核基质-中间纤维系统的整装光镜及电镜样品制备与观察 |
| 11.核基质蛋白组分的提取 |
| 12.双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 13.凝胶染色 |
| 14.凝胶图像分析 |
| 15.胶内酶解 |
| 16.质谱分析及数据库检索 |
| 17.蛋白质印记杂交检测 |
| 18.免疫荧光染色观察 |
| 19.免疫胶体金标记样品的制备观察_ |
| 20.激光共聚焦显微镜观察样品的制备与观察 |
| 实验结果 |
| 1.HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞分化的诱导效果 |
| 1.1.HMBA诱导处理前后SMMC-7721细胞生长曲线的观察结果 |
| 1.2.HMBA诱导处理过程中SMMC-7721细胞周期的测定结果 |
| 1.3.HMBA诱导处理前后SMMC-7721细胞形态和超微结构的观察结果 |
| 1.3.1.光镜观察结果 |
| 1.3.2.扫描电镜观察结果 |
| 1.3.3.透射电镜观察结果 |
| 1.4.HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞癌基因、抑癌基因表达的影响 |
| 1.4.1.SMMC-7721细胞诱导处理前后c-fos表达产物的变化 |
| 1.4.2.SMMC-7721细胞诱导处理前后c-myc表达产物的变化 |
| 1.4.3.SMMC-7721细胞诱导处理前后bcl-2表达产物的变化 |
| 1.4.4.SMMC-7721细胞诱导处理前后c-erbB-2表达产物的变化 |
| 1.4.5.SMMC-7721细胞诱导处理前后p53表达产物的变化 |
| 1.4.6.SMMC-7721细胞诱导处理前后Rb表达产物的变化 |
| 1.4.7.SMMC-7721细胞诱导处理前后p21表达产物的变化 |
| 1.4.8.SMMC-7721细胞诱导处理前后p27表达产物的变化 |
| 2.SMMC-7721细胞诱导分化过程中核基质-中间纤维构型的变化 |
| 2.1.核基质-中间纤维系统的光镜观察结果 |
| 2.2.核基质-中间纤维系统的整装扫描电镜观察结果 |
| 2.3.核基质-中间纤维系统的整装透射电镜观察结果 |
| 3.HMBA诱导人肝癌SMMC-7721细胞分化过程中核基质蛋白表达的变化 |
| 3.1.双向电泳与凝胶图像分析结果 |
| 3.2.质谱鉴定与数据库查询结果 |
| 4.SMMC-7721细胞诱导分化前后特异核基质蛋白表达变化的确证 |
| 4.1.蛋白质印迹杂交结果 |
| 4.2.核基质蛋白NPM及PHB的免疫荧光染色观察结果 |
| 4.2.1.NPM的免疫荧光染色观察结果 |
| 4.2.2 PHB的免疫荧光染色观察结果 |
| 4.3 核基质蛋白NPM和PHB在核基质上的定位 |
| 5.NPM与癌基因c-fos、c-myc以及抑癌基因Rb、p53表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 5.1.NPM和c-Fos在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系 |
| 5.2.NPM和c-Myc在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系 |
| 5.3.NPM和mtP53在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系 |
| 5.4.NPM和pRb在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系 |
| 6.PHB与癌基因c-fos、c-myc以及抑癌基因Rb、p53表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 6.1.PHB和c-Fos在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系 |
| 6.2.PHB和c-Myc在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系 |
| 6.3.PHB和mtP53在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系 |
| 6.4.PHB和pRb在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系 |
| 讨论 |
| 1.HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞的诱导分化效果 |
| 1.1.HMBA对SMMC-7721细胞的增殖与细胞周期进程的影响 |
| 1.2.HMBA对SMMC-7721细胞形态与超微结构的影响 |
| 1.3.HMBA对SMMC-7721细胞相关癌基因与抑癌基因表达的影响 |
| 2.HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞分化过程中核基质构型变化的影响 |
| 3.差异表达核基质蛋白与HMBA诱导人肝癌SMMC-7721细胞分化的关系 |
| 3.1.人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化前后差异表达的核基质蛋白 |
| 3.2.差异表达核基质蛋白的功能分析 |
| 3.2.1.NPM的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用 |
| 3.2.2.PHB的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用 |
| 3.2.3.突变型Pyst1的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用 |
| 3.2.4.sin3b的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用 |
| 3.2.5.基础转录因子IIH复合物p44亚基的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用 |
| 3.2.6.SFRS1的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用 |
| 3.2.7.真核启始因子6的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用 |
| 3.2.8.Laminin结合蛋白LBP的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用 |
| 3.3.NPM和PHB在人肝癌SMMC-7721细胞分化过程中与相关基因产物的关系 |
| 3.3.1.NPM与SMMC-7721细胞中相关癌基因及抑癌基因基因产物的关系 |
| 3.3.1.1.NPM与c-Myc |
| 3.3.1.2.NPM与c-Fos |
| 3.3.1.3.NPM与mtP53 |
| 3.3.1.4.NPM与pRb |
| 3.3.2.PHB与SMMC-7721细胞中相关癌基因及抑癌基因基因产物的关系 |
| 3.3.2.1.NPM与c-Myc |
| 3.3.2.2.NPM与c-Fos |
| 3.3.2.3.NPM与P53 |
| 3.3.2.4.NPM与pRb |
| 4.HMBA诱导人肝癌SMMC-7721细胞分化的调控机制 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 图版及说明 |
| 缩略语 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）JWA调节肿瘤细胞迁移的分子机制（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录： 相关论文 |
| 致谢 |
| 综述 |
四、Relationship between structure and function of JWA in the modulation of cell differentiation（论文参考文献）
- [1]维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究[D]. 韩卓. 西北农林科技大学, 2021
- [2]RNF185通过降解JWA促进胃癌转移的分子机制研究[D]. 邱丹萍. 南京医科大学, 2018(01)
- [3]铅致原代培养大鼠皮质神经细胞氧化应激损伤及JWA mRNA表达改变[D]. 任晓慧. 南昌大学, 2017(03)
- [4]JWA调节HER2阳性胃癌细胞迁移的分子机制及临床意义研究[D]. 钱婧. 南京医科大学, 2015(07)
- [5]DNA修复蛋白JWA在小鼠衰老中的作用及机制研究[D]. 吴郁. 南京医科大学, 2011(07)
- [6]JWA通过线粒体凋亡通路影响肿瘤细胞耐药性[D]. 张燕. 南京医科大学, 2009(03)
- [7]维甲酸诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中核基质蛋白的变化研究[D]. 梁盈. 厦门大学, 2008(03)
- [8]一、JWA基因多态性与膀胱癌易感性的关系及其功能研究 二、dJWA与果蝇酒精耐受关系的研究[D]. 李春平. 南京医科大学, 2008(12)
- [9]核基质蛋白在人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化过程中的变化研究[D]. 唐剑. 厦门大学, 2008(08)
- [10]JWA调节肿瘤细胞迁移的分子机制[D]. 陈海蓉. 南京医科大学, 2007(03)