一、β-Amyloid对PC12细胞毒性损害的机制研究（论文文献综述）
袁春满[1]（2021）在《APP棕榈酰化修饰在铝致Aβ1-42升高中的作用机制研究》文中研究说明目的:探讨APP（Amyloid precursor protein）棕榈酰化修饰在铝致Aβ1-42升高中的作用机制。方法:本研究分别从整体动物实验和体外细胞实验两个层次进行APP棕榈酰化在铝致Aβ1-42升高中的作用机制研究。第一部分:动物实验1.动物分组及染毒:健康雄性成年SD大鼠40只,体重180-220 g,随机分为对照组、10μmol/kg Al（mal）3组、20μmol/kg Al（mal）3组、40μmol/kg Al（mal）3组、每组10只。采用腹腔注射麦芽酚铝的方式,隔天染毒,持续90天。2.通过水迷宫实验和新物体识别实验检测染铝对大鼠学习和记忆能力的变化。3.通过尼氏染色来分析不同浓度染铝对脑皮质神经元数量的变化影响。4.采用ELISA法检测染铝对脑皮质Aβ1-42含量的影响。5.采用免疫沉淀-酰基生物素交换法（IP-ABE）分析染铝对大鼠脑皮质APP棕榈酰化水平的影响。6.采用Western Blotting检测染铝对大鼠皮质中棕榈酰基转移酶（zDHHC7）和脂筏上APP蛋白表达的影响。第二部分:细胞实验1.选用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（简称PC12细胞）,采用麦芽酚铝（Al（mal）3）对细胞染毒36小时。按照染毒剂量分为对照组,100μmol/L Al（mal）3组、200μmol/L Al（mal）3组以及400μmol/L Al（mal）3组。2.采用ELISA法检测染铝对PC12细胞的Aβ1-42含量的影响。3.采用免疫沉淀-酰基生物素交换法（IP-ABE）检测染铝对PC12细胞的APP棕榈酰化水平的影响。4.采用Western Blotting检测染铝对PC12细胞的棕榈酰基转移酶（zDHHC7）和脂筏上APP蛋白表达的影响。5.通过非特异性化学抑制剂2-溴代十六烷酸（2-Bromopalmitate,2-BP）和siRNA靶向zDHHC7（siRNAzDHHC7）两种干预方式抑制APP棕榈酰化水平后,观察铝对Aβ1-42产生过程的影响。结果:第一部分:动物实验1.大鼠一般情况:腹腔注射染毒过程中各剂量组大鼠毛发、饮食、精神状态及自由活动均正常,体重均随着喂养时间的增长而增加。在实验结束时,各剂量组大鼠的体重差异和脑比重差异无统计学意义（P>0.05）。2.大鼠的学习记忆损害结果:（1）水迷宫实验结果:定位航行实验从第三天开始不同染铝组的大鼠的逃避潜伏期差异有统计学意义（P<0.05）,40μmol/kg Al（mal）3组与对照组之间存在显着差异（P<0.05）。在第4天的逃避潜伏期20μmol/kg Al（mal）3组和对照组与10μmol/kg Al（mal）3组之间有统计学差异（P<0.05）。在第5天的逃避潜伏期20μmol/kg Al（mal）3与对照组之间有统计学差异（P<0.05）。40μmol/kg Al（mal）3组、对照组、10μmol/kg Al（mal）3组和20μmol/kg Al（mal）3组在第4天和第5天都具有统计学差异（P<0.05）。各组别大鼠穿越平台次数无统计学差异（P>0.05）,目标象限停留时间具有差异（P<0.05）,20μmol/kg Al（mal）3组、40μmol/kg Al（mal）3组的目标象限停留时间与对照组相比时间缩短（P<0.05）。（2）新物体识别实验结果:不同染铝组大鼠的新物体识别差异有统计学意义（P<0.001）。对照组大鼠的新物体识别指数显着高于10、20和40μmol/kg Al（mal）3组（P<0.001）,辨别指数随着铝染剂量的增加而呈现下降趋势（P<0.001）。10μmol/kg Al（mal）3组显着低于对照组（P<0.05）。20μmol/kg Al（mal）3和40μmol/kg Al（mal）3组的辨别指数值明显低于对照组和10μmol/kg Al（mal）3组（P<0.05）。3.病理学结果:尼氏染色结果:染铝组大鼠的脑皮质区都可以看到不同程度的神经元丢失现象。20μmol/kg Al（mal）3组和40μmol/kg Al（mal）3组大鼠皮层神经元排列不均,空洞较多,大部分细胞中出现尼氏小体缺失。并且各组别在神经元数目上的差异也具有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,10μmol/kg Al（mal）3和20μmol/kg Al（mal）3组神经元丢失有统计学意义（P<0.05）。40μmol/kg Al（mal）3组与对照组和10μmol/kg Al（mal）3组比较,神经元丢失更加明显（P<0.05）。4.染铝对大鼠脑皮质Aβ1-42含量的影响:大鼠皮质的Aβ1-42含量随着染铝浓度的升高呈现逐渐升高趋势。10μmol/kg Al（mal）3组的Aβ1-42含量与对照组相比,差异无统计学意义（P>0.05）,与对照组、10μmol/kg Al（mal）3组相比,20μmol/kg Al（mal）3组的Aβ1-42含量差异具有统计学意义（P<0.05）,与对照组、10μmol/kg Al（mal）3、20μmol/kg Al（mal）3组相比,40μmol/kg Al（mal）3组的Aβ1-42含量差异具有统计学意义（P<0.05）。5.染铝对大鼠脑皮质APP棕榈酰化水平的影响:大鼠皮质的APP棕榈酰化水平随着染铝浓度的升高呈现逐渐升高趋势。20、40μmol/kg Al（mal）3组的APP蛋白棕榈酰化水平与对照组、10μmol/kg Al（mal）3组相比均升高,且差异具有统计学意义（P<0.05）;40μmol/kg Al（mal）3组与20μmol/kg Al（mal）3组相比,APP蛋白棕榈酰化水平升高也具有统计学意义（P<0.05）。6.铝对大鼠脑皮质zDHHC7蛋白表达的影响:随着染铝的浓度升高,zDHHC7蛋白表达呈现逐渐升高趋势。20和40μmol/kg Al（mal）3组的zDHHC7蛋白表达与10μmol/kg Al（mal）3组相比升高具有统计学意义（P<0.05）。40μmol/kg Al（mal）3组与20μmol/kg Al（mal）3组相比的zDHHC7蛋白表达升高具有统计学意义（P<0.05）。7.染铝对大鼠脑皮质脂筏上APP蛋白表达的影响:随着染铝的浓度升高,脂筏上APP蛋白的表达水平均呈现逐渐升高的趋势。与对照组相比较,10,20和40μmol/kg Al（mal）3组的脂筏上APP蛋白表达量升高具有统计学意义（P<0.05）。20、40μmol/kg Al（mal）3组的APP蛋白表达量与10μmol/kg Al（mal）3组相比升高有统计学意义（P<0.05）;与20μmol/kg Al（mal）3组相比,40μmol/kg Al（mal）3组APP蛋白表达升高具有统计学意义（P<0.05）。Flotillin是脂筏标志物作为内参。第二部分:细胞实验1.细胞形态学:对照组细胞呈边界清楚,细胞核大且完整,随着染铝剂量的增加,细胞数量逐渐减少,突触减少、增粗、断裂。400μmol/L Al（mal）3组尤其明显。2.染铝对细胞Aβ1-42含量的影响:Aβ1-42的含量随着染铝剂量的升高也呈现逐渐升高的趋势。与对照组相比较,200、400μmol/L Al（mal）3组的Aβ1-42的含量升高具有统计学意义（P<0.05）。3.染铝对细胞APP棕榈酰化水平的影响:在PC12细胞APP的棕榈酰化水平随着染铝浓度的升高,呈现升高的趋势。对照组与100μmol/L Al（mal）3组相比,APP棕榈酰化水平差异无统计学意义（P>0.05）;200μmol/L Al（mal）3组和对照组与100μmol/L Al（mal）3组相比,APP棕榈酰化水平升高具有统计学意义（P<0.05）;400μmol/L Al（mal）3组与100μmol/L Al（mal）3组、200μmol/L Al（mal）3组相比,APP棕榈酰化差异有统计学意义（P<0.05）。4.染铝对细胞zDHHC7蛋白表达的影响:zDHHC7蛋白表达量随着染铝剂量的升高也呈现逐渐升高的趋势。与对照组相比,100、200、400μmol/L Al（mal）3组的zDHHC7蛋白表达均升高,且差异有统计学意义（P<0.05）。与100μmol/L Al（mal）3组相比;400μmol/L Al（mal）3组的zDHHC7蛋白表达升高,且有统计学差异（P<0.05）;400μmol/L Al（mal）3组与200μmol/L Al（mal）3相比,zDHHC7蛋白表达差异具有统计学意义（P<0.05）。5.染铝对细胞脂筏上APP蛋白表达的影响:脂筏上APP蛋白表达量随着染铝剂量的升高呈现升高的趋势,且具有统计学差异（P<0.05）。与对照组相比较,100μmol/L Al（mal）3组、200μmol/L Al（mal）3组、400μmol/L Al（mal）3组的脂筏上APP蛋白表达量升高具有统计学意义（P<0.05）。200、400μmol/L Al（mal）3组的APP蛋白表达量与100μmol/L Al（mal）3组相比升高有统计学意义（P<0.05）;与200μmol/L组相比,400μmol/L Al（mal）3组APP蛋白表达升高差异也具有统计学意义（P<0.05）。6、在细胞水平上通过靶向棕榈酰化酶zDHHC7的两种干预方式的结果如下:1.非特异性化学抑制研究（1）2-BP干预后铝对APP棕榈酰化水平的影响:200μmol/L Al（mal）3组的APP棕榈酰化水平明显高于对照组（P<0.05）,且在铝浓度一定的前提下,随着2-BP浓度的升高,APP棕榈酰化水平呈下降趋势（P<0.05）。200μmol/L Al（mal）3组、25μg/ml2-BP+200μmol/L Al（mal）3和50μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3的APP棕榈酰化水平与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。25μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3和100μg/ml2-BP+200μmol/L Al（mal）3与200μmol/L Al（mal）3组相比,APP棕榈酰化水平显着降低（P<0.05）。100μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3组与25μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3相比,APP棕榈酰化水平差异有统计学意义（P<0.05）。（2）2-BP干预后铝对脂筏上APP蛋白表达的影响:200μmol/L Al（mal）3组的APP棕榈酰化水平明显高于对照组（P<0.05）,且在铝浓度一定的前提下,随着2-BP浓度的升高,脂筏上APP蛋白表达呈下降趋势（P<0.05）。200μmol/L Al（mal）3组、25μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3和100μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3的脂筏上APP蛋白表达与对照组差异有意义（P<0.05）。50μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3和100μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3与200μmol/L Al（mal）3组相比,脂筏上APP蛋白表达显着降低（P<0.05）。50μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3和100μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3与25μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3组相比,脂筏上APP蛋白表达显着降低（P<0.05）。100μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3组与50μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3相比,脂筏上APP蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05）。（3）2-BP干预细胞对铝对Aβ1-42含量的影响:200μmol/L Al（mal）3组的Aβ1-42含量明显高于对照组（P<0.05）,且在铝浓度一定的前提下,随着2-BP浓度的升高,Aβ1-42含量呈下降趋势（P<0.05）。25μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3、50μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3、100μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3的Aβ1-42含量与200μmol/LAl（mal）3组差异有意义（P<0.05）。50μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3和100μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3与25μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3组相比,Aβ1-42含量蛋白显着降低（P<0.05）。100μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3组与50μg/ml 2-BP+200μmol/L Al（mal）3相比,Aβ1-42含量差异有统计学意义（P<0.05）。2.特异性siRNA干扰研究（1）zDHHC7siRNA干扰细胞后铝对zDHHC7基因表达水平的影响:对照组、溶剂组、以及NC组的zDHHC7基因表达差异无统计学意义（P>0.05）。200μmol/L Al（mal）3组与对照组、溶剂组、NC组相比,zDHHC7基因表达升高（P<0.05）。zDHHC7siRNA组与对照组、溶剂组、以及NC与200μmol/L Al（mal）3相比,zDHHC7基因的表达显着降低（P<0.05）。zDHHC7siRNA+200μmol/L Al（mal）3与其余五组相比,zDHHC7基因表达差异有统计学意义（P<0.05）。（2）siRNAzDHHC7转染后铝对APP棕榈酰化水平的影响:对照组、溶剂组以及NC组的APP棕榈酰化水平差异无统计学意义（P>0.05）。200μmol/L Al（mal）3组与对照组、溶剂组、NC组相比,APP棕榈酰化水平升高（P<0.05）。zDHHC7siRNA组与对照组、溶剂组、NC组以及200μmol/L Al（mal）3相比,APP棕榈酰化水平显着降低（P<0.05）。zDHHC7siRNA+200μmol/L Al（mal）3与其余五组相比,APP棕榈酰化水平差异有统计学意义（P<0.05）。（3）siRNAzDHHC7转染后铝对脂筏上APP蛋白表达的影响:对照组、溶剂组、以及NC组的脂筏上APP蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。200μmol/L Al（mal）3组与对照组、溶剂组、NC组相比,脂筏上APP蛋白表达升高（P>0.05）。zDHHC7siRNA组与对照组、溶剂组、以及NC与200μmol/L Al（mal）3相比,脂筏上APP蛋白表达显着降低（P<0.05）。zDHHC7 siRNA+200μmol/L Al（mal）3与其余五组相比,脂筏上APP蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05）。（4）zDHHC7siRNA干扰细胞后铝对Aβ1-42含量的影响对照组、溶剂组、以及NC组的Aβ1-42含量差异无统计学意义。200μmol/L Al（mal）3组与对照组、溶剂组、NC组相比,Aβ1-42含量升高（P<0.05）。zDHHC7siRNA组与对照组、溶剂组、以及NC以及200μmol/L Al（mal）3相比,Aβ1-42含量显着降低（P<0.05）。zDHHC7siRNA+200μmol/L Al（mal）3与其余五组相比,Aβ1-42含量有统计学意义（P<0.05）。结论:1、APP棕榈酰化水平的升高可能与铝引起的Aβ1-42升高有关,其机制可能涉及APP棕榈酰化促进脂筏上APP蛋白的聚集。2、zDHHC7表达水平的升高可能是铝致APP棕榈酰化修饰水平升高的原因之一。
张云玮[2]（2021）在《miRNA-195-5p调控ERK参与麦芽酚铝致PC12细胞tau蛋白异常磷酸化的分子机制》文中进行了进一步梳理目的:本研究选取肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）细胞进行培养,利用麦芽酚铝（Al（mal）3）染毒,分别干预ERK活化和miRNA-195-5p基因表达探讨miRNA-195-5p调控ERK在Al（mal）3致PC12细胞tau蛋白过度磷酸化中的作用。方法:选取PC12细胞,利用Al（mal）3进行染毒,实验分组分为对照组、100μmol/L Al（mal）3染毒组、200μmol/L Al（mal）3染毒组、400μmol/L Al（mal）3染毒组,染毒24小时;利用ERK活化抑制剂U0126进行干预,实验分组分为空白对照组、200μmol/L Al（mal）3染毒组、DMSO溶剂对照组、50μmol/L U0126干预组、50μmol/L U0126干预组+200μmol/L Al（mal）3染毒组,首先使用U0126预处理1h,然后Al（mal）3染毒24h。利用miRNA-195-5p质粒进行干预,实验分组分为空白对照组、200μmol/L Al（mal）3染毒组、空白质粒组、miRNA-195-5p过表达组、miRNA-195-5p过表达组+200μmol/L Al（mal）3染毒组,miRNA-195-5p干预12h后Al（mal）3染毒24h;染毒及干预结束,光镜下观察细胞形态,采用CCK8检测细胞活力,用免疫荧光观察铝在细胞内分布及tau蛋白表达分布,用蛋白免疫印迹法检测ERK、P-ERK、tau5、PHF、NFT蛋白表达量,用RT-PCR检测ERK m RNA及miRNA-195-5p的表达量。结果:1.不同剂量麦芽酚铝组结果1.1细胞中铝的分布:荧光信号显示,铝主要分布在胞质中,随着Al（mal）3浓度的增加,荧光信号逐渐增强。1.2细胞形态学:随着Al（mal）3浓度的增加,细胞数量减少,轴突减少、断裂,胞体变圆。1.3细胞活力:随着Al（mal）3浓度的增加,细胞活力下降。与对照组相比,200μmol/L Al（mal）3染毒组、400μmol/L Al（mal）3染毒组细胞活力分别降低了7.95%、12.31%、17.12%（P<0.05）。1.4 miRNA-195-5p的表达量:随着Al（mal）3浓度的增加miRNA-195-5p表达量逐渐降低,与对照组相比,100μmol/L Al（mal）3染毒组、200μmol/L Al（mal）3染毒组、400μmol/L Al（mal）3染毒组miRNA-195-5p表达量分别降低了14.70%、28.00%、40.90%（P<0.05）。1.5 ERK m RNA、总ERK及P-ERK蛋白的表达:随着Al（mal）3浓度的增加,ERK m RNA的表达量及总ERK蛋白表达量未见变化,P-ERK蛋白的表达量逐渐增加,与对照组相比,200μmol/L Al（mal）3染毒组、400μmol/L Al（mal）3染毒组P-ERK蛋白表达量增高了1.74倍、1.99倍（P<0.05）。1.6 tau5、PHF、NFT蛋白的表达:随着Al（mal）3浓度的增加,tau5、PHF、NFT蛋白的表达呈现升高的趋势。与对照组相比,tau5蛋白200μmol/L Al（mal）3染毒组、400μmol/L Al（mal）3染毒组蛋白表达量明显增高,分别增高1.22倍、1.46倍（P<0.05）;与对照组相比,PHF蛋白100μmol/L Al（mal）3染毒组、200μmol/L Al（mal）3染毒组、400μmol/L Al（mal）3染毒组蛋白表达量分别增高1.18倍、1.53倍、2.50倍（P<0.05）;与对照组相比,NFT蛋白200μmol/L Al（mal）3染毒组、400μmol/L Al（mal）3染毒组蛋白表达量分别增高1.39倍、2.42倍（P<0.05）。1.7免疫荧光:结果显示tau5主要定位在细胞质,PHF主要定位在细胞核,NFT在胞核和胞质中均有分布,均随着Al（mal）3浓度的增加荧光信号逐渐增强。经Al（mal）3处理后,tau5和NFT均表现为胞质中出现较大的荧光斑块;而PHF则是出现蛋白由胞核向胞质转移,在细胞胞质中出现微弱的荧光信号。2.U0126干预2.1细胞形态学:与对照组相比,Al（mal）3染毒组细胞数量逐渐减少,轴突减少、断裂,胞体变圆,50μmol/L U0126处理后,细胞数量增加,胞体变大,细胞连接增多。2.2 ERK m RNA、总ERK及P-ERK蛋白的表达:各组ERK m RNA及总ERK蛋白表达量未见变化;与对照组相比,200μmol/L Al（mal）3染毒组P-ERK蛋白表达量增加了1.74倍（P<0.05）,U0126干预组P-ERK蛋白的表达量降低了31.92%（P<0.05）;与200μmol/L Al（mal）3染毒组相比,U0126+200μmol/L Al（mal）3组P-ERK的表达量降低了57.50%（P<0.05）。2.3 tau5、PHF、NFT蛋白的表达:与对照组相比,200μmol/L Al（mal）3染毒组tau5、PHF、NFT蛋白表达量分别增加了1.22倍、1.53倍、1.39倍（P<0.05）,50μmol/L U0126处理组tau5、PHF、NFT蛋白表达量分别降低了17.90%、16.50%、56.54%（P<0.05）;经析因分析显示,P-ERK与Al（mal）3染毒对tau5、PHF、NFT蛋白的表达存在交互作用,即P-ERK参与Al（mal）3染毒致tau5、PHF、NFT蛋白表达异常。3.4免疫荧光:结果显示,tau5主要定位在细胞质,PHF主要定位在细胞核,NFT在胞核和胞质中均有分布,均随着Al（mal）3浓度的增加荧光信号逐渐增强。与200μmol/LAl（mal）3组相比,tau5、PHF、NFT在U0126+200μmol/L Al（mal）3组细胞整体荧光信号减弱,荧光斑块减少。经U0126处理后,tau5主要表现为整体荧光密度降低且蛋白分布均匀;PHF主要表现为胞质中的荧光信号消失;NFT主要表现为整体荧光信号减弱,胞质中未见大的荧光斑块。3.miRNA-195-5p干预3.1细胞形态学:与对照组相比,Al（mal）3染毒使细胞数量逐渐减少,轴突减少、断裂,胞体变圆,经miRNA-195-5p过表达处理后,与细胞数量增加,轴突变长,细胞连接增多。3.2 miRNA-195-5p的表达量:与对照组相比,miRNA-195-5p过表达组miRNA-195-5p表达量增高了1428.63倍（P<0.05）;与200μmol/L Al（mal）3组相比,miRNA-195-5p过表达+200μmol/L Al（mal）3组miRNA-195-5p表达量增高了1826.31倍（P<0.05）。3.3 ERK m RNA、总ERK及P-ERK蛋白的表达:各组ERK m RNA及总ERK蛋白表达量未见变化;与对照组相比,200μmol/L Al（mal）3染毒组P-ERK蛋白表达量增加了1.74倍（P<0.05）,miRNA-195-5p过表达组P-ERK蛋白表达量降低了16.69%（P<0.05）;经析因分析显示miRNA-195-5p过表达与Al（mal）3对P-ERK蛋白表达存在交互作用,即miRNA-195-5p参与Al（mal）3致P-ERK蛋白的表达异常。3.4 tau5、PHF、NFT蛋白的表达:与对照组相比,200μmol/L Al（mal）3染毒组tau5、PHF、NFT蛋白表达量分别增加了1.22倍、1.53倍、1.39倍（P<0.05）,miRNA-195-5p过表达组tau5、PHF、NFT蛋白表达量分别降低了13.90%、21.31%、18.27%（P<0.05）;经析因分析显示,miRNA-195-5p过表达与Al（mal）3对tau5、PHF、NFT蛋白表达存在交互作用,即miRNA-195-5p参与Al（mal）3染毒致tau5、PHF、NFT蛋白表达异常。3.5免疫荧光:结果显示,tau5主要定位在细胞质,PHF主要定位在细胞核,NFT在胞核和胞质中均有分布,均随着Al（mal）3浓度的增加荧光信号逐渐增强。与200μmol/L Al（mal）3组相比,tau5、PHF、NFT在miRNA-195-5p mimics+200μmol/L Al（mal）3组荧光信号减弱,荧光斑块减少。经miRNA-195-5p mimics干预后,tau5主要表现为整体荧光密度降低;PHF主要表现为胞质中荧光信号消失;NFT主要表现为胞质中大块的荧光斑块消散。结论:1、麦芽酚铝可以进入细胞,主要分布在胞质;tau5蛋白主要分布在胞质;双螺旋细丝（PHF,p-Ser396）主要分布在胞核;神经原纤维缠结（NFT,p-Ser202,p-Thr205）在胞核和胞质中均有分布。且麦芽酚铝染毒后tau5、NFT均表现为胞质中的蛋白表达增多,其中PHF不仅表达量增加而且出现向胞质转移的现象。2、铝对tau蛋白的磷酸化主要先发生在Ser396位点的磷酸化,随着铝浓度的增高出现Ser202,Thr205位点的磷酸化。3、麦芽酚铝可导致miRNA-195-5p表达降低,从而激活磷酸化ERK导致tau蛋白异常磷酸化。因此,通过对miRNA-195-5p干预或者抑制ERK活化有效改善麦芽酚铝导致的细胞细胞毒性,为认知功能损伤的防治提出科学依据。
李欢[3]（2021）在《LNC001209通过CD36调节PI3K/AKT/mTOR信号通路参与铝致认知功能损害的机制研究》文中研究指明目的:通过动物实验观察铝暴露造成神经细胞凋亡进而导致认知功能障碍的过程中,Lnc001209、CD36及PI3K/AKT/m TOR信号通路中关键分子的改变情况;通过细胞实验探索铝暴露抑制Lnc001209通过CD36调节PI3K/AKT/m TOR信号通路导致神经细胞凋亡的分子机制。方法:一、选择SD（Sprague Dawley）大鼠作为研究对象,按其体质量随机分成4个组,即对照组（生理盐水组）、低剂量组（10μmol/kg麦芽酚铝）、中剂量组（20μmol/kg麦芽酚铝）、高剂量组（40μmol/kg麦芽酚铝）,每组15只,暴露方式为腹腔注射,周期为三个月。观察各组大鼠的基本情况,并计算脑重比;通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测大鼠脑组织和血浆中铝含量;通过新物体识别和Morris水迷宫实验观察大鼠的空间探索能力和学习记忆能力;通过在体动物海马长时程增强检测技术记录海马CA1区兴奋性突触后电位（f EPSP）;通过Golgi染色实验观察大鼠海马神经元轴突形态和树突棘数量变化情况;通过透射电子显微镜观察大鼠海马神经元细胞凋亡情况、突触及线粒体超微结构;通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测大鼠海马组织Lnc001209的表达水平;通过Western blot法检测大鼠海马组织中CD36蛋白的表达情况,检测大鼠海马组织中PI3K、AKT、m TOR蛋白及相应磷酸化蛋白的表达情况。二、选择肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞（PC12细胞）作为研究对象,按照暴露剂量分为四组,即对照组、低剂量组（100μmol/L麦芽酚铝）、中剂量组（200μmol/L麦芽酚铝）、高剂量组（400μmol/L麦芽酚铝）。将各个浓度染毒液的完全培养液100μL加入到对数生长期的PC12细胞,在培养箱孵育24h之后。通过电子显微镜观察PC12细胞铝暴露后细胞形态的变化;通过CCK-8方法检测PC12细胞铝暴露后细胞存活率;通过Annexin V-FITC/PI双染法检测铝暴露后细胞凋亡率;采用RT-PCR检测铝暴露后细胞中Lnc001209的表达水平;对细胞进行Lnc001209 si RNA转染,检测转染效率;通过Western blot法检测转染Lnc001209 si RNA后细胞p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser2448及CD36蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率。三、RNA体外转录与纯化后,进行RNA pull-down实验,检测Lnc001209的结合蛋白;采用质谱鉴定,分析铝暴露后的差异蛋白,通过RNA Pull Down-MS方法验证Lnc001209的互作蛋白为CD36;Western blot法检测铝暴露PC12细胞中CD36蛋白表达水平;采用RT-PCR检测细胞铝暴露后CD36基因表达水平;过表达CD36后观察细胞中p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser2448蛋白表达水平;过表达CD36后通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果:一、实验过程中,对照组大鼠发育正常,毛色较好,活泼好动,低剂量组的大鼠未见明显异常,中、高剂量组大鼠反应能力较差,活动稍微减弱,毛色暗沉,在实验过程中没有动物死亡;各麦芽酚铝暴露组大鼠脑重比随着暴露剂量增加逐渐下降,各组之间的差异具有统计学意义（p<0.05）。ICP-MS检测发现各麦芽酚铝暴露组大鼠的脑铝和血铝含量随着暴露剂量增加逐渐增加,高剂量组升高的最明显,各组间差异有统计学意义（p<0.05）。新物体识别实验发现,各麦芽酚铝暴露组大鼠探索新物体的次数随着暴露剂量增加逐渐减少,新物体象限停留时间逐渐减少,大鼠新物体识别的能力逐渐减弱;水迷宫实验发现,各麦芽酚铝暴露组大鼠到达平台潜伏期随着暴露剂量增加逐渐增加,穿越平台的次数逐渐减少,目标象限停留时间逐渐减少,大鼠的学习记忆功能逐渐降低。LTP结果发现,各麦芽酚铝暴露组大鼠海马CA1区激发电极随着暴露剂量增加逐渐减弱,各组间差异有统计学意义（p<0.05）。高尔基染色发现,各麦芽酚铝暴露组大鼠神经细胞轴突出现串珠样改变情况随着暴露剂量增加逐渐增加,并且树突棘的数量逐渐减少,出现了神经细胞丢失和神经细胞轴突断裂的现象。电子显微镜观察发现,麦芽酚铝暴露中、高剂量组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况增加,其中高剂量组较为明显;铝暴露组大鼠海马CA1区神经细胞突触结构突触囊泡减少,突触后致密物变薄,高剂量组最为明显;铝暴露组大鼠海马神经细胞线粒体嵴骨折,其中高剂量组中线粒体出现肿胀。RT-PCR实验发现,铝暴露组大鼠海马Lnc001209表达量随着暴露剂量增加逐渐降低,各组间差异有统计学意义（p<0.05）。Western blot实验结果发现,铝暴露组大鼠海马CD36蛋白表达量随着暴露剂量增加逐渐升高,各组间差异有统计学意义（p<0.05）;大鼠海马PI3K、AKT、m TOR蛋白表达量随着暴露剂量增加逐渐降低;但是p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser2448表达量随着暴露剂量增加逐渐升高,该通路中蛋白质的活性增强。有研究表明p-AKT活性强烈增强会促进神经细胞凋亡,所以麦芽酚铝暴露可以通过激活PI3K-AKT-m TOR通路造成大鼠神经细胞凋亡,导致突触可塑性损伤,表现为学习记忆功能降低。二、显微镜下观察PC12细胞形态,各麦芽酚铝暴露组细胞数量明显较少,且细胞形态出现变化,胞体变圆,轴突变短,细胞间连接逐渐减少,高剂量组尤为明显。CCK-8检测细胞存活率发现,各铝暴露组细胞活力随着暴露剂量增加逐渐下降,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。流式细胞仪检测PC12细胞凋亡情况发现,麦芽酚铝暴露中、高剂量组PC12细胞凋亡率增加,高剂量组细胞凋亡情况尤为明显,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。RT-PCR结果发现,各麦芽酚铝暴露组PC12细胞Lnc001209的表达量随着暴露剂量增加逐渐降低,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。在麦芽酚铝暴露PC12细胞中转染Lnc001209 si RNA后,发现p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser244蛋白表达水平升高,麦芽酚铝暴露组蛋白磷酸化水平也升高,麦芽酚铝暴露比抑制Lnc001209对磷酸化蛋白的作用强,铝暴露+抑制Lnc001209组蛋白表达水平升高最明显,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。PC12细胞中转染Lnc001209 si RNA,发现CD36蛋白表达水平升高,铝暴露组CD36蛋白表达水平也升高。细胞凋亡率检测发现,与空白对照组和转染阴性对照组相比,Lnc001209 si RNA、200μmol/L Al（mal）3组和Lnc001209si RNA+200μmol/L Al（mal）3组细胞凋亡率均升高,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。三、RNA体外转录和纯化,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,观察到的条带与Lnc001209预期位置相符,可以进行RNA pull-down实验;Lnc001209 RNA pull-down实验磁珠样本中无明显条带,说明蛋白已洗脱干净,进行下一步质谱分析,实验组扣除对照组后的78个差异蛋白进行生物信息学分析,在所有差异蛋白中CD36的表达差异最为明显（p=0.00075）,还需要进一步验证。RNA pull-down-MS实验发现,正义链探针组洗脱液中可以检测到CD36,而反义链探针组洗脱液中没有检测到CD36蛋白,说明Lnc001209与CD36蛋白存在相互作用关系,进而验证了CD36蛋白是Lnc001209的互作蛋白。Western blot实验结果发现,各铝暴露组PC12细胞CD36蛋白表达量升高,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。RT-PCR实验发现,麦芽酚铝暴露组PC12细胞CD36基因表达量升高。CD36干预实验结果发现,过表达CD36后p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser244蛋白表达水平均有升高的趋势,该通路被激活,其中AKT磷酸化水平升高最明显,p-AKT活性强烈增强会促进神经细胞凋亡。流式细胞仪检测PC12细胞凋亡情况发现,与空白对照组和转染阴性对照组相比,CD36过表达组、铝暴露组和CD36过表达+铝暴露组细胞凋亡率均升高,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）,其中CD36过表达+铝暴露组PC12细胞凋亡率升高最为明显。结论:一、铝暴露可引起大鼠Lnc001209、CD36及PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白表达差异,提示铝暴露可能是通过影响该通路造成神经细胞凋亡,进而导致大鼠认知功能损害。二、铝暴露可抑制Lnc001209通过PI3K/AKT/m TOR信号通路造成神经细胞凋亡,提示铝暴露可能是通过影响该通路造成神经细胞凋亡。三、Lnc001209通过CD36调节PI3K/AKT/m TOR信号通路可能参与铝致神经细胞凋亡的过程。
任敬娟[4]（2021）在《Reelin信号转导通路在铝致PC12细胞tau蛋白异常磷酸化中的作用及其机制研究》文中指出铝（Aluminum,Al）是一种公认的强神经毒物,能够导致如阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）和帕金森病（Parkinson’s disease,PD）等多种神经退行性疾病（Neurodegenerative disease,ND）。AD是一种起病隐匿和进行性发展的痴呆症,常见于老年人群。Tau蛋白异常磷酸化是导致AD特征性病理改变的重要机制之一。近年来,越来越多的证据表明铝诱导的tau蛋白异常磷酸化与AD患者认知功能障碍关系十分密切。人群流行病学调查发现,随着与铝暴露相关职业工人血清铝含量的明显升高,tau蛋白异常磷酸化水平随之增加,而个体认知功能显着降低。动物实验也证实,铝染毒斯泼累格·多雷（Sprague Dawley,SD）大鼠和昆明小鼠等受试动物,可导致其脑内磷酸化tau蛋白表达异常升高,甚至出现学习记忆功能障碍和认知能力下降等类似AD神经精神症状。由此可见,铝诱导的tau蛋白异常磷酸化在AD发病过程中起重要作用,然其确切机制尚未阐明。以往研究提示,由络丝蛋白（Reelin）、载脂蛋白E受体2（Apolipoprotein E receptor-2,Apo ER2）、极低密度脂蛋白受体（Very low density lipoprotein receptor,VLDLR）和Disabled-1蛋白（Disabled,Dab-1）所构成的Reelin信号转导通路可能在调控tau蛋白磷酸化方面具有重要作用。早期经典实验证实在reeler小鼠和Apo ER2/VLDLR基因敲除大鼠脑内存在大量异常磷酸化的tau蛋白。近年来,大量研究也发现,Reelin蛋白表达减少会显着增加tau蛋白异常磷酸化的表达水平。此外,体内外研究均表明铝可导致Reelin表达显着降低,并引起Reelin信号转导通路核心分子表达异常。综上所述,Reelin信号转导通路极有可能在铝致tau蛋白异常磷酸化过程中具有重要作用,但相关报道甚少。为此,本研究采用麦芽酚铝（Aluminum maltolate,Al（mal）3）处理大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（Pheochromocytoma-derived cell,PC12）制备铝神经毒性的细胞模型,观察Al（mal）3对PC12细胞tau蛋白磷酸化的影响,并通过添加Reelin蛋白特异性激动剂褪黑素（Melatonin,MT）和特异性抑制剂链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）,探讨Reelin信号转导通路在Al（mal）3致tau蛋白异常磷酸化过程中的作用。本研究将为进一步研究铝神经毒性机制和防治AD提供重要理论依据。第一部分麦芽酚铝染毒PC12细胞对tau蛋白异常磷酸化的影响目的:探讨Al（mal）3染毒PC12细胞对tau蛋白异常磷酸化的影响。方法:分别以含终浓度为0μmol/L Al（mal）3、50μmol/L Al（mal）3、100μmol/L Al（mal）3、200μmol/L Al（mal）3和400μmol/L Al（mal）3的高糖DMEM培养基培养PC12细胞12h、24 h和48 h,采用细胞计数试剂（Cell Counting Kit-8,CCK-8）法测定细胞活性,并确定Al（mal）3最终染毒剂量和染毒时间。按照已确定的染毒浓度和染毒时间处理PC12细胞。染毒结束后,采用倒置显微镜观察PC12细胞形态;采用CCK-8法检测PC12细胞活性;采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot,WB）检测PC12细胞tau5、P-tau396、P-tau262和P-tau231蛋白表达水平。结果:1.确定Al（mal）3染毒剂量和染毒时间CCK-8法检测结果显示,不同浓度Al（mal）3处理PC12细胞12 h后,与空白对照组相比,各组PC12细胞活性无明显变化（P（29）0.05）;染毒时间为24 h和48 h的PC12细胞,其细胞活性随Al（mal）3染毒剂量的递增而逐渐降低,其中,200μmol/L Al（mal）3组和400μmol/L Al（mal）3组PC12细胞活性均显着降低（P<0.05）。依据相关毒理学要求,选择细胞活性在70%～80%的染毒浓度和染毒时间进行细胞毒性实验。本研究发现,200μmol/L Al（mal）3染毒24 h后PC12细胞活性为（76.83±0.06）%,因此,将Al（mal）3最终染毒剂量和染毒时间确定为200μmol/L和24 h。2.Al（mal）3单独染毒PC12细胞对tau5、P-tau396、P-tau262和P-tau231蛋白表达的影响与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞tau5蛋白、P-tau396蛋白、P-tau262蛋白和P-tau231蛋白表达均显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。小结:Al（mal）3可诱导PC12细胞tau5蛋白、P-tau396蛋白、P-tau262蛋白和P-tau231蛋白表达显着增加。第二部分麦芽酚铝单独或联合Reelin干预剂处理PC12细胞对Reelin信号转导通路的影响目的:探讨Al（mal）3单独或联合Reelin特异性干预剂处理PC12细胞对Reelin信号转导通路的影响。方法:细胞染毒同第一部分,根据确定的染毒剂量和染毒时间,将研究对象分为7组,分别为0μmol/L Al（mal）3组（空白对照组）、200μmol/L Al（mal）3单独染毒组（Al（mal）3组）、100μmol/L STZ组（STZ组）、200μmol/L Al（mal）3+100μmol/L STZ联合染毒组（Al（mal）3+STZ组）、50μmol/L MT组（MT组）、200μmol/L Al（mal）3+50μmol/L MT联合染毒组（Al（mal）3+MT组）和0.5%无水乙醇（Ethanol）组（溶剂对照组,0.5%Ethanol组）。其中,STZ是Reelin特异性抑制剂,MT是Reelin特异性激动剂,Ethanol是MT的溶剂。预先依次向Al（mal）3+STZ组和Al（mal）3+MT组分别加入100μmol/L STZ和50μmol/L MT,孵育2 h,再加入Al（mal）3至终浓度为200μmol/L,继续培养24 h。采用倒置显微镜观察PC12细胞形态;采用CCK-8法检测PC12细胞活性;采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）法检测RELN、Apo ER2、VLDLR、Dab-1和糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK3β）m RNA表达水平;采用酶联免疫吸附试验法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA）检测Reelin、Dab-1和GSK3β蛋白表达水平;采用WB检测Apo ER2和VLDLR蛋白表达水平。1.Al（mal）3单独或联合Reelin干预剂处理24 h对PC12细胞活性影响CCK-8法检测结果显示,与空白对照组相比,100μmol/L STZ组、50μmol/L MT组和0.5%Ethanol组PC12细胞活性无明显改变（P>0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞活性明显下降（P<0.05）;Al（mal）3+MT组PC12细胞活性明显升高（P<0.05）。2.Al（mal）3单独或联合Reelin干预剂处理PC12细胞对Reelin信号转导通路基因表达的影响与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞RELN m RNA表达降低（P<0.05）;STZ组PC12细胞RELN m RNA表达降低（P<0.05）;MT组PC12细胞RELN m RNA表达明显升高（P<0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞RELN m RNA表达下降（P<0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞RELN m RNA表达降低（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组PC12细胞RELN m RNA表达无明显变化（P>0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞RELN m RNA表达降低（P<0.05）;Al（mal）3+MT组PC12细胞RELN m RNA表达明显增加（P<0.05）。与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞VLDLR m RNA表达显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）;STZ组PC12细胞VLDLR m RNA表达显着降低（P<0.05）;MT组PC12细胞VLDLR m RNA表达明显升高（P<0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞VLDLR m RNA表达下降（P<0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞VLDLR m RNA表达降低（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组PC12细胞VLDLR m RNA表达无明显变化（P>0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞VLDLR m RNA表达降低（P<0.05）;Al（mal）3+MT组PC12细胞VLDLR m RNA表达显着增加（P<0.05）。与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞Apo ER2 m RNA表达降低,差异有统计学意义（P<0.05）;STZ组PC12细胞Apo ER2 m RNA表达降低（P<0.05）;MT组PC12细胞Apo ER2 m RNA表达明显升高（P<0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞Apo ER2 m RNA表达下降（P<0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞Apo ER2 m RNA表达降低（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组PC12细胞Apo ER2 m RNA表达无明显变化（P>0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞Apo ER2 m RNA表达降低（P<0.05）;Al（mal）3+MT组PC12细胞Apo ER2 m RNA表达明显增加（P<0.05）。与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞Dab-1 m RNA表达明显降低（P<0.05）;STZ组PC12细胞Dab-1 m RNA表达降低（P<0.05）;MT组PC12细胞Dab-1 m RNA表达明显升高（P<0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞Dab-1 m RNA表达下降,但差异无统计学意义（P>0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞Dab-1 m RNA表达降低（P<0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞Dab-1 m RNA表达降低（P<0.05）;Al（mal）3+MT组PC12细胞Dab-1 m RNA表达明显增加（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组PC12细胞Dab-1 m RNA表达无明显变化（P>0.05）。与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞GSK3βm RNA表达明显增加（P<0.05）;STZ组PC12细胞GSK3βm RNA表达增加（P<0.05）;MT组PC12细胞GSK3βm RNA表达降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞GSK3βm RNA表达增加（P<0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞GSK3βm RNA表达增加（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组GSK3βm RNA表达无明显变化（P>0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞GSK3βm RNA表达增加（P<0.05）,Al（mal）3+MT组PC12细胞GSK3βm RNA表达明显降低（P<0.05）。3.Al（mal）3单独或联合Reelin干预剂处理PC12细胞对Reelin信号转导通路蛋白表达的影响与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞Reelin蛋白表达明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;STZ组PC12细胞Reelin蛋白表达显着降低（P<0.05）;MT组Reelin蛋白表达增加（P<0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞Reelin蛋白表达下降（P<0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞Reelin蛋白表达降低（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组Reelin蛋白表达无明显变化（P>0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞Reelin蛋白表达增加（P<0.05）;Al（mal）3+STZ组PC12细胞Reelin蛋白表达下降（P<0.05）。与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞VLDLR蛋白表达显着降低（P<0.05）;STZ组PC12细胞VLDLR蛋白表达降低（P<0.05）;MT组PC12细胞VLDLR蛋白表达增加（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组VLDLR蛋白表达无明显变化（P>0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞VLDLR蛋白表达下降（P<0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞VLDLR蛋白表达降低（P<0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞VLDLR蛋白表达下降（P<0.05）,Al（mal）3+MT组PC12细胞VLDLR蛋白表达增加（P<0.05）。与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞Apo ER2蛋白表达显着降低（P<0.05）;STZ组PC12细胞Apo ER2蛋白表达显着降低（P<0.05）;MT组PC12细胞Apo ER2蛋白表达明显增加（P<0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞Apo ER2蛋白表达下降,但差异无统计学意义（P>0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞Apo ER2蛋白表达降低（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组Apo ER2蛋白表达无明显变化（P>0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞Apo ER2蛋白表达下降,但差异无统计学意义（P>0.05）;Al（mal）3+MT组PC12细胞Apo ER2蛋白表达显着增加（P<0.05）。与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞Dab-1蛋白表达显着降低（P<0.05）;STZ组PC12细胞Dab-1蛋白表达下降（P<0.05）;MT组PC12细胞Dab-1蛋白表达明显增加（P<0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞Dab-1蛋白表达下降（P<0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞Dab-1蛋白表达降低（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组Dab-1蛋白表达无明显变化（P>0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞Dab-1蛋白表达下降（P<0.05）;Al（mal）3+MT组PC12细胞Dab-1蛋白表达显着增加（P<0.05）。与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞GSK3β蛋白表达显着升高（P<0.05）;STZ组PC12细胞GSK3β蛋白的表达明显增加（P<0.05）;MT组PC12细胞GSK3β蛋白的表达降低（P<0.05）。与STZ组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞GSK3β蛋白表达增加（P<0.05）;与MT组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞GSK3β蛋白表达增加（P<0.05）。与空白对照组相比,0.5%Ethanol组GSK3β蛋白表达无明显变化（P>0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞GSK3β蛋白表达显着升高（P<0.05）;Al（mal）3+MT组PC12细胞GSK3β蛋白表达明显降低（P<0.05）。小结:Al（mal）3可导致PC12细胞Reelin、VLDLR、Apo ER2、Dab-1的m RNA和蛋白表达降低,GSK3β蛋白表达升高;当加入STZ后,二者对Reelin、VLDLR和Dab-1表达的抑制作用更加明显,使得GSK3β表达显着升高;反之,加入MT后,Reelin、Apo ER2、VLDLR和Dab-1表达得到改善,呈现升高趋势,而GSK3β表达显着降低。第三部分Reelin信号转导通路在麦芽酚铝致PC12细胞tau蛋白异常磷酸化中的作用机制目的:探讨Reelin信号转导通路在Al（mal）3致PC12细胞tau蛋白异常磷酸化中的作用机制。方法:细胞染毒与干预方法同第二部分,采用q RT-PCR检测PC12细胞tau基因表达水平。采用WB法检测PC12细胞tau5、P-tau231、P-tau262、P-tau396蛋白表达水平。结果:1.Al（mal）3单独或联合Reelin干预剂处理PC12细胞对tau m RNA表达的影响与空白对照组相比,Al（mal）3组PC12细胞tau m RNA表达显着升高（P<0.05）;与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞tau m RNA表达无明显变化（P>0.05）;Al（mal）3+MT组PC12细胞tau m RNA表达明显降低（P<0.05）。2.Al（mal）3联合Reelin干预剂处理PC12细胞对tau5、P-tau396、P-tau262和P-tau231蛋白表达的影响STZ干预Reelin后结果显示,与空白对照组相比,STZ组PC12细胞tau5蛋白、P-tau396蛋白、P-tau262蛋白和P-tau231蛋白表达均明显升高（P<0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+STZ组PC12细胞tau5蛋白、P-tau262蛋白和P-tau231蛋白表达均显着增加（P<0.05）,P-tau396蛋白表达无明显改变（P>0.05）。MT干预Reelin后结果显示,与空白对照组相比,MT组PC12细胞tau5蛋白、P-tau396蛋白、P-tau262蛋白和P-tau231蛋白表达均明显降低（P<0.05）。与Al（mal）3组相比,Al（mal）3+MT组PC12细胞tau5蛋白、P-tau396蛋白、P-tau262蛋白和P-tau231蛋白表达均明显降低（P<0.05）。小结:Al（mal）3联合STZ处理可导致PC12细胞Reelin、VLDLR和Dab-1表达显着降低,GSK3β表达显着升高,导致tau5蛋白、P-tau396蛋白、P-tau262蛋白和P-tau231蛋白表达水平显着升高;反之,Al（mal）3联合加入MT后,Reelin、Apo ER2、VLDLR和Dab-1表达升高,GSK3β表达显着降低,导致tau5蛋白、P-tau396蛋白、P-tau262蛋白和P-tau231蛋白表达水平显着降低。提示Reelin信号转导通路可能是铝致tau蛋白异常磷酸化的重要作用机制。其机制简述为:铝可导致Reelin表达降低,引起VLDLR和（或）Apo ER2表达减少,同时Dab-1表达减少,使得GSK3β表达增加,最终导致tau蛋白异常磷酸化。结论1.铝可诱导PC12细胞tau5蛋白、P-tau396蛋白、P-tau262蛋白和P-tau231蛋白表达显着增加。2.铝可导致PC12细胞Reelin、VLDLR、Apo ER2、Dab-1 m RNA和蛋白表达明显降低,GSK3βm RNA和蛋白表达明显升高。3.Reelin信号转导通路可能是铝致tau蛋白异常磷酸化的重要作用机制,表现为:Reelin表达降低可引起Apo ER2和（或）VLDLR、Dab-1表达降低,GSK3β表达升高,导致tau蛋白异常磷酸化水平升高。反之,Reelin表达升高可导致Apo ER2和（或）VLDLR、Dab-1表达明显升高,GSK3β表达降低,使tau蛋白异常磷酸化水平降低。
成乐[5]（2021）在《维生素D与老年人认知相关性及抗炎机制研究》文中研究说明目的:基于人群横断面调查与实验室检测对老年人认知与体内VD水平及炎症的相关性进行研究,并利用Aβ1-42诱导PC12细胞建立体外AD模型,探讨VD对AD细胞模型的抗炎机制,为认知障碍的抗炎防治提供科学依据。方法:本研究分为以下五部分:第一部分:老年人认知情况与体内血浆VD及炎症因子水平的病例对照研究1.认知度调查在山西省太原市采用流行病学分层整群随机抽样的方法,对迎泽区、杏花岭区、尖草坪区、万柏林区、小店区、晋源区6个区的老年人口分布密集社区65岁及以上的老年人进行问卷调查,蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment,Mo CA）评判得分后筛选出MCI组,同时选取同期社区认知正常的健康人群,根据病例-对照研究设计以年龄、性别、教育水平为匹配因素进行筛选。2.样本量计算样本量的确定根据1:1配比病例对照研究样本量公式计算,根据20102013中国全国营养与健康调查报道老年人的VD缺乏率为39.15%、α=0.05、β=0.10、OR=2进行计算,计算结果为N=176对,考虑到数据缺失的可能,确定样本量为180对,即360人。3.血样采集及检测前处理收集被调查老年人晨起空腹血样,收入5 ml EDTA抗凝采血管中,立即分离血浆和红细胞,并在-80℃冰箱中储藏。4.血浆25（OH）D3水平炎症因子IL-1β与IL-18水平检测采用酶联免疫法检测血浆25（OH）D3、炎症因子IL-1β与IL-18水平。目前国际推荐的VD缺乏程度分类标准为:25（OH）D3<10 ng/m L（<25nmol/L）为严重缺乏、<20 ng/m L（<50nmol/L）为缺乏、2129 ng/m L（5272nmol/L）为不足、≥30 ng/m L（≥75nmol/L）为充足。第二部分:老年认知障碍VD水平与炎症因子的相关性研究1.研究对象在前期病例对照研究的基础上,选择被纳为病例组的180例参与者为研究对象,按照VD缺乏与否（25（OH）D3水平<20 ng/m L）将纳入调查者分为VD充足组与VD缺乏组。2.血样采集及检测前处理收集被调查老年人晨起空腹血样,收入5 ml EDTA抗凝采血管中,立即分离血浆和红细胞,并在-80℃冰箱中储藏。第三部分:1,25（OH）2D3对Aβ1-42诱导PC12细胞焦亡的保护作用20μM Aβ1-42诱导PC12细胞构建细胞损伤模型,设立对照组、模型组（20μM Aβ1-42）、1,25（OH）2D3低剂量组（1 n M 1,25（OH）2D3+20μM Aβ1-42）、1,25（OH）2D3中剂量组（10 n M 1,25（OH）2D3+20μM Aβ1-42）及1,25（OH）2D3高剂量组（100 n M1,25（OH）2D3+20μM Aβ1-42）。CCK-8法检测PC12细胞的存活率,AO/EB双荧光染色检测细胞膜通透性,生化法检测细胞LDH释放率,ELISA检测细胞IL-1β、IL-18含量,细胞免疫荧光、Western Blot检测焦亡通路相关蛋白。第四部分:Aβ1-42诱导PC12细胞焦亡机制研究采用si RNA转染技术抑制Caspase-1蛋白的表达,设立对照组、模型组（20μM Aβ1-42）、Caspase-1-si RNA组（50 n M Caspase-1-si RNA+20μM Aβ1-42）、NC-si RNA组（50 n M NC-si RNA+20μM Aβ1-42）、1,25（OH）2D3剂量组（100 n M 1,25（OH）2D3+20μM Aβ1-42）、Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3剂量组（50 n M Caspase-1-si RNA+100n M 1,25（OH）2D3+20μM Aβ1-42）。细胞免疫荧光、Western Blot检测焦亡通路相关蛋白,AO/EB双荧光染色检测细胞膜通透性,生化法检测细胞LDH释放率,ELISA检测细胞IL-1β、IL-18含量。结果:第一部分:老年人认知情况与体内血浆VD及炎症因子水平的病例对照研究本次病例对照研究共纳入社区老年人360例,平均年龄在（73.06±5.53）岁,其中女性181人（50.3%）,男性179人（49.7%）,根据Mo CA得分情况,将接受调查的老年人分为正常组（n=180）及MCI组（n=180）。对两组老年人Mo CA总分及各项得分进行比较后发现,MCI组在Mo CA总分、视空间、命名、注意力、语言、抽象、回忆及定向力上得分均低于正常（Normal Control,NC）组,差异具有统计学意义（P<0.001）。对两组老年人的人口学特征、生活方式及健康状况进行比较后发现,NC组和MCI组在性别（P=0.916）、年龄（P=0.342）以及教育程度（P=0.070）上的差异均无统计学意义,两组间均衡可比。在其他人口学特征、生活方式及健康状况方面,两组间也均无统计学意义（P>0.05）。本次病例对照研究所调查的360名老年人25（OH）D3平均浓度为14.43（11.58,18.17）ng/m L,其中25（OH）D3水平严重缺乏者16例（4.4%）,缺乏者271例（75.3%）,不足者39例（10.9%）,充足者34例（9.4%）,缺乏及严重缺乏者占比高达79.7%。正常组和认知障碍组25（OH）D3水平分别为14.78（11.81,20.46）ng/m L和14.16（11.31,17.38）ng/m L,将两组总体水平进行比较之后发现,认知障碍组25（OH）D3水平显着低于正常组,差异有统计学意义（P=0.031）。老年人炎症因子IL-1β水平中位数为6.66 pg/m L（5.96 pg/m L,7.41 pg/m L）,其中NC组IL-1β水平中位数为6.12 pg/m L（5.58 pg/m L,6.68 pg/m L）,MCI组IL-1β水平中位数为7.20 pg/m L（6.63 pg/m L,7.95 pg/m L）,与NC组相比,MCI组老年人体内血浆炎症因子IL-1β水平明显增高,差异有统计学意义（P<0.001）。总体炎症因子IL-18水平中位数为229.88 pg/m L（206.63 pg/m L,259.42 pg/m L）,其中NC组IL-18水平中位数为214.51 pg/m L（186.61 pg/m L,247.63 pg/m L）,MCI组IL-18水平中位数为246.92 pg/m L（222.5pg/m L,277.11 pg/m L）,与NC组相比,MCI组老年人体内血浆炎症因子IL-18水平明显增高,差异有统计学意义（P<0.001）。对不同认知水平老年人的认知Mo CA总评分及各个认知维度得分与其25（OH）D3水平进行Spearman相关分析发现,老年人血浆25（OH）D3水平与Mo CA评分呈正相关,相关系数r=0.257,P<0.001。与认知各个维度得分的相关性结果显示,在抽象及回忆的认知维度中,与25（OH）D3水平呈正相关,相关系数r=0.121,P=0.022;r=0.131,P=0.013。IL-1β水平与Mo CA评分呈负相关,相关系数r为-0.440,P<0.001,IL-18水平与Mo CA评分呈负相关,相关系数r为-0.434,P<0.001。与认知各个维度得分的相关性结果显示,在各个认知维度中,均与二者呈负相关。以认知分组为因变量,其他因素为自变量,对认知障碍的影响因素进行多因素logistic回归分析。结果显示,糖尿病、收入水平、BMI和VD与认知障碍的发生有关,其中糖尿病（OR=1.987,95%CI:1.0543.744）与认知障碍的发生风险呈正相关,为认知的危险性因素;收入水平（OR=0.823,95%CI:0.6840.990）、BMI（OR=0.687,95%CI:0.5130.918）和VD（OR=0.366,95%CI:0.2490.538）与认知障碍的发生风险呈负相关,为认知的保护性因素。在多因素logistic回归模型中,以认知分组为因变量,以炎症因子IL-1β与IL-18水平为自变量进行分析,在对年龄、性别、文化程度、收入水平、BMI、是否患高血压、糖尿病、高血脂、是否吸烟、饮酒、锻炼等变量进行调整后,发现炎症因子IL-1β水平在Q2、Q3、Q4者的认知功能障碍患病风险分别为得分在Q1者的4.221倍、7.848倍与12.619倍（Q2:OR2=4.221,95%CI2:2.0318.773;Q3:OR2=7.848,95%CI2:3.74016.465;Q4:OR2=12.619,95%CI2:5.88927.040）是认知障碍的危险因素,炎症因子IL-18水平在Q4者的认知功能障碍患病风险为得分在Q1者的3.373倍（Q4:OR2=3.373,95%CI2:1.7366.553）。在多因素logistic回归模型中,以认知分组为因变量,以炎症因子IL-1β与IL-18水平为自变量进行分析,在对年龄、性别、文化程度、收入水平、BMI、是否患高血压、糖尿病、高血脂、是否吸烟、饮酒、锻炼等变量进行调整后,发现炎症因子IL-1β水平在Q2、Q3、Q4者的认知功能障碍患病风险分别为得分在Q1者的4.221倍、7.848倍与12.619倍（Q2:OR2=4.221,95%CI2:2.0318.773;Q3:OR2=7.848,95%CI2:3.74016.465;Q4:OR2=12.619,95%CI2:5.88927.040）是认知障碍的危险因素,炎症因子IL-18水平在Q4者的认知功能障碍患病风险为得分在Q1者的3.373倍（Q4:OR2=3.373,95%CI2:1.7366.553）。第二部分:老年认知障碍VD水平与炎症因子的相关性研究在前期病例对照研究的基础上,选择被纳为病例组的180例参与者为研究对象,按照VD缺乏与否（25（OH）D3<20 ng/m L）将纳入调查者分为VD充足组与VD缺乏组。对两组老年人的人口学特征、生活方式及健康状况进行比较后发现,VD充足组和VD缺乏组在一般调查数据方面均无统计学意义（P>0.05）。本次研究所选择的180名认知障碍老年人炎症因子IL-1β水平中位数为6.39pg/m L（5.77 pg/m L,7.36 pg/m L）,其中VD充足组IL-1β水平中位数为5.58 pg/m L（5.05 pg/m L,6.12 pg/m L）,VD缺乏组IL-1β水平中位数为6.61 pg/m L（5.85 pg/m L,7.56 pg/m L）,与VD充足组相比,VD缺乏组老年人体内血浆炎症因子IL-1β水平明显增高,差异有统计学意义（P=0.016）。总体炎症因子IL-18水平中位数为222.56pg/m L（187.57 pg/m L,255.62 pg/m L）,其中VD充足组IL-18水平中位数为185.98pg/m L（172.64 pg/m L,208.49 pg/m L）,VD缺乏组IL-18水平中位数为228.66 pg/m L（201.83,257.93 pg/m L）,与VD充足组相比,VD缺乏组老年人体内血浆炎症因子IL-18水平明显增高,差异有统计学意义（P=0.036）。对纳入研究的认知障碍老年人的体内血浆25（OH）D3水平与炎症因子IL-1β及IL-18水平进行Spearman相关分析发现,老年人血浆25（OH）D3水平与IL-1β水平呈负相关,相关系数r=-0.168,P=0.025;血浆25（OH）D3水平与IL-18水平呈负相关,相关系数r=-0.257,P<0.001。在多因素logistic回归模型中,以炎症因子IL-1β、IL-18水平四分位数为因变量,以VD状态为自变量进行分析,在对年龄、性别、文化程度、收入水平、BMI、是否患高血压、糖尿病、高血脂、是否吸烟、饮酒、锻炼等变量进行调整后,发现VD缺乏者的高炎症因子水平发生风险是VD充足者的4.066倍（Q4:OR2=4.066,95%CI2:1.6549.995）,未见VD缺乏与炎症因子IL-1β之间存在相关联系。第三部分:1,25（OH）2D3对Aβ1-42诱导PC12细胞焦亡的保护作用根据CCK-8实验结果选择20μM Aβ1-42与1、10、100 n M 1,25（OH）2D3干预剂量进行后续的实验。与对照组相比,模型组细胞存活率明显降低（P（27）0.01）。与模型组比,1、10、100 n M 1,25（OH）2D3干预组细胞存活率有显着提高（P<0.05或P<0.01）。AO/EB染色结果发现,与对照组相比,细胞死亡率显着增加（P（27）0.01）。与模型组相比,1 n M 1,25（OH）2D3干预组细胞死亡率有所降低,10 n M 1,25（OH）2D3与100 n M 1,25（OH）2D3干预组细胞死亡率降低更为明显（P<0.05或P<0.01）。100 n M1,25（OH）2D3干预组细胞死亡率较1 n M 1,25（OH）2D3与10 n M 1,25（OH）2D3干预组降低更为显着（P（27）0.01、P（27）0.05）。与对照组相比,模型组LDH释放与IL-1β、IL-18分泌显着增多（P（27）0.01）,与模型组相比,1 n M、10 n M和100 n M 1,25（OH）2D3预处理的干预组细胞LDH释放与IL-1β、IL-18分泌显着降低（P（27）0.01）,其中100n M 1,25（OH）2D3干预组细胞LDH释放率与IL-1β、IL-18分泌水平较1 n M和10 n M改善作用显着增强（P（27）0.01,P（27）0.05）。通过对ASC与Caspase-1蛋白荧光强度半定量分析发现,与对照组相比,模型组蛋白荧光强度高（P（27）0.01）;与模型组细胞相比,1 n M 1,25（OH）2D3预处理的干预组细胞ASC蛋白荧光强度无显着差异（P（29）0.05）,Caspase-1蛋白荧光强度降低（P<0.05）,10 n M和100 n M 1,25（OH）2D3预处理的干预组细胞两种蛋白荧光强度显着减弱（P（27）0.01）;在100 n M 1,25（OH）2D3干预组细胞中降低较1 n M 1,25（OH）2D3干预组更为显着（P（27）0.01）。Western Blot结果显示,与对照组相比,模型组细胞NLRP1、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1与GSDMD-N蛋白表达水平显着下降（P（27）0.01）。模型组细胞相比,1 n M1,25（OH）2D3预处理的干预组细胞NLRP1蛋白表达无显着差异（P（29）0.05）,10 n M和100 n M 1,25（OH）2D3组表达水平显着降低（P（27）0.01）;1 n M和10 n M 1,25（OH）2D3组Pro-Caspase-1蛋白表达无显着差异（P（29）0.05）,100 n M 1,25（OH）2D3组表达水平显着降低（P（27）0.01）;3个干预组细胞ASC、Caspase-1、GSDMD-N蛋白表达水平显着降低（P（27）0.01）;100 n M 1,25（OH）2D3干预组细胞NLRP1、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1与GSDMD-N蛋白表达水平较1 n M和10 n M 1,25（OH）2D3干预组更为显着（P（27）0.05或P（27）0.01）。第四部分:Aβ1-42诱导PC12细胞焦亡机制研究通过对ASC与Caspase-1蛋白荧光强度半定量分析发现,与对照组相比,Aβ1-42组蛋白荧光强度高（P（27）0.01）;与Aβ1-42组细胞相比,Caspase-1-si RNA组细胞ASC蛋白荧光强度无显着差异（P（29）0.05）,1,25（OH）2D3干预组与Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3干预组细胞ASC与Caspase-1蛋白荧光强度显着减弱（P（27）0.01）;在100 n M 1,25（OH）2D3干预组细胞中降低较1 n M 1,25（OH）2D3干预组更为显着（P（27）0.01）。NC-si RNA组与Caspase-1-si RNA组相比,两种蛋白荧光强度较强（P（27）0.01）,与Aβ1-42组相比无统计学差异（P>0.05）。Western Blot结果显示,与对照组相比,Aβ1-42组细胞NLRP1、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1与GSDMD-N蛋白表达水平显着下降（P（27）0.05或P（27）0.01）。与Aβ1-42组细胞相比,NLRP1、ASC蛋白在1,25（OH）2D3与Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3干预组表达水平显着降低（P（27）0.01）;Pro-Caspase-1蛋白在Caspase-1-si RNA与Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3干预组表达水平显着降低（P（27）0.01）;Caspase-1与GSDMD-N蛋白在Caspase-1-si RNA、1,25（OH）2D3与Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3干预组表达水平显着下降（P（27）0.01）。与Caspase-1-si RNA干预组相比,NLRP1、ASC蛋白在1,25（OH）2D3与Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3干预组表达水平显着降低（P（27）0.01）;Pro-Caspase-1、Caspase-1与GSDMD-N蛋白在Caspase-1-si RNA干预组中相比NC-si RNA干预组降低更为明显（P（27）0.01）;GSDMD-N蛋白在Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3干预组中较Caspase-1-si RNA干预组表达较低（P（27）0.05）。AO/EB染色结果发现,与对照组相比,Aβ1-42组细胞死亡率显着增加（P（27）0.01）与Aβ1-42组相比,Caspase-1-si RNA组、1,25（OH）2D3组与Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3组红色荧光减少,细胞死亡率降低（P（27）0.01）。NC-si RNA组与Caspase-1-si RNA组相比,红色荧光强（P（27）0.01）,与Aβ1-42组相比无统计学差异（P>0.05）。与对照组相比,Aβ1-42组LDH释放与IL-1β、IL-18分泌显着增多（P（27）0.01）。与Aβ1-42组相比,Caspase-1-si RNA组、1,25（OH）2D3组与Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3组细胞LDH释放与IL-1β、IL-18分泌显着降低（P（27）0.01）。NC-si RNA组与Caspase-1-si RNA组相比有统计学意义（P（27）0.01）,与Aβ1-42组相比无统计学差异。Caspase-1-si RNA+1,25（OH）2D3组IL-1β分泌水平低于Caspase-1-si RNA组（P（27）0.05）。结论:1、本研究所调查的360名太原市6社区老年人维生素D缺乏现象比较普遍,缺乏及严重缺乏者比例为79.7%,不足者比例为8.3%,充足为17.8%;老年人MCI患者血浆25（OH）D3水平显着低于正常老年人血浆25（OH）D3水平,且认知水平与血浆25（OH）D3水平呈正相关;老年人MCI患者血浆IL-1β与IL-18水平显着高于正常老年人,且认知水平与血浆IL-1β与IL-18水平呈负相关;患糖尿病是发生认知障碍的危险因素,较高的收入水平与VD水平是认知的保护性因素,正常偏胖体型较消瘦者认知更好,老年人血浆高水平的IL-1β与IL-18是认知障碍的发生的危险因素。2、VD缺乏组认知障碍老年人体内血浆炎症因子IL-1β与IL-18水平水平高于VD充足组认知障碍老年人;认知障碍老年人血浆25（OH）D3水平与IL-1β与IL-18水平呈负相关,且VD缺乏是认知障碍老年人血浆炎症因子IL-18高水平的危险因素。3、Aβ1-42能够诱导的PC12细胞发生细胞焦亡现象,1,25（OH）2D3能通过抑制Aβ1-42诱导的PC12细胞发生焦亡来发挥神经保护作用。4、使用si RNA抑制Caspase-1的表达会抑制焦亡关键成孔蛋白的表达,减少细胞膜的破损与LDH、IL-1β、IL-18的成熟与释放。
朱晓婷[6]（2021）在《解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究》文中研究说明选题依据:阿尔茨海默病（AD）致残、致死率高,发病机制复杂,大脑内Aβ异常沉积是AD发生发展的重要病理变化及核心环节,前期研究已证实了解毒益智方具有抑制AD线虫头部Aβ斑块沉积及相关基因表达的作用,随之开展的随机对照临床研究证实解毒益智方应用6个月后MMSE、MoCA、ADL评分变化明显优于口服尼莫地平片的对照组。黄连为解毒益智方中的君药,为该方的主要成分,在本方中发挥“解毒”的重要功效。经查阅国内外文献发现黄连中发挥“解毒”作用的主要物质为黄连多糖（CCP）,因此设计体外细胞实验探究解毒益智方中的君药黄连的主要有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用,为“毒损”的病机及“解毒”的治法提供理论依据,为后续研究提供研究基础。因前期开展的研究均是以单基因单细胞的生物为研究对象,不能很好地模拟AD的疾病特点,因此选用APP/PS1双转基因小鼠作为研究对象,该小鼠很好的模拟了中枢神经系统Aβ异常沉积的状态,通过对小鼠的行为学研究及分子生物学研究,进一步评价解毒益智方的治疗作用。目的:通过体外细胞实验探讨基于“补肾益髓、活血化痰解毒”法形成的解毒益智方其中君药的有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用。通过行为学、分子生物学等研究手段,对APP/PS1小鼠的认知功能、Aβ沉积、BACE1表达的相关蛋白、基因等方面进行检测和分析,探讨解毒益智方对APP/PS1小鼠的作用机制,为中药治疗AD的推广应用提供可靠的研究证据。方法:1.本研究分别从体外实验、动物实验探究解毒益智方的作用机制。体外实验部分采用MTT还原法、Hoechst33258荧光染色等方法对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型进行线粒体活性、细胞活力、细胞凋亡的测定,探究CCP对PC12细胞的保护作用。动物实验部分选用APP/PS1双转基因小鼠为研究对象,随机分为5组,分别是模型组（APP/PS1组）、盐酸多奈哌齐组（Donepezil组）、解毒益智方低剂量组（JDYZFL组）、解毒益智方中剂量组（JDYZFM组）、解毒益智方高剂量组（JDYZFH组）,每组16只小鼠,另选用16只C57小鼠作为正常对照组（Control组）,于每日早晨8:30进行灌胃治疗,各组每日灌胃药物及剂量分别是,正常组和模型组0.5%CMC溶液0.20g·kg-1·d-1;阳性对照组:盐酸多奈哌齐溶液0.30g·kg-1·d-1;解毒益智方高、中、低剂量组药物浓度依次为0.60g·kg-1·d-1,0.3g·kg-1·d-1,0.15g·kg-1·d-1。持续6个月治疗结束。2.以Aβ25-35损伤的PC12细胞为研究对象,通过测定细胞活力、LDH释放率、细胞凋亡率、和线粒体膜电位的水平等评价CCP的神经保护作用。3.通过水迷宫实验,记录解毒益智方对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响。4.通过ELISE及免疫荧光法检测APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积的影响。5.采用PCR方法检测脑组织SIRT1、NF-κB、BACE1基因量变化,并进一步采用Western blot方法检测大脑皮层内SIRT1、BACE1、NF-κB蛋白的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1转运蛋白通路SIRT1、BACE1、NF-κB的影响。结果:1.通过体外研究观察CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的影响PC12细胞活力测定结果显示:PC12细胞经过浓度为5-50μM的Aβ25–35处理24h后,细胞活力随着Aβ25–35浓度的增加从24%下降至61%。当Aβ25–35在浓度范围为5至50μM时引起PC12细胞中LDH释放增加至对照组的约130-160%。在用不同浓度的CCP（5至200μg/ml）处理PC12细胞24h后,未观察到显着的细胞损失。通过Hoechst33258染色及FCM测定细胞凋亡结果显示:细胞核在荧光显微镜下具有显着的浓缩核和凋亡的细胞形成。与在未处理的PC12细胞中观察到的完整,圆形和相对大的细胞核相比,暴露于50μMAβ25–35 24h的细胞显示出典型的细胞凋亡特征,包括染色质浓缩,核碎裂和凋亡小体的出现。用CCP不同浓度（5,25,50,100,200μg/ml）处理后可有效逆转细胞凋亡,其中100μg/ml效果最明显,FCM分析显示单独暴露于50μMAβ25–35 24h导致58.88±6.12%的凋亡率,这与正常对照组中的7.21±0.82%的值显着不同（P<0.01）。加入100μg/ml的CCP后,细胞凋亡下降至12.51±1.32%。通过JC-1红色荧光与JC-1绿色荧光的比率的变化来检测Aβ诱导的线粒体功能障碍结果显示:当PC12细胞暴露于50μM的Aβ25–35中24h后,与正常对照组相比,显着减弱了JC-1的红色荧光比例,提高了JC-1绿色荧光比例（P<0.01）。用CCP（100μg/ml）预处理Aβ25–35处理的PC12细胞显着抵消了Aβ25–35损伤引起的膜电位损失,JC-1从Aβ25–35处理的PC12细胞中的22.1%变为绿色荧光至84.3%,与正常对照组相近（P>0.05）。通过蛋白质印迹法检测细胞色素C结果显示:经50μMAβ25–35处理PC12细胞24h后细胞色素C在细胞质中的蛋白质表达增加,而预先用CCP（100μg/ml）处理的PC12细胞显着减弱线粒体释放的胞质细胞色素C。2.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响。水迷宫实验结果显示:随着实验天数的后移,各组小鼠潜伏期、路径长度、游泳距离均有所缩短,表明随着训练次数的增加各组小鼠对象限平台的定位记忆能力随之有所提升。与Control组相比,APP/PS1组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离均明显延长,差异显着（P<0.01）。首次到达平台的时间明显延长,目标停留次数明显减少,差异显着（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离有所缩短,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。首次到达平台的时间缩短,目标停留次数增多,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组相比,JDYZFL组作用与其相当,JDYZFM组略优于Donepezil组,差异有统计学意义（P<0.05）。干预治疗6个月的12月龄小鼠的定位航行实验及空间搜索实验结果优于干预治疗3个月的9月龄小鼠,差异有统计学意义（P<0.05）。3.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响。各组小鼠结果如下:与Control组比较,APP/PS1组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积极数量明显增多,具有极显着统计学意义（P<0.01）。与APP/PS1组相比,JDYZFL组、JDYZFM组及Donepezil组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量不同程度降低,具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组比较,JDYZFM组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。通过免疫荧光法测得小鼠大脑皮层内Aβ表达发现,Control组只产生微量Aβ,而APP/PS1组Aβ表达量明显增高,经过用药干预后,12月龄干预组小鼠可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量较9月龄小鼠明显减少,免疫荧光标记从宏观上可以发现干预组Aβ沉积明显减少,APP/PS1组Aβ沉积明显增多。4.调控BACE1表达的相关因子结果（1）PCR检测结果各组小鼠进行的PCR检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量明显增高,SIRT1/GAPDH明显降低,差异有显着统计学意义(（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组及JDYZFM组小鼠海马体内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,SIRT1/GAPDH表达含量不同程度增高,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。JDYZFH组在NF-κB/GAPDH表达上无统计学差异。与Donepezil组相比,JDYZFL组及JDYZFM组BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。PCR结果证实药物干预组可通过提高SIRT1mRNA的含量降低NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达,从而抑制Aβ的产生而起到神经保护的作用。各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1mRNA的表达均有所提高,NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）Westorn blot检测结果各组小鼠的Western blot检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层SIRT1的蛋白表达明显降低,NF-κB、BACE1蛋白表达显着升高（P<0.01）。与APP/PS1相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组BACE1、NF-κB表达降低,SIRT1蛋白表达增高差异有统计学意义（P<0.05）。与Donepezil比较,JDYZFL组、JDYZFM组NF-κB蛋白表达有所降低,差异有统计学意义（P<0.05）。JDYZFL组SIRT1、BACE1蛋白表达无显着差异,JDYZFM组SIRT1表达有所提高,BACE1蛋白表达量略有降低,差异有统计学意义（P<0.05）。经过为期3个月及6个月的干预后,各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1的蛋白表达均有所提高,NF-κB、BACE1蛋白的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1 CCP能够保护Aβ25-35损伤的PC12细胞,其机制可能与提高细胞活力、抑制细胞凋亡、减少LDH释放、阻断膜电位的丧失,并阻止线粒体细胞色素C释放,修复线粒体功能障碍有关。2 JDYZF各剂量组可不同程度提高APP/PS1双转基因小鼠定位航行实验及空间搜索实验的成绩,说明JDYZF可改善小鼠空间学习及记忆能力。3 JDYZF可不同程度降低APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层内Aβ的异常沉积。4 JDYZF抑制BACE1的异常表达,其作用机制可能是通过调控大脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1信号通路的相关因子表达实现的。
沈扬[7]（2021）在《基于稀土上转换纳米复合材料在阿尔茨海默症治疗上的应用研究》文中指出阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease,AD）是一种中枢神经系统退行性疾病,多发病于65周岁以上的高龄人群。随着中国老龄化程度的加剧,其发病率正逐年上升,严重影响了老年人群的身心健康,并给社会和经济带来沉重的负担。然而到目前为止,阿尔茨海默症的发病机制仍尚不清楚,这就导致了该疾病无法有效治愈。因此,实现阿尔茨海默症的有效诊疗是目前科学界面临的一个难题。近年来,随着纳米技术的发展,纳米科技和生物医学领域不断交叉,纳米材料在阿尔茨海默症的诊断和治疗方面的应用逐渐受到研究者的重视。多功能纳米复合材料在AD病理性蛋白（Aβ蛋白和Tau蛋白）的诊断和治疗以及检测和清除活性氧物种（reactive oxygen species,ROS）方面发挥着巨大作用。本论文主要通过高温溶剂热法合成稀土上转换纳米粒子,通过纳米粒子的表面修饰并且装载/键合药物,用于抑制AD病理性蛋白的聚集;同时,还对纳米复合材料的发光性质、药物释放能力、生物相容性和潜在的生物应用进行了进一步的探索。具体内容总结如下:（1）通过核壳结构的设计和表面修饰,成功构建了980 nm近红外光激发的基于稀土上转换纳米粒子的复合材料UCNPs-LMB。该材料可以通过响应HOCl可控释放有机小分子亚甲基蓝（MB）来有效抑制Tau蛋白聚集,并通过Th T荧光实验和圆二色谱实验对其进行了证明。UCNPs中掺杂有Er3+作为激活剂,可以将980 nm近红外光转化为655 nm的可见光,激活光敏剂MB产生1O2解聚Aβ聚集体并降低其生物毒性。溶液和细胞实验均证明,该纳米复合材料能快速响应HOCl,释放药物MB,能有效抑制Tau蛋白聚集并在近红外光光照下解聚Aβ聚集体。细胞毒性实验证明此纳米复合材料具有较高的生物相容性。更重要的是,UCNPs-LMB能够显着降低AD病理性蛋白对PC12细胞的毒性,提高细胞存活率。（2）成功构建了980 nm近红外光激发的纳米复合材料UCNPs@m Si O2-MB@Au NPs,用于抑制Aβ和Tau蛋白聚集。我们通过将介孔二氧化硅（m Si O2）包覆在UCNPs表面,构建了纳米药物传递系统UCNPs@m Si O2用于装载药物MB。除此之外,将修饰有β-D-葡萄糖的Au NPs与表面连接了对羧基苯硼酸的UCNPs@m Si O2反应生成硼酸酯键,Au NPs起到封住孔道的作用,避免了MB的过早释放,同时硼酸酯键可以特异性响应病灶区的活性氧,实现了MB的可控释放。Th T荧光实验和圆二色谱实验证明,此纳米复合材料最外层的Au NPs可以有效抑制Aβ单体聚集。由于在AD患者的大脑中有过量表达的H2O2,会切断连接UCNPs@m Si O2和Au NPs之间的硼酸酯键,导致Au NPs从表面掉落,并释放出孔道中的MB抑制Tau蛋白聚集。同时该纳米复合材料中Er3+的掺杂使其在650 nm处有上转换发光,与MB的吸收光谱匹配,可构建比率型上转换荧光探针来检测药物MB的释放效果。溶液和细胞实验均证明,该纳米复合材料能快速响应H2O2,释放孔道中的药物MB。一系列细胞实验证明,此纳米复合材料毒性低,能有效抑制Tau蛋白和Aβ单体的聚集,并能降低AD病理性蛋白对PC12细胞的毒性,提高细胞存活率。（3）成功构建了纳米复合材料UCNPs@m Si O2-curcumin@CuxO,用于抑制Aβ蛋白聚集和清除ROS。选用纳米药物传递系统UCNPs@m Si O2,在孔道中装载药物姜黄素（curcumin）;通过正负电的吸引作用,将CuxO NPs连到UCNPs@m Si O2表面。Th T荧光实验和圆二色谱实验证明,姜黄素可以从m Si O2的孔道中逐渐释放出来,同时用于监测和降低Aβ聚集程度。CuxO NPs可以有效清除AD患者的大脑中过量表达的ROS,降低氧化应激带来的损害。体外实验结果证明,纳米复合材料可以有效提高药物姜黄素在大脑中的积累量,增强其抑制Aβ蛋白聚集的效果。
胡文继[8]（2021）在《猴头菌发酵菌丝体纯化多糖的抗阿尔茨海默症活性研究》文中提出随着各个国家老龄化加快的不可避免,全球目前几乎每3 s就会新增1名阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease,AD）确诊患者。AD是最主要的痴呆形式之一,会导致记忆力和学习等方面的进行性下降,这对于社会和家庭的负担将会大大增加。AD的发病机制复杂,且环环相扣,目前围绕AD的治疗策略集中于改善β淀粉样蛋白（β-Amyloid,Aβ）斑块异常积聚、促进乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）释放和阻断谷氨酸能神经传递等,但仍存在着药效不稳定、存在毒副作用等诸多问题,且单一靶点的治疗策略似乎无法实现对病程的控制。因此,作用于多靶点、全身性的天然药物作为一种潜在的新型疗法,逐渐成为AD治疗的研究热点。真菌因营养成分丰富,在许多国家被广泛用作日常饮食的一部分。猴头菌作为一种高蛋白、低脂肪的食物,除味道鲜美、食之不易发胖外,还能够滋补强身、养胃安神,因此也是一味珍贵的中药。随着健康产业的发展,人们对于名贵真菌的需求日益增加。因此建立系统的猴头菌发酵体系,对于猴头菌及下游产业的长期发展具有很大的助益。多糖是猴头菌的主要活性成分,猴头菌多糖已经被证实具有抗氧化、调节免疫、消除炎症和促进神经发育等活性。尚未有研究在APP/PS1小鼠模型中,对猴头菌多糖的抗AD机制进行探索。因此基于以上理论基础,以猴头菌液体发酵菌丝体多糖作为研究对象,在明确其纯化手段和结构性质的同时,考察其对AD的保护活性,探究分子机制。本课题的完成对于多糖的药效药理研究,和中药的现代化开发,具有提供思路和数据支持的意义。本研究首先结合满意度函数、单因素实验、筛选试验设计和中心复合设计,建立了以高产菌丝体和胞内多糖为指标的液体深层发酵工艺。培养基配方为（单位:g/L）:蔗糖30、酵母浸粉19.83、胰蛋白胨5、（NH4）2SO4 5、KH2PO4 4、Mg SO42.58、Zn SO4 0.02、Ca Cl2 0.01和维生素B1 0.03。发酵参数为:发酵温度26℃,转速200 r/min,培养基初始p H 6.5,接种量5%,进行为期6 d的发酵。随后结合多种检测手段,明确了猴头菌发酵菌丝体的主要活性成分,包括总蛋白（48.5%）、甘露醇（8.90 g/kg）、总黄酮（1.04 g/kg）、总三萜（1.13 g/kg）和17种氨基酸的含量。与野生猴头菌相比,猴头菌液体深层发酵菌丝体具有相近的活性成分,这为发酵猴头菌的活性研究探索和机制研究提供了思路。随后,制备了富集多糖的猴头菌水提物（Hercium erinaceus extract,HE）,并考察了其神经保护活性。体外研究显示,HE促进PC12细胞的神经元样分化,同时对细胞的增殖无影响。HE通过改善左旋谷氨酸（L-Glutamate,L-Glu）诱导损伤形成的线粒体功能障碍、缓解胞内Ca2+超载同时抑制活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）积累,提升了细胞活力、产生了抗凋亡的作用。在右旋半乳糖（D-Galactose,D-gal）联合Al Cl3诱导的AD小鼠模型中,HE在显现安全性的基础上,能够改善小鼠的空间记忆、学习能力和耐力,并通过增加ACh和乙酰胆碱转移酶（Choline acetyl transferase,Ch AT）水平发挥抗AD的作用。为了获得具有神经保护活性的纯化多糖,结合L-Glu诱导的小鼠海马神经元细胞系（HT22）细胞损伤模型,建立了结合神经保护的指标筛选纯化猴头菌多糖的体系,最终获得纯化多糖（PHEB）,并对其结构和理化特性进行了分析。PHEB的纯度约为96.9%,在紫外光谱分析中无明显蛋白/核酸成分（260/280 nm处无吸收峰）;其分子量为36.1 k Da,是不规则线形的均一多糖。PHEB主要由6种单糖组成,且摩尔比为岩藻糖（Fucose,Fuc）∶Gal∶葡萄糖（Glucose,Glc）∶木糖（Xylose,Xyl）∶甘露糖（Mannose,Man）∶葡萄糖醛酸（Glucuronic Acid,Glc UA）=2.622∶9.372∶66.660∶1.956∶13.514∶4.821。红外光谱分析显示PHEB包含糖类的特征峰,如O-H的伸缩振动、C-H伸缩振动、C-O对称伸缩振动和O-H变角振动等。甲基化分析显示多糖最主要的糖苷键残基为6-Glc（p）和3-Glc（p）,说明其主链为葡聚糖。通过核磁共振对所有糖苷键信号进行归属,最终明确了PHEB的主要糖苷键组成。最后,利用APP/PS1小鼠模型,对具有神经保护活性的多糖PHEB的抗AD作用和分子机制进行了深入研究。结果表明,PHEB能够改善小鼠在行为学测试中的表现;病理观察显示PHEB改善了AD小鼠脑中的神经元损伤,且对其它脏器无毒副作用;免疫组化染色结果显示PHEB减少小鼠海马区的Aβ1-42沉积、tau的过度磷酸化和4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）的表达;调节胆碱能因子（ACh、Ch AT和乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,ACh E））、氧化应激因子（ROS、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、和抗氧化酶）和Aβ1-42在海马、下丘脑、垂体和血清中的水平。通过蛋白质组学和生物信息学筛选PHEB抗AD活性可能的靶点和通路,筛选得到52种具有表达显着差异的蛋白。基因数据库提示这些蛋白主要涉及Ca2+平衡、谷氨酸受体表达、突触内膜的形成与神经发育,且存在明确的互作关系。因此本研究采用蛋白免疫印迹（Western Blotting）围绕Ca2+平衡对PHEB的分子机制进行进一步研究。结果表明PHEB的作用机制可能是通过核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2）途径的激活,抑制氧化应激介导的Ca2+超载和Ca2+/钙调蛋白依赖激酶（Calcium/calmodulin kinase,Ca MK）II/IV的磷酸化表达增加,改善神经元细胞内Ca2+平衡,实现改善突触发育和抗AD作用,为改善AD症状、提高认知和记忆的药品及保健品的开发提供理论依据。
侯亚男[9]（2021）在《靶向Nrf2的小分子在神经保护中的研究》文中进行了进一步梳理在多种生理代谢途径和酶促反应中,机体都会产生活性氧（ROS）。生理水平的ROS是重要的信号转导分子。然而,ROS的过多积累会导致氧化应激,对蛋白质、DNA和脂质等造成不可逆的损伤。大脑富含不饱和脂肪酸且耗氧量高,对氧化损伤十分敏感。常见的神经退行性疾病,如帕金森症和阿尔茨海默症等,其发展均与氧化应激有关。为了预防或治疗这些疾病,上调细胞内抗氧化防御系统是一种潜在的策略。在细胞内,Nrf2转录因子调控多种抗氧化分子的表达。生理状态下,Nrf2被其抑制蛋白Keap1锚定在细胞质中,并进行泛素化降解。而在亲电试剂进攻或氧化应激等状态下,Nrf2从Keap1逃离,并转移到细胞核中。在核内小Maf蛋白的帮助下,Nrf2与ARE结合,启动一系列抗氧化基因的表达。Nrf2是细胞内抗氧化防御系统的重要调节因子,因此通过激活Nrf2来治疗神经退行性疾病得到越来越多的关注。在本论文中,我们报道了硫辛酰胺、燕麦酰胺类似物、二苯并吡喃酮衍生物、小白菊内酯、异硫氰酸烯丙酯和IM3829衍生物等小分子对PC12细胞具有神经保护效果,且该作用是通过激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路实现的。本论文的内容总结归纳如下:1.简要介绍了Keap1/Nrf2/ARE信号通路及其调控方式。同时,阐述了神经退行性疾病和癌症与该信号通路之间的关系。此外,还对最近报道的Nrf2调节剂进行了总结。2.硫辛酰胺、小白菊内酯、异硫氰酸烯丙酯、燕麦酰胺-2c以及化合物3、4、6和7（二苯并吡喃酮类衍生物）均来源于食物或中药材,并且它们具有多种药理学活性。实验结果表明,这些化合物都是有效的Nrf2激活剂。它们能够抵御过氧化氢或6-羟基多巴胺造成的氧化损伤,保护PC12细胞。这些化合物还促进Nrf2的核易位,进而诱导一系列Nrf2下游抗氧化分子的表达,包括谷胱甘肽、血红素加氧酶、醌氧化还原酶和硫氧还蛋白还原酶等。除此之外,通过干扰RNA沉默Nrf2的表达会使这种保护效果消失,这表明Nrf2在这些小分子对细胞的保护过程中发挥至关重要的作用。3.化合物IM3829是一个已被报道的Nrf2抑制剂。我们设计并合成了多个IM3829衍生物,探究它们对Nrf2的作用效果。其中化合物7对Nrf2的激活效果最好,因此接下来我们探究了化合物7对PC12细胞的作用。研究发现,该化合物能够有效保护PC12细胞抵抗氧化损伤,诱导Nrf2激活并促进一系列二相代谢酶的表达。化合物7是一个结构较新颖的Nrf2激活剂,可以作为潜在的预防神经退行性疾病的候选药物。
刘宁[10]（2021）在《虾青素通过Sirt1/PGC-1α通路对Aβ25-35介导的海马结构老化的影响》文中研究指明目的:氧化应激被认为是导致脑老化,进而影响认知功能降低的主要原因。虾青素（Astaxanthin,AST）及Sirt1/PGC-1α通路具有较强的抗氧化作用,对ROS有高效的清除能力,因此,本课题的研究目的是探讨虾青素能否通过Sirt1/PGC-1α通路对Aβ25-35介导小鼠认知功能的改善,能否实现其对海马结构神经元的保护作用。本研究结果对于证明虾青素对海马结构氧化应激的调节机制具有重要的科学意义,并将为脑老化和老年性痴呆的预防和治疗以及虾青素的进一步开发和临床应用奠定可靠的理论基础。研究方法:1.动物模型制作及分组:采用6周龄的ICR小鼠,共60只,随机分四组进行饲养,即空白对照组（15只）,Aβ组（15只）,Aβ+AST组（15只）,Aβ+AST+NAM组（15只）。Aβ组是通过右侧侧脑室连续7天注射Aβ25-35（10μM,5μl/次）建立老化小鼠模型。Aβ+AST组为AST（10μM,10 mg/kg/d）连续灌胃30天饲养。Aβ+AST+NAM组为在Aβ+AST组灌胃的基础上连续腹腔注射7天烟酰胺（NAM,500μM,500mg/kg/d）。2.采用Morris水迷宫行为学测试,观察各组小鼠的空间学习记忆能力。3.采用免疫荧光染色方法观察各组小鼠海马结构三个亚区（CA1、CA3、DG）BDNF、SYN蛋白表达水平的变化情况;观察各组小鼠海马结构三个亚区Sirt1/PGC-1α通路蛋白Sirt1、PGC-1α表达水平变化情况;观察各组小鼠海马结构三个亚区Bcl-2、Bax表达水平变化情况。4.采用Western blotting方法检测各组小鼠海马结构BDNF、SYN蛋白表达水平变化情况;检测各组小鼠海马结构Sirt1/PGC-1α通路蛋白Sirt1、PGC-1α表达水平变化情况;检测各组小鼠海马结构Bcl-2、Bax表达水平变化情况。5.采用RT-PCR方法检测各组小鼠海马结构BDNF mRNA、SYN mRNA表达;检测各组小鼠海马结构Sirt1/PGC-1α通路蛋白Sirt1 mRNA、PGC-1αmRNA表达;检测各组小鼠海马结构Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达情况。6.检测各组小鼠海马结构ROS、SOD、MDA及GSH-px含量的变化;检测各组PC12细胞ROS、SOD、MDA含量的变化。7.采用CCK8法、Annexin-V/PI双染法及衰老相关β–gal染色方法检测各组PC12细胞凋亡及衰老情况。8.统计学分析方法:实验数据均以均数±标准差来进行表示。采用Graph Pad Prism5.0进行统计学分析。两组间比较用Tukey检验统计,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.Morris水迷宫行为学测试结果显示,经侧脑室连续多次注射Aβ25-35,能够引起小鼠学习记忆能力降低,体外补充虾青素能够使小鼠学习记忆能力提升,并且,虾青素通过Sirt1/PGC-1α通路能够改善Aβ25-35介导小鼠的认知功能。2.免疫荧光染色结果发现,虾青素能够上调小鼠海马结构通路蛋白Sirt1及PGC-1α的表达,并且虾青素能够通过Sirt1/PGC-1α通路上调小鼠海马结构SYN、BDNF及Bcl-2的表达,下调Bax的表达。3.Western blotting结果证实,给予虾青素后,小鼠海马结构Sirt1、PGC-1α、SYN、BDNF及Bcl-2的表达水平增高,而Bax的表达水平降低。4.Real Time PCR结果证实,小鼠海马结构Sirt1 mRNA、PGC-1αmRNA、SYN mRNA、BDNF mRNA及Bcl-2 mRNA的表达水平在给予虾青素后增高,Bax mRNA的表达水平降低;RT-PCR结构与Western blotting结果中蛋白表达趋势较为一致。5.氧化应激相关指标检测结果显示,虾青素能够使老化模型小鼠海马结构ROS、MDA含量减低,SOD、GSH-px含量增高;并且虾青素能够使Aβ组PC12细胞内ROS、MDA含量降低,而SOD含量升高。6.CCK8法及Annexin-V/PI双染法检测结果证实,随着Aβ25-35浓度增加,PC12细胞的生存活性降低;虾青素能够降低PC12细胞凋亡率。7.β-半乳糖苷酶染色结果证明,Aβ25-35使阳性染色PC12细胞数量增高,虾青素能够使阳性染色细胞数量降低。结论:1.本研究证明了虾青素能够上调小鼠海马结构BDNF、SYN、Sirt1及PGC-1α表达的作用,通过Sirt1/PGC-1α通路能够改善对Aβ25-35介导的小鼠认知功能障碍。2.本研究结果证实了虾青素具有上调Bcl-2表达、下调Bax表达的作用,通过Sirt1/PGC-1α通路进一步发挥由Aβ25-35介导的小鼠海马结构神经元凋亡的保护作用。3.本研究结果表明了虾青素能够增强PC12细胞的活性,并通过Sirt1/PGC-1α通路对Aβ25-35介导的PC12细胞衰老及凋亡具有保护作用。
二、β-Amyloid对PC12细胞毒性损害的机制研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、β-Amyloid对PC12细胞毒性损害的机制研究（论文提纲范文）
（1）APP棕榈酰化修饰在铝致Aβ1-42升高中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验主要仪器 |
| 1.3 实验主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 动物实验 |
| 1.5.1 动物分组及染毒 |
| 1.5.2 学习记忆能力的检测 |
| (1)水迷宫实验 |
| (2)新物体识别实验 |
| 1.5.3 病理学检测 |
| 1.5.4 脑皮质Aβ_(1-42)含量的测定 |
| 1.5.5 脑皮质APP棕榈酰化水平的测定 |
| 1.5.6 脑皮质棕榈酰化酶zDHHC7蛋白表达水平的测定 |
| 1.5.7 脑皮质的脂筏提取 |
| 1.5.8 脑皮质脂筏上APP蛋白表达的测定 |
| 1.6 细胞实验 |
| 1.6.1 细胞培养 |
| 1.6.2 细胞分组及染毒 |
| 1.6.3 细胞Aβ_(1-42) 含量的测定 |
| 1.6.4 细胞APP棕榈酰化水平的测定 |
| 1.6.5 细胞棕榈酰化酶z DHHC7 蛋白表达的测定 |
| 1.6.6 细胞的脂筏提取 |
| 1.6.7 细胞脂筏上APP蛋白表达的测定 |
| 1.6.8 棕榈酰化酶z DHHC7 干预研究 |
| (1)非特异性化学抑制研究 |
| (2)特异性siRNA干扰研究 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 动物实验结果 |
| 2.1.1 染毒期间大鼠的一般情况 |
| 2.1.2 染铝对大鼠学习记忆能力的影响 |
| (1)水迷宫实验 |
| (2)新物体识别实验 |
| 2.1.3 染铝对病理学的影响 |
| 2.1.4 染铝对脑皮质Aβ_(1-42)含量的影响 |
| 2.1.5 染铝对脑皮质APP棕榈酰化水平的影响 |
| 2.1.6 染铝对脑皮质棕榈酰化酶zDHHC7表达的影响 |
| 2.1.7 染铝对脂筏上 APP 蛋白表达的影响 |
| 2.2 细胞实验结果 |
| 2.2.1 细胞形态学变化 |
| 2.2.2 染铝对细胞Aβ_(1-42)含量的影响 |
| 2.2.3 染铝对细胞APP棕榈酰化水平的影响 |
| 2.2.4 染铝对细胞棕榈酰化酶zDHHC7 表达的影响 |
| 2.2.5 染铝对细胞脂筏上APP蛋白表达的影响 |
| 2.2.6 棕榈酰化干预研究 |
| 1.非特异性干预研究 |
| (1)化学剂 2-BP 干预细胞对铝对 APP 棕榈酰化水平的影响 |
| (2)化学剂 2-BP 干预细胞对铝对脂筏上 APP 蛋白表达的影响 |
| (3)化学剂 2-BP 干预细胞对铝对 Aβ_(1-42)含量的影响 |
| 2.特异性siRNA干扰研究 |
| (1)z DHHC7siRNA干扰细胞后铝对z DHHC7 基因表达水平的影响 |
| (2)z DHHC7siRNA干扰细胞后铝对APP棕榈酰化水平的影响 |
| (3)zDHHC7siRNA干扰细胞后铝对脂筏上APP蛋白表达的影响 |
| (4)z DHHC7siRNA干扰细胞后铝对Aβ_(1-42)含量的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 APP 棕榈酰化在 Aβ 生成中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）miRNA-195-5p调控ERK参与麦芽酚铝致PC12细胞tau蛋白异常磷酸化的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 溶液配置 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同剂量麦芽酚铝染毒的实验结果 |
| 2.2 ERK活化抑制剂U0126干预实验结果 |
| 2.3 miRNA-195-5p干预实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Tau蛋白与认知功能障碍的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）LNC001209通过CD36调节PI3K/AKT/mTOR信号通路参与铝致认知功能损害的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 铝致大鼠认知功能损害过程中造成Lnc001209、CD36及PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白差异表达 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组大鼠的基本情况 |
| 2.2 各组大鼠的脑铝和血铝含量 |
| 2.3 各组大鼠行为学测试 |
| 2.4 各组大鼠LTP实验结果 |
| 2.5 各组大鼠脑组织镜下形态结构及细胞凋亡情况 |
| 2.6 各组大鼠海马Lnc001209 的表达情况 |
| 2.7 各组大鼠海马CD36 蛋白的表达情况 |
| 2.8 各组大鼠海马PI3K/AKT/mTOR通路中相关蛋白的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 Lnc001209 通过PI3K-AKT-mTOR信号通路可参与铝致PC12 细胞凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 铝暴露引起PC12 细胞形态变化 |
| 2.2 铝暴露引起PC12 细胞活力变化 |
| 2.3 铝暴露引起PC12 细胞凋亡率变化 |
| 2.4 铝暴露PC12 细胞后Lnc001209 的表达量 |
| 2.5 转染Lnc001209 siRNA对 PC12 细胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的影响 |
| 2.6 转染Lnc001209 siRNA对 PC12 细胞CD36 蛋白的影响 |
| 2.7 转染Lnc001209 siRNA对 PC12 细胞凋亡率的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 Lnc001209 通过CD36 调节PI3K-AKT-mTOR信号通路可参与铝致PC12细胞凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RNA pull-down确定Lnc001209 的相互作用蛋白为CD36 |
| 2.2 铝暴露后PC12 细胞CD36 蛋白表达情况 |
| 2.3 转染CD36对PC12 细胞p-PI3K、p-AKT和 p-mTOR蛋白的影响 |
| 2.4 转染CD36 对PC12 细胞凋亡率的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 铝导致神经毒性作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）Reelin信号转导通路在铝致PC12细胞tau蛋白异常磷酸化中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 实验技术路线图 |
| 前言 |
| 第一部分 麦芽酚铝对 PC12 细胞 tau 蛋白异常磷酸化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 实验分组及染毒 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同处理对PC12 细胞活性的影响 |
| 2.2 Al(mal)_3染毒PC12 细胞对tau5、P-tau396、P-tau262和P-tau231 蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 麦芽酚铝单独或联合Reelin干预剂处理PC12 细胞对Reelin信号转导通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 实验分组及染毒 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Al(mal)_3单独或联合Reelin干预剂处理24 h对 PC12 细胞活性与形态影响 |
| 2.2 Al(mal)_3 单独或联合 Reelin 干预剂处理 PC12 细胞对 Reelin 信号转导通路核心分子基因表达的影响 |
| 2.3 Al(mal)_3 单独或联合 Reelin 干预剂处理 PC12 细胞对 Reelin 信号转导通路核心分子蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 Reelin信号转导通路在麦芽酚铝致PC12 细胞tau蛋白异常磷酸化中的作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 实验分组及染毒 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Al(mal)_3单独或联合Reelin干预剂处理PC12 细胞对tau基因表达影响 |
| 2.2 Al(mal)_3 联合 Reelin 干预剂处理 PC12 细胞对 tau5、P-tau396、P-tau262 和 P-tau231 蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Reelin信号转导通路在阿尔茨海默症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）维生素D与老年人认知相关性及抗炎机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 老年人认知情况与体内血浆VD及炎症因子水平的病例对照研究 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 调查内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般情况 |
| 2.2 不同认知组老年人Mo CA总分及各项得分比较 |
| 2.3 不同认知组老年人一般情况的比较 |
| 2.4 不同认知组间血浆VD水平的比较 |
| 2.5 不同认知组间炎症因子IL-1β、IL-18 水平的比较 |
| 2.6 老年人认知水平与VD水平及炎症因子的相关性 |
| 2.7 影响老年人认知障碍的多因素分析 |
| 2.8 logistic回归分析炎症因子IL-1β、IL-18 与认知的相关性 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 老年认知障碍VD水平与炎症因子的相关性研究 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 研究对象及目的 |
| 1.2 调查内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同VD水平组认知障碍老年人一般情况的比较 |
| 2.2 不同VD水平组认知障碍老年人炎症因子IL-1β水平的比较 |
| 2.3 不同VD水平组认知障碍老年人炎症因子IL-18 水平的比较 |
| 2.4 认知障碍老年人VD水平与炎症因子IL-1β及IL-18 水平的相关性 |
| 2.5 炎症因子对认知障碍老年人VD水平的多因素logistic分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 1,25(OH)_2D_3对Aβ_(1-42)诱导PC12 细胞焦亡的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 主要溶液及其配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Aβ_(1-42)以及1,25(OH)_2D_3对PC12 细胞存活率的影响 |
| 2.2 1,25(OH)_2D_3对Aβ_(1-42)诱导PC12 细胞存活率的影响 |
| 2.3 1,25(OH)_2D_3对Aβ_(1-42)诱导PC12 细胞膜通透性的影响 |
| 2.4 1,25(OH)_2D_3对Aβ_(1-42)诱导PC12 细胞LDH释放率的影响 |
| 2.5 1,25(OH)_2D_3对Aβ_(1-42)诱导PC12 细胞炎症因子IL-1β及IL-18 水平的影响 |
| 2.6 1,25(OH)_2D_3对Aβ_(1-42)诱导PC12 细胞焦亡通路相关蛋白的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 1,25(OH)_2D_3对Aβ_(1-42)诱导细胞焦亡机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 主要溶液及其配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Caspase-1-si RNA对1,25(OH)_2D_3与Aβ_(1-42)诱导细胞焦亡通路相关蛋白的影响 |
| 2.2 Caspase-1-si RNA对1,25(OH)_2D_3与Aβ_(1-42)诱导细胞膜通透性的影响 |
| 2.3 Caspase-1-si RNA对1,25(OH)_2D_3与Aβ_(1-42)诱导细胞LDH释放率的影响 |
| 2.4 Caspase-1-si RNA对1,25(OH)_2D_3与Aβ_(1-42)诱导细胞炎症因子IL-1β、IL-18水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中国老年人维生素 D 摄入与认知障碍防治进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一 AD的病因病机及治疗进展 |
| 1 中医学对痴呆的系统认识及研究进展 |
| 1.1 中医学对痴呆病名由来及发展的认识 |
| 1.2 中医学对痴呆病因病机的古代认识 |
| 1.3 中医学对痴呆辨证论治及相关研究的认识 |
| 1.4 中医学对痴呆治疗的古今认识 |
| 综述二 西医学对AD的发病机制及治疗进展研究 |
| 1 现代医学对AD的认识及研究进展 |
| 1.1 AD的概述及流行病学 |
| 1.2 现代医学对AD发病因素的认识及研究 |
| 1.3 现代医学对AD发病相关机制的认识 |
| 2 现代医学对AD治疗的认识 |
| 2.1 乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEIs) |
| 2.2 兴奋性氨基酸受体拮抗剂 |
| 2.3 甘露特纳胶囊 |
| 2.4 其他非药物治疗 |
| 3 问题与展望 |
| 综述三 Aβ在脑内异常沉积的机制 |
| 1.Aβ的产生、分布与清除、传递与运输的研究进展 |
| 1.1 Aβ的产生 |
| 2 Aβ的清除 |
| 2.1 细胞的清除作用 |
| 2.2 Aβ被降解酶的清除作用 |
| 2.3 中枢Aβ的清除途径 |
| 2.4 血液成分介导的Aβ清除 |
| 综述四 解毒益智方在阿尔茨海默病中的应用 |
| 1 解毒益智方的创立 |
| 1.1 脑髓理论 |
| 1.2 髓虚毒损 |
| 1.3 补肾益髓,活血化痰解毒法 |
| 2 解毒益智方通过调节SIRT1/AMPK通路抑制BACE1表达改善Aβ的沉积 |
| 3 解毒益智方对阿尔茨海默病的临床应用 |
| 实验研究 |
| 第一章 CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤保护性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠行为学的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ水平变化的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内BACE1表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（7）基于稀土上转换纳米复合材料在阿尔茨海默症治疗上的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 阿尔茨海默症的病理标志物 |
| 1.2.1 Aβ和Tau蛋白 |
| 1.2.2 载脂蛋白E和 Alpha-1 抗胰蛋白酶 |
| 1.2.3 游离micro RNAs |
| 1.3 稀土上转换发光纳米材料 |
| 1.3.1 上转换纳米粒子的合成与制备 |
| 1.3.1.1 热分解法 |
| 1.3.1.2 水/溶剂热法 |
| 1.3.1.3 化学共沉淀法 |
| 1.3.2 表面修饰和生物偶联 |
| 1.4 阿尔茨海默症的治疗策略 |
| 1.4.1 光动力疗法在阿尔茨海默症中的应用 |
| 1.4.2 光热疗法在阿尔茨海默症中的应用 |
| 1.4.3 抑制剂在阿尔茨海默症中的应用 |
| 1.5 本论文的选题依据和主要内容 |
| 1.5.1 本论文的选题依据 |
| 1.5.2 本论文的主要内容 |
| 2 HOCl控释的UCNPs-LMB纳米复合材料在AD病理性蛋白上的应用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 UCNPs的合成 |
| 2.2.3 还原态亚甲基蓝的合成 |
| 2.2.4 UCNPs-LMB的合成 |
| 2.2.5 Aβ聚集体的制备 |
| 2.2.6 单线态氧的检测 |
| 2.2.7 ThT荧光实验 |
| 2.2.8 圆二色谱实验 |
| 2.2.9 细胞培养及细胞毒性实验 |
| 2.2.10 细胞凋亡实验 |
| 2.2.11 细胞内MB释放实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 UCNPs-LMB的制备及表征 |
| 2.3.2 UCNPs-LMB的光学性质 |
| 2.3.3 单线态氧解聚Aβ聚集体 |
| 2.3.4 抑制Tau蛋白聚集 |
| 2.3.5 细胞毒性的测定 |
| 2.3.6 细胞内MB的释放 |
| 2.3.7 降低Aβ和 Tau蛋白对PC12 细胞的毒性 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 H_2O_2控释的UCNPs@m SiO_2@Au NPs纳米复合材料在AD病理性蛋白上的应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 UCNPs@mSiO_2@AuNPs的合成 |
| 3.2.3 药物担载和释放实验 |
| 3.2.4 ThT荧光实验 |
| 3.2.5 圆二色谱实验 |
| 3.2.6 细胞培养及细胞毒性实验 |
| 3.2.7 细胞内药物释放实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 UCNPs@mSiO_2@AuNPs的合成和表征 |
| 3.3.2 UCNPs@mSiO_2的比率型荧光变化和药物释放 |
| 3.3.3 抑制Aβ单体聚集 |
| 3.3.4 抑制Tau蛋白聚集 |
| 3.3.5 细胞毒性的测定 |
| 3.3.6 细胞内MB的释放 |
| 3.3.7 降低Aβ和 Tau蛋白对PC12 细胞的毒性 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 UCNPs@m SiO_2@Cu_xO纳米复合材料在清除ROS和 AD病理性蛋白上的应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 UCNPs@mSiO_2@Cu_xO的合成 |
| 4.2.3 药物担载和释放实验 |
| 4.2.4 清除ROS检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 UCNPs@mSiO_2@Cu_xO的合成和表征 |
| 4.3.2 UCNPs@mSiO_2的药物释放 |
| 4.3.3 监测和抑制Aβ单体聚集 |
| 4.3.4 清除ROS效果 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（8）猴头菌发酵菌丝体纯化多糖的抗阿尔茨海默症活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猴头菌概述 |
| 1.1.1 猴头菌研究进展及开发现状 |
| 1.1.2 猴头菌的活性成分研究 |
| 1.2 多糖的研究概述 |
| 1.2.1 多糖的特性及应用 |
| 1.2.2 多糖的生物学活性研究进展 |
| 1.3 阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)概述 |
| 1.3.1 AD研究现状 |
| 1.3.2 AD发生发展的机制研究进展 |
| 1.3.3 AD当下的治疗策略 |
| 1.4 立题背景与研究意义 |
| 第2章 猴头菌液体深层发酵工艺优化及发酵菌丝体活性成分分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器和材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验菌种 |
| 2.2.3 实验试剂及培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌种培养方案 |
| 2.3.2 满意度函数的建立 |
| 2.3.3 猴头菌发酵菌丝体干重及胞内多糖含量测定 |
| 2.3.4 猴头菌发酵培养基优化 |
| 2.3.5 猴头菌发酵条件优化 |
| 2.3.6 猴头菌液体深层发酵工艺产量验证 |
| 2.3.7 猴头菌发酵菌丝体活性成分分析 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 碳源种类对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.2 氮源对猴头菌发酵的影响 |
| 2.4.3 无机盐种类对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.4 P-B实验结果与分析 |
| 2.4.5 CCD结果与分析 |
| 2.4.6 不同温度对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.7 不同转速对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.8 培养基初始p H对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.9 接种量对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.10 猴头菌液体深层发酵周期确定及生长曲线的绘制 |
| 2.4.11 猴头菌液体深层发酵工艺产量验证结果 |
| 2.4.12 猴头菌发酵菌丝体中活性成分分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 猴头菌发酵菌丝体水提物抗AD活性初步研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器和材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验菌种、细胞系和动物 |
| 3.2.3 实验试剂和培养基 |
| 3.2.4 试剂盒 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 HE的制备 |
| 3.3.2 PC12 细胞培养方法 |
| 3.3.3 HE对细胞形态的影响 |
| 3.3.4 MTT法评估细胞活力 |
| 3.3.5 细胞凋亡核变化评估 |
| 3.3.6 MMP评估 |
| 3.3.7 细胞内Ca~(2+)浓度分析 |
| 3.3.8 细胞内ROS水平分析 |
| 3.3.9 Western Blotting分析 |
| 3.3.10 AD小鼠模型建立和药物治疗 |
| 3.3.11 AD小鼠行为学观察 |
| 3.3.12 小鼠解剖和样品收集 |
| 3.3.13 ELISA检测 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 HE通过调节β-tubulin III对 PC12 细胞分化的诱导作用 |
| 3.4.2 HE对DPC12 细胞活力的影响 |
| 3.4.3 HE对DPC12 细胞凋亡核变化的影响 |
| 3.4.4 HE对DPC12 细胞线粒体功能障碍的改善作用 |
| 3.4.5 HE对 DPC12 细胞中Ca~(2+)超载的改善作用 |
| 3.4.6 HE对 DPC12 细胞ROS积累的改善作用 |
| 3.4.7 HE对AD小鼠体重的影响 |
| 3.4.8 HE对AD小鼠行为学的影响 |
| 3.4.9 HE对 AD小鼠下丘脑和血清中ACh和 Ch AT浓度的调节作用 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 猴头菌发酵菌丝体胞内多糖的纯化、理化分析和结构研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器和材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验菌种和细胞系 |
| 4.2.3 实验试剂和培养基 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 HT22 细胞的培养 |
| 4.3.2 猴头菌发酵菌丝体活性粗多糖的制备 |
| 4.3.3 活性粗多糖的纯化 |
| 4.3.4 总糖和总蛋白含量测定 |
| 4.3.5 紫外光谱分析 |
| 4.3.6 单糖组成分析 |
| 4.3.7 分子量和均一性分析 |
| 4.3.8 红外光谱分析 |
| 4.3.9 多糖键合结构分析 |
| 4.3.10 多糖核磁解析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 猴头菌活性纯化多糖PHEB的制备 |
| 4.4.2 PHEB中总糖和总蛋白含量检测结果 |
| 4.4.3 PHEB紫外光谱分析结果 |
| 4.4.4 PHEB单糖组成分析结果 |
| 4.4.5 PHEB分子量和均一性分析结果 |
| 4.4.6 PHEB红外光谱分析结果 |
| 4.4.7 PHEB键合结构分析结果 |
| 4.4.8 PHEB的结构鉴定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 猴头菌纯化多糖基于氧化应激介导的Ca~(2+)平衡调节在辅助治疗AD作用中的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器和材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验动物 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 试剂盒 |
| 5.2.5 实验抗体 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 APP/PS1 小鼠饲养及分组给药 |
| 5.3.2 小鼠行为学考察 |
| 5.3.3 小鼠解剖和样品收集 |
| 5.3.4 苏木精/伊红(Hematoxylin and Eosin,H&E)染色 |
| 5.3.5 IHC分析 |
| 5.3.6 ELISA检测 |
| 5.3.7 蛋白质组学分析 |
| 5.3.8 Western Blotting分析 |
| 5.3.9 统计学分析 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 PHEB给药对APP/PS1 小鼠体重的影响 |
| 5.4.2 PHEB对 APP/PS1 小鼠不同器官的病理学的影响 |
| 5.4.3 PHEB对 APP/PS1 小鼠行为学的影响 |
| 5.4.4 PHEB对 APP/PS1 小鼠胆碱能因子的调节作用 |
| 5.4.5 PHEB对 APP/PS1 小鼠海马和血清中Aβ_(1-42)表达的清除作用 |
| 5.4.6 PHEB对 APP/PS1 小鼠海马中tau的磷酸化表达的调节作用 |
| 5.4.7 PHEB基于Nrf2 途径对APP/PS1 小鼠氧化应激的调节作用 |
| 5.4.8 LFQ蛋白质组学分析 |
| 5.4.9 PHEB基于对Ca~(2+)平衡的调节发挥抗AD作用 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 实验结论 |
| 6.2 前景展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（9）靶向Nrf2的小分子在神经保护中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 Keap1/Nrf2/ARE通路介绍及其分子作用机制 |
| 1.3 Keap1/Nrf2/ARE通路与神经系统疾病 |
| 1.4 Keap1/Nrf2/ARE通路与癌症 |
| 1.5 小分子Nrf2 调节剂 |
| 1.6 研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 几种小分子化合物对PC12 细胞的保护作用研究 |
| 2.1 硫辛酰胺的神经保护效果研究 |
| 2.2 燕麦酰胺类似物抵抗氧化应激对PC12 细胞进行双重保护 |
| 2.3 二苯并吡喃酮衍生物通过激活抗氧化防御系统来减轻氧化应激诱导的神经毒性 |
| 2.4 小白菊内酯通过调节Keap1/Nrf2/ARE信号通路来发挥神经保护作用 |
| 2.5 异硫氰酸烯丙酯通过激活Nrf2/ARE信号通路保护PC12 细胞免受氧化损伤 |
| 参考文献 |
| 第三章 IM3829 衍生物激活PC12 细胞中Nrf2/ARE通路 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.3 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 实验材料和方法 |
| 4.1 生物部分 |
| 4.2 化学部分 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 谱图 |
| 在学期间的科研成果 |
| 致谢 |
（10）虾青素通过Sirt1/PGC-1α通路对Aβ25-35介导的海马结构老化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:虾青素通过Sirt1/PGC1α通路对Aβ_2535介导小鼠认知功能的改善作用 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象及分组 |
| 2.2.1 动物分组 |
| 2.2.2 模型制作 |
| 2.3 Morris水迷宫行为学测试 |
| 2.3.1 定位航行实验 |
| 2.3.2 空间探索实验 |
| 2.4 免疫荧光染色 |
| 2.5 Western blotting |
| 2.6 Real Time PCR |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Morris水迷宫行为学测试 |
| 3.2 免疫荧光染色 |
| 3.2.1 SYN、BDNF在各组小鼠海马结构三个亚区的表达 |
| 3.2.2 Sirt1、PGC-1α在各组小鼠海马结构三个亚区的表达 |
| 3.3 Western blotting |
| 3.4 Real Time PCR |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:虾青素通过Sirt1/PGC-1α通路对Aβ_(25-35)介导小鼠海马结构神经元凋亡的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象及分组 |
| 2.2.1 动物分组 |
| 2.2.2 模型制作 |
| 2.3 免疫荧光染色 |
| 2.4 Western blotting |
| 2.5 Real Time PCR |
| 2.6 氧化应激指标检测 |
| 2.6.1 各组小鼠海马结构蛋白提取与测定 |
| 2.6.2 各组小鼠海马结构氧化应激相关指标测定 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫荧光染色 |
| 3.2 Western blotting |
| 3.3 Real Time PCR |
| 3.4 氧化应激相关指标检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:虾青素通过Sirt1/PGC-1α通路对Aβ_(25-35)介导PC12细胞衰老及凋亡的保护作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象及分组 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 CCK8法检测Aβ_(25-35)对PC12细胞生存活性的影响 |
| 2.2.3 PC12细胞分组 |
| 2.2.4 CCK8法检测各组PC12细胞生存活性的影响 |
| 2.3 PC12细胞内氧化应激指标ROS、SOD、MDA的检测 |
| 2.4 Annexin-V/PI双染法检测PC12细胞凋亡 |
| 2.5 衰老相关β-半乳糖苷酶染色 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 CCK8法检测Aβ_(25-35)对PC12细胞生存活性影响的结果 |
| 3.2 CCK8法检测PC12细胞的活性 |
| 3.3 PC12细胞内氧化应激指标检测 |
| 3.4 Annexin-V/PI双染法检测PC12细胞凋亡 |
| 3.5 衰老相关β-半乳糖苷酶染色 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 脑老化的发生机制及MRI改变的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、β-Amyloid对PC12细胞毒性损害的机制研究（论文参考文献）
- [1]APP棕榈酰化修饰在铝致Aβ1-42升高中的作用机制研究[D]. 袁春满. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]miRNA-195-5p调控ERK参与麦芽酚铝致PC12细胞tau蛋白异常磷酸化的分子机制[D]. 张云玮. 山西医科大学, 2021(01)
- [3]LNC001209通过CD36调节PI3K/AKT/mTOR信号通路参与铝致认知功能损害的机制研究[D]. 李欢. 山西医科大学, 2021(01)
- [4]Reelin信号转导通路在铝致PC12细胞tau蛋白异常磷酸化中的作用及其机制研究[D]. 任敬娟. 山西医科大学, 2021(01)
- [5]维生素D与老年人认知相关性及抗炎机制研究[D]. 成乐. 山西医科大学, 2021
- [6]解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究[D]. 朱晓婷. 长春中医药大学, 2021(01)
- [7]基于稀土上转换纳米复合材料在阿尔茨海默症治疗上的应用研究[D]. 沈扬. 浙江师范大学, 2021(02)
- [8]猴头菌发酵菌丝体纯化多糖的抗阿尔茨海默症活性研究[D]. 胡文继. 吉林大学, 2021
- [9]靶向Nrf2的小分子在神经保护中的研究[D]. 侯亚男. 兰州大学, 2021(09)
- [10]虾青素通过Sirt1/PGC-1α通路对Aβ25-35介导的海马结构老化的影响[D]. 刘宁. 中国医科大学, 2021(02)