一、氯离子通道蛋白1的细胞转染定位（论文文献综述）
牛灵芝[1]（2021）在《氯离子通道ClC-3在人晶状体上皮细胞凋亡中的作用》文中提出研究背景及目的:白内障是全球首位致盲眼病,是眼科的常见病、多发病,直接影响着人们的生活质量。晶状体上皮细胞的凋亡是白内障发生发展的重要病理基础,因此研究晶状体上皮细胞的凋亡机制对于预防和治疗白内障具有重要意义。目前已有大量的研究表明,晶状体上皮细胞凋亡受多种通路的调节,而氧化应激和内质网应激在其中发挥着重要的作用[1,2]。氯离子是生物体内含量最丰富的阴离子,存在于全身各组织细胞中。电压门控氯离子通道（voltage-gated chloride channel,ClC）是氯离子通道家族中的一员,而ClC-3氯离子通道是其中一个亚型,其广泛分布于哺乳动物的组织器官和各种细胞中,在维持细胞的容积平衡,调节细胞电活动、细胞增殖、凋亡等多种生理、病理过程中发挥重要作用。有研究证实ClC-3参与晶状体上皮细胞的增殖和迁移,与后发性白内障的发生密切相关,但它在晶状体上皮细胞凋亡中的作用尚未完全阐明。本研究以人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLECs）为研究对象,通过使用氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-（3-苯丙氨基）-苯甲酸（5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）benzoic acid,NPPB）,探讨氯离子通道对HLECs凋亡的影响及作用机制。利用过氧化氢和光照建立HLECs的细胞凋亡模型,进一步研究ClC-3在HLECs凋亡中的作用及其机制,以期为白内障的防治提供新的理论基础。方法:1.氯离子通道对HLECs凋亡的影响及作用机制。我们用不同浓度的NPPB作用于HLECs,使用酶标仪通过CCK-8检测不同浓度NPPB对HLECs活性的影响,并选择合适的浓度进行后续实验。将适宜浓度的NPPB作用于HLECs,通过荧光染色检测线粒体膜电位（JC-1）、细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的荧光强度,应用Western Blot法检测细胞内凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2及cleaved caspase 3表达水平的变化,观察细胞氧化应激及凋亡的发生;通过对细胞内钙离子测定及Western Blot法检测内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、CHOP、PERK、p-PERK、caspase 12表达水平的变化,评估HLECs中内质网应激的发生。应用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid,4-PBA）作用于NPPB诱导的HLECs,使用酶标仪通过CCK-8检测不同浓度NAC和4-PBA对HLECs活性的影响,并选择合适的浓度进行后续实验。分别使用适宜浓度的NAC和4-PBA与50μM NPPB共同作用,检测细胞内氧化应激、凋亡及内质网应激的变化。2.分别建立氧化应激损伤HLECs模型和光损伤HLECs模型,检测细胞内氧化应激、凋亡、内质网应激的发生及ClC-3表达的变化。分别将HLECs暴露于不同时长的1500勒克斯可见光及不同浓度、不同时间的过氧化氢中,使用酶标仪通过CCK-8检测过氧化氢和光照对HLECs活性的影响,并选择适宜的浓度和时间进行后续实验。将HLECs暴露于适宜的过氧化氢和光照中,通过荧光染色检测JC-1、ROS的荧光强度,应用Western Blot法检测细胞内凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2及cleaved caspase 3表达水平的变化,观察细胞氧化应激及凋亡的发生;通过对细胞内钙离子测定及Western Blot法检测内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、CHOP、PERK、p-PERK、caspase 12表达水平的变化,评估HLECs中内质网应激的发生。通过免疫荧光检测ClC-3在HLECs中的表达及定位;通过Western Blot法检测在过氧化氢和光照作用下ClC-3蛋白质水平表达的变化。3.建立ClC-3过表达HLECs,探讨ClC-3在HLECs氧化应激损伤和光损伤模型中的作用及机制。分别构建过表达ClC-3的过氧化氢损伤和光损伤HLECs模型。通过荧光确定慢病毒的感染效率,通过q-PCR法和Western Blot法验证HLECs中ClC-3的过表达。通过荧光染色检测JC-1、ROS荧光强度及Western Blot法检测细胞内凋亡相关蛋白cleaved caspase 3表达水平的改变,观察细胞氧化应激及凋亡的发生;通过荧光染色对细胞内钙离子测定及Western Blot法检测内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、PERK、p-PERK,评估HLECs中内质网应激的发生。调查在HLECs的氧化应激损伤和光损伤模型中,ClC-3与氧化应激、内质网应激及线粒体凋亡的关系。结果:1.氯离子通道阻滞剂NPPB抑制了HLECs的活性,且呈浓度依赖性。50μM NPPB能降低HLECs线粒体膜电位,上调细胞凋亡相关蛋白BAX和cleaved caspase3的表达,下调Bcl-2的表达,提示NPPB可以诱导HLECs线粒体途径的凋亡。NPPB可以引起细胞内ROS和钙离子增加,上调内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、CHOP、p-PERK、caspase 12的表达;使用ROS清除剂NAC和内质网应激抑制剂4-PBA均能降低NPPB诱导的HLECs凋亡、氧化应激和内质网应激,提示氯离子通道可能通过氧化应激、内质网应激途径保护HLECs。2.建立光损伤HLECs模型和氧化应激损伤HLECs模型。在1500勒克斯可见光的作用下HLECs的细胞活性随时间延长逐渐下降;过氧化氢对细胞的作用呈时间、浓度依赖性。200μM过氧化氢和1500勒克斯可见光分别作用于HLECs 24小时后可导致细胞线粒体膜电位下降,上调BAX和cleaved caspase 3的表达,下调Bcl-2的表达,引起细胞内ROS和钙离子增加,上调内质网应激相关蛋白ATF6、JNK、CHOP、p-PERK、caspase 12的表达,提示光损伤HLECs模型和氧化应激损伤HLECs模型均与氧化应激、内质网应激导致的线粒体凋亡有关。免疫荧光染色证实HLECs中存在ClC-3蛋白的表达,且ClC-3定位于内质网等细胞质中。检测200μM过氧化氢及1500勒克斯可见光对HLECs作用24小时、48小时、72小时后ClC-3蛋白质水平的表达,发现200μM过氧化氢和1500勒克斯可见光作用于HLECs 24小时和48小时ClC-3的表达上调,而72小时,ClC-3的表达下降,且低于正常水平,这提示ClC-3可能参与HLECs的氧化应激损伤和光损伤过程,并对HLECs起保护作用。3.使用含有ClC-3 c DNA的慢病毒感染HLECs,构建稳定过表达ClC-3的HLECs,通过q-PCR和Western Blot验证ClC-3过表达的稳定转染HLECs构建成功。在过氧化氢和光照诱导的损伤模型中,与感染空载体的HLECs相比,ClC-3过表达能减少细胞内ROS的产生、钙离子的聚集,抑制内质网应激途径中的p-PERK、ATF6、JNK的表达,降低caspase 3的活化,使cleaved caspase 3表达减少,从而减少细胞线粒体途径的凋亡,这提示ClC-3能通过减少过氧化氢和光照诱导的细胞内氧化应激和内质网应激,抑制HLECs线粒体途径的凋亡。结论:1.氯离子通道阻滞剂NPPB能促进HLECs氧化应激、内质网应激及线粒体途径凋亡的发生,氯离子通道对晶状体上皮细胞具有保护作用。2.过氧化氢损伤和光损伤可以促进HLECs中ROS的生成和内质网应激的发生,促进细胞的凋亡,我们成功构建了光损伤和氧化应激损伤HLECs模型。3.在HLECs中存在ClC-3的表达,并定位于内质网等细胞质中;在氧化应激损伤和光损伤HLECs模型中,ClC-3的表达发生变化。4.ClC-3可通过抑制过氧化氢和光照诱导的氧化应激、内质网应激,减少线粒体途径的细胞凋亡,ClC-3对晶状体上皮细胞具有保护作用。
张晓天[2]（2021）在《MicroRNA-217-5p靶向作用于CLIC4在动脉粥样硬化过程中对血管内皮细胞凋亡的影响》文中认为目的:目前,心脑血管疾病发病率逐年升高,而动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是众所周知的血管性疾病的重要病因,AS以富有脂质的斑块在大动脉壁聚集为特征,病理上可表现为血管内膜炎症细胞增殖,内皮功能障碍、管腔变窄及附壁血栓等。临床上常见的脑血管疾病,往往由AS为基础发展而来,在AS的血管壁病变的基础上,出现管腔狭窄、血流瘀滞、血栓形成,进而出现血管的闭塞或栓塞,出现脑部脑实质病变的相应症状及体征。目前,对AS发生机制的研究日益深入逐渐发现,血管内皮功能障碍可能是导致AS发生的重要始发事件之一。血管内皮细胞是位于血管内腔面的单层扁平细胞,是机体中一类非常重要的细胞群体,在血管通透性屏障、免疫防御和炎症反应中起着极为重要的作用。血管内皮细胞凋亡是AS发展的重要过程。一旦内皮细胞发生凋亡,血管内皮可能会失去调节脂质体内平衡及调节免疫和炎症的能力,继而导致脂质沉积,形成促进动脉斑块形成的环境。此外,管腔内不稳定斑块的出现可能也与血管内皮细胞的凋亡相关,斑块的脱落可能引起动脉到动脉的栓塞,导致急性冠状动脉堵塞和猝死。因此,调控血管内皮细胞凋亡是AS的潜在的预防和治疗途径。寻找血管内皮细胞凋亡的原因并探究其作用通路,对防治AS具有重要的理论价值及实践意义。细胞内氯离子通道蛋白4（Chloride Intracellular Channel4,CLIC4）又称为线粒体氯离子通道蛋白（Mitochondrial chloride channel protein,mt CLIC）,是细胞内氯通道蛋白（Cellular Chloride Channel Protein,CLIC）多种家族成员之一,分子量大小约为29KD。目前研究显示,其可以广泛表达于多种细胞中,包括肿瘤细胞、神经细胞及血管内皮细胞等,但其生物学功能尚不完全清楚。已报道的数据显示,CLIC4与多种细胞的凋亡相关,多种应激诱导剂均可导致CLIC4由细胞质转移到细胞核,核转位后启动细胞凋亡的发生。微小RNA（micro RNAs,miRNAs）是在生理和病理生理过程中负调节人类基因的18-22核苷酸非编码RNA,与多种疾病的发生发展密切相关。有报导表明,miR-217水平与动脉硬化内皮功能损伤有关,该miRNA被鉴定为衰老的人脐带内皮细胞中最深层的调控miRNA。在Target Scan、micro RNA.org、mir DB三个网站中,预测可能调控靶基因CLIC4的micro RNA均指向miR-217,但二者是否存在确实的标靶关系,还需要进一步验证。内皮细胞凋亡在血管动脉粥样硬化的发病机制中起着至关重要的作用。miRNAs和Cl ICs已经被证实参与了内皮细胞凋亡的过程,但其潜在的分子机制尚不完全清楚。本研究的主要目的是研究microrna-217-5p（miR-217-5p）和CLIC4的生物学效应,二者对AS中内皮细胞凋亡的影响及其相关机制,同时确定内皮细胞凋亡过程中,miR-217-5p与CLIC4的相互作用关系。研究方法:1.将载脂蛋白E基因敲除小鼠高脂饮食（High fat diet,HFD）喂养12周,构建AS小鼠模型。取主动脉后,采用HE染色方法观测主动脉硬化组织病理改变,oil red O染色法观察AS脂质沉积情况,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的表达情况,western blot、免疫荧光检测细胞中CLIC4蛋白水平。将氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL;50μg/m L）作用于人主动脉内皮细胞24h,建立体外AS模型。通过实时荧光定量PCR检测miR-217-5p的表达情况,采用Western blot,免疫荧光检测方法检测CLIC4蛋白水平。2.研究miR-217-5p及CLIC4对ox-LDL处理的主动脉内皮细胞的影响。人主动脉内皮细胞内转染miR-217-5p minics上调miR-217-5p水平,采用实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的水平以验证转染效果。采用流式细胞术及Hoechst染色法检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白水平,以及胞质和线粒体中细胞色素C的水平,JC-1法检测线粒体膜电位。细胞内转染CLIC4 siRNA下调CLIC4水平,Western blot检测细胞中CLIC4的水平,验证转染效果。流式细胞术及Hoechst染色法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9、Bax、Bcl-2水平,以及胞质和线粒体中细胞色素C的水平,JC-1法检测线粒体膜电位。3.研究miR-217-5p与CLIC4的标靶关系。人主动脉内皮细胞内转染miR-217-5p minics后,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞模型中CLIC4水平;通过荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性;同时过表达细胞内miR-217-5p及CLIC4水平,通过流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9水平,观察CLIC4过表达后是否可以逆转miR-217-5p的作用。结果:1.经苏丹染色、HE染色、油红染色证实小鼠动脉硬化模型建立成功,小鼠主动脉内皮细胞中,HFD组miR-217-5p表达水平较正常饮食（Normal diet,ND）组显着减少,HFD组CLIC4蛋白表达水平显着增加。免疫荧光染色显示,在HFD组中CLIC4的表达显着上调;体外人主动脉硬化模型中,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的水平,ox-LDL组miR-217-5p的水平较对照组显着减少;Western blot及免疫荧光检测结果显示,ox-LDL组CLIC4水平较对照组显着增加。2.人主动脉内皮细胞转染miR-217-5p minics后,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-217-5p的水平,与ox-LDL+NC组比较,ox-LDL+miR-217-5p mimics组细胞中miR-217-5p表达水平显着增加,证实转染成功;流式细胞术检测细胞凋亡情况,过表达miR-217-5p后ox-LDL+miR-217-5p mimics组较ox-LDL+NC组凋亡细胞比例减少;JC-1法检测线粒体膜电位,ox-LDL处理后,线粒体膜电位降低,而miR-217-5p过表达后线粒体膜电位得到恢复;Hoechst染色法检测细胞凋亡,ox-LDL处理后,凋亡细胞数明显增多,而转染miR-217-5p mimics后,凋亡细胞数减少;Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况,结果显示,ox-LDL处理后,Bcl-2蛋白表达量显着降低,而Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达量显着升高,miR-217-5p过表达可逆转这一变化;Western blot检测线粒体中细胞色素C的水平,ox-LDL组细胞线粒体中细胞色素C表达量与对照组相比降低,ox-LDL+miR-217-5p mimics组细胞线粒体中细胞色素C表达量较对照组显着增加。通过siRNA技术沉默人主动脉内皮中CLIC4基因的表达,随后,通过Hoechst染色法观察细胞凋亡情况。结果显示,ox-LDL处理后,凋亡细胞明显增多,而转染CLIC4 siRNA后,凋亡细胞数减少;同时,流式细胞术对细胞凋亡检测也发现,转染CLIC4 siRNA后较ox-LDL+NC siRNA组凋亡细胞比例减少;JC-1法检测线粒体膜电位结果显示,ox-LDL处理后,线粒体膜电位降低,而miR-217-5p过表达后线粒体膜电位得到恢复;Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况,结果显示,ox-LDL处理后,Bcl-2蛋白表达量显着降低,而Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达量显着升高,CLIC4 siRNA可逆转上述变化;Western blot检测线粒体中细胞色素C的水平,与ox-LDL+NC siRNA组比较,转染CLIC4 siRNA组细胞线粒体中细胞色素C表达量显着增加。3.实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞模型中CLIC4水平,ox-LDL处理后,与NC mimics组比较,miR-217-5p mimics组细胞中CLIC4 m RNA和蛋白的表达量均显着降低;荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性,miR-217mimics+CLIC4-wt组较NC mimics+CLIC4-wt和miR-217 mimics+CLCI4-mut组相比荧光素酶活性均显着下降;流式细胞术测定每组中的细胞凋亡,过表达miR-217-5p后ox-LDL+miR-217-5p mimics组较ox-LDL+NC组凋亡细胞比例减少,miR-217mimics+CLIC4-wt组显示凋亡细胞数较过表达miR-217-5p组增多。Wstern blot检测cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达水平,miR-217-5p过表达组较单纯ox-LDL处理组cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白表达量降低,miR-217 mimics+CLIC4-wt组较miR-217-5p过表达组上述凋亡相关蛋白水平升高,证实CLIC4过表达可逆转miR-217-5p的作用。结论:1.通过AS小鼠模型及体外实验证实,AS的主动脉内皮细胞中,miR-217-5p的表达降低,CLIC4的表达增加。2.CLIC4可以通过线粒体途径诱导主动脉内皮细胞的凋亡,而miR-217-5p过表达可以抑制线粒体途径诱导的主动脉内皮细胞凋亡。3.miR-217-5p能靶向结合CLIC4,miR-217-5p过表达可以降低CLIC4的表达,CLIC4过表达可逆转miR-217-5p的作用,二者呈负调控相关,共同调节线粒体途径诱导的主动脉内皮细胞凋亡。
高晓誉[3]（2020）在《CFTR氯离子通道对肺癌细胞增殖、迁移的影响及机制》文中研究表明CFTR（Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator）是一种c AMP依赖的氯离子通道,在多种上皮组织、心脏、平滑肌、神经元、内皮细胞、精子和卵子中广泛表达。CFTR在包括气道、胃肠道、生殖道、汗腺和唾液腺的分泌和吸收中起着重要的作用。因此,CFTR功能的缺陷与疾病有关,包括分泌性腹泻、囊性纤维化（CF）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等。近年来的研究发现,CFTR除了是一个离子通道,也是一个与癌症进程相关的多个信号通路的重要调节器,它的突变能增加胃肠道、胰腺等的患癌风险。研究表明,CFTR在非小细胞肺癌中的表达量低于正常肺组织,并且CFTR的低表达与非小细胞肺癌的进展和肿瘤的侵袭能力明显相关。因此,CFTR可能是肺癌患者预后、预测的生物标志物。在本研究中,利用qPCR、Western Blot、免疫细胞化学实验方法,比较CFTR在人正常支气管上皮细胞HBE、人支气管上皮细胞BEAS-2B、人支气管肺泡腺癌细胞NCI-H1650、人肺泡Ⅱ型腺癌细胞A549、人肺鳞癌细胞NCI-H226、人KRAS突变Ⅲ级表皮样肺癌细胞Calu-1中表达量的区别。利用免疫荧光实验方法,研究CFTR在肺癌细胞中的定位。利用三种CFTR抑制剂(CFTRinh-172、GlyH-101、BPO-27)和激活剂（Genistein、Forskolin、IBMX）作为工具药,通过细胞增殖、细胞凋亡、细胞划痕、细胞侵袭、Western Blot实验,研究CFTR的氯离子通道功能对上述不同类型的肺癌增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及作用机制。主要研究结果如下:1.qPCR、Western Blot和免疫细胞化学实验结果显示,CFTR在以下几种细胞中的表达量从高到低依次为HBE、H1650、A549、Calu-1、H226、BEAS-2B。其中,CFTR在HBE中的表达量远高于人支气管上皮细胞BEAS-2B。CFTR在肺癌细胞中的表达量高于人支气管上皮细胞BEAS-2B。CFTR在肺腺癌细胞H1650和A549中的表达量高于肺鳞癌细胞H226。CFTR在支气管肺泡腺癌细胞H1650中的表达量高于肺泡Ⅱ型腺癌细胞A549。CFTR在KRAS突变的肺癌细胞Calu-1中的表达量低于未发生突变的肺腺癌细胞H1650和A549。2.免疫荧光实验结果显示,CFTR定位于肺癌细胞的细胞膜和细胞质,在细胞质中的定位较多。3.细胞毒性实验结果显示,CFTRinh-172的浓度小于100μM时,对H1650和H226无毒性;小于50μM时,对A549和Calu-1无毒性。GlyH-101的浓度小于50μM时,对Calu-1无毒性;小于25μM时,对H1650、A549和H226无毒性。BPO-27的浓度小于25 n M时,对H1650、Calu-1和H226无毒性;小于20 n M时,对A549无毒性。Genistein的浓度小于100μM时,对H1650和Calu-1无毒性;小于50μM时,对A549和H226无毒性。IBMX的浓度小于100μM时,对Calu-1无毒性;小于50μM时,对H1650、A549和H226无毒性。Forskolin的浓度小于100μM时,对H1650、A549、Calu-1和H226都无毒性。4.细胞增殖实验结果显示,CFTR抑制剂CFTRinh-172、GlyH-101和BPO-27能够促进H1650、A549、Calu-1、H226细胞的增殖。在H1650中,CFTRinh-172的最佳浓度为12.5μM,BPO-27的最佳浓度为12.5 n M。在A549中,CFTRinh-172的最佳浓度为3.125μM,GlyH-101的最佳浓度为1.5625μM,BPO-27的最佳浓度为6.25 n M。在Calu-1中,GlyH-101的最佳浓度为3.125μM,BPO-27的最佳浓度为3.125 n M。在H226中,CFTRinh-172的最佳浓度为12.5μM,GlyH-101的最佳浓度为1.5625μM,BPO-27的最佳浓度为12.5 n M。5.细胞增殖实验结果显示,CFTR激活剂Genistein、IBMX和Forskolin能够抑制H1650、A549、Calu-1、H226细胞的增殖。在H1650中,IBMX的最佳浓度为25μM,Forskolin的最佳浓度为25μM。在A549中,Genistein的最佳浓度为50μM,IBMX的最佳浓度为50μM,Forskolin的最佳浓度为25μM。在Calu-1中,Genistein的最佳浓度为50μM,IBMX的最佳浓度为50μM,Forskolin的最佳浓度为6.25μM。在H226中,Genistein的最佳浓度为50μM,Forskolin的最佳浓度为6.25μM。6.细胞凋亡实验结果显示,CFTR抑制剂能够抑制A549细胞的凋亡,CFTRinh-172效果最明显,CFTR激活剂中只有Genistein促进了A549的凋亡。7.细胞划痕实验结果显示,CFTR抑制剂CFTRinh-172、GlyH-101和BPO-27能够促进H1650、A549、Calu-1、H226细胞的迁移。在H1650中,CFTRinh-172的最佳浓度为10μM,GlyH-101的最佳浓度为5μM,BPO-27的最佳浓度为16 n M。在A549细胞中,BPO-27的最佳浓度为16 n M。在Calu-1中,CFTRinh-172的最佳浓度为10μM,GlyH-101的最佳浓度为5μM。H226中,CFTRinh-172的最佳浓度为10μM,GlyH-101的最佳浓度为5μM,BPO-27的最佳浓度为16 n M。8.细胞划痕实验结果显示,CFTR激活剂Genistein、IBMX和Forskolin能够抑制肺癌细胞H1650、A549、Calu-1、H226的迁移。在H1650、A549、Calu-1和H226中,Genistein和IBMX的最佳浓度均为50μM,Forskolin的最佳浓度均为20μM。9.细胞侵袭实验结果显示,CFTRinh-72和GlyH-101均能促进A549和H226的侵袭。Forskolin、Genistein和IBMX均能抑制A549和H226的侵袭。10.Western Blot实验结果显示,CFTRinh-172明显促进了细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和波形蛋白Vimentin的表达;Forskolin明显抑制了细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和波形蛋白Vimentin的表达。11.Western Blot实验结果显示,Forskolin明显抑制了A549细胞的EMT进程,而加入BPO-27后降低了Forskolin的抑制作用。CFTRinh-172促进了A549细胞的EMT进程,而加入Genistein后降低了CFTRinh-172的促进作用。12.Western Blot实验结果显示,CFTR抑制剂CFTRinh-172和BPO-27促进了NF-κB主要家族成员蛋白p65的表达,CFTR激活剂Genistein和Forskolin抑制了p65的表达。结论:本研究发现,CFTR在不同类型肺癌细胞中的表达可能与支气管至肺泡的分级、肺癌细胞的分类、细胞的来源有关。CFTR氯离子通道能够通过调节细胞周期蛋白的表达来影响肺癌细胞的增殖,通过调节EMT进程和NF-κB信号通路的蛋白表达来影响肺癌细胞的迁移。因此,本文对肺癌进展的机制研究具有非常重要的理论意义,能够对特定靶点的肺癌治疗提供理论基础。
高建瓴[4]（2020）在《WNK1-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2信号转导通路在大鼠骨癌痛中的作用》文中提出本实验室前期研究发现:在骨癌痛（bonecancerpain,BCP）大鼠模型中,钠钾氯联合转运体-1（sodium-potassium-chloride cotransporter 1,NKCC1）和钾氯共转运体-2（potassium-chloride cotransporter 2,KCC2）通过调节细胞内 Cl-浓度,影响 γ-氨基丁酸（y-aminobutyric,GABA）受体的抑制性功能并参与骨癌痛的发生、发展。最新研究显示:病理状态下,赖氨酸缺陷蛋白激酶-1（with-nolysine kinases 1,WNK1）通过SPAK和OSR1蛋白途径,调节NKCC1/KCC2表达,从而影响细胞内Cl-浓度。据此,我们推测WNK1-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2信号转导通路可能参与骨癌痛,但未见相关报道。本研究拟建立大鼠骨癌痛模型,首先观察WNK1及其下游蛋白在BCP大鼠脊髓背角（dorsal horn,DH）和背根神经节（dorsalroot ganglion,DRG）中的表达,然后使用siRNA技术抑制WNK1,观察其下游蛋白的表达以及对BCP大鼠疼痛行为学的影响,进而采用神经药理学的方法研究WNK1-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2信号转导通路是否参与BCP的过程。本研究将丰富癌痛机理,为癌痛治疗药物的研发提供新思路。第一部分:WNK1在骨癌痛大鼠脊髓背角和背根神经节中的表达目的探讨WNK1激酶在骨癌痛大鼠脊髓DH和DRG中的表达变化方法将乳腺肿瘤Walker256细胞株注射于大鼠的左后肢胫骨干骺端,建立大鼠骨癌痛模型。雌性SD大鼠,随机分为正常对照组（control组,n=5）、假手术组（sham组,n=5）、骨癌痛组（BCP组,n=20）;其中control组大鼠不做任何处理,sham组大鼠在左后肢胫骨干骺端注射10μl Hank’s液,BCP组大鼠则注射Walker256乳腺癌细胞（1× 105/10μl Hank’s）;control组和sham组在观察第12天处死大鼠,BCP组在造模后3、6、9、12d分别处死5只大鼠,并提取L4-6脊髓及相应节段DRG。通过疼痛行为学、实时荧光定量PCR、免疫荧光及Western Blot方法进行以下研究:1、观察BCP大鼠疼痛行为学;2、观察WNK1在BCP大鼠脊髓DH和DRG上的表达变化;3、研究WNK1激酶在BCP大鼠脊髓DH和DRG上的表达分布及细胞定位。结果1、分别比较control组和sham组,BCP组大鼠机械缩足反射阈值（paw withdrawal mechanical threshold,PWMT）在建模后第 6 天开始显着降低（P<0.01）,并持续至第12天;2、比较sham组,建模后第6天开始WNK1 mRNA和蛋白在骨癌痛大鼠脊髓DH和DRG中表达上调（P<0.01或0.05）;3、免疫荧光显示:大鼠骨癌痛时,表达上调的WNK1广泛分布在脊髓背角（骨肿瘤同侧）Ⅰ-Ⅳ层,并主要集中于脊髓DH的Ⅰ-Ⅱ层以及DRG上;4、免疫荧光双标染色显示,WNK1主要表达于脊髓DH和DRG的神经元细胞上。结论骨癌痛大鼠脊髓DH和DRG的WNK1激酶表达水平明显上调。第二部分:鞘内注射WNK1 siRNA对大鼠骨癌痛的影响目的观察鞘内注射WNK1 siRNA对大鼠骨癌痛的影响方法体外合成并筛选针对WNK1的siRNA（siWNK1）。雌性SD大鼠,随机分为假手术组（sham组,n=10）、假手术+siWNK1组（sham+siWNK1组,n=5）、骨癌痛组（BCP 组,n=10）、骨癌痛+siWNK1（BCP+siWNK1 组,n=10）、骨癌痛+载体（BCP+vehicle 组,n=10）、骨癌痛+scrambled 组（BCP+scrambled 组,n=10）;其中,sham+siWNK1组和BCP+siWNK1分别在造模后的第9-11天连续鞘内注射siWNK13μg+jetPEI 0.36μl+0.5%GS 10μl,BCP+vehicle 组则连续鞘内注射 jetPEI 0.36μl+0.5%GS 1 0μl,BCP+scrambled 组则连续鞘内注射阴性 siRNA3 μg+jetPEI 0.36μ1+0.5%GS 1 0μl,sham组和BCP组处理同第一部分;除sham+siWNK1组外,各组第12天处死5只大鼠,提取L4-6节段脊髓DH和DRG。通过疼痛行为学、实时荧光定量PCR、免疫荧光及Western Blot方法进行以下研究:1、合成并筛选针对WNK1的siRNA,并评估其抑制率及细胞毒性;2、观察鞘内注射siWNK1后,BCP大鼠的疼痛行为学;3、鞘内注射siWNK1后,分别在BCP大鼠的脊髓DH和DRG观察WNK1及其下游的SPAK/OSR1、NKCC1/KCC2蛋白的表达变化。结果1、化学合成的siWNK1可以高效抑制PC12细胞上WNK1的表达,且无明显的细胞毒性;2、与BCP组比较,BCP+siWNK1组大鼠PWMT值升高（P<0.05）,并明显降低肢体使用指数（limb use score）（P<0.01）;3、与BCP组比较,BCP+siWNK1组大鼠脊髓DH和DRG的WNK1 mRNA水平明显降低（P<0.01）,同时伴随WNK1蛋白免疫荧光强度的减小（P<0.01）;4、与BCP组比较,BCP+siWNK1组大鼠DRG中NKCC1 mRNA和蛋白的表达显着降低（P<0.01）,而在脊髓DH中无显着变化;5、与BCP组比较,BCP+siWNK1组大鼠脊髓DH中KCC2 mRNA和蛋白的表达明显升高（P<0.01）;6、与 BCP 组比较,BCP+siWNK1 组大鼠 DRG 中 SPAK/OSR1 蛋白的表达降低（P<0.01）,而在脊髓DH中无显着改变。结论鞘内注射siWNK1可明显缓解BCP大鼠的骨癌痛,同时部分抑制WNK1下游的SPAK/OSR1、NKCC1/KCC2蛋白在脊髓DH或DRG的表达。第三部分:鞘内注射Closantel对大鼠骨癌痛的影响目的观察鞘内注射Closantel对大鼠骨癌痛的影响方法雌性SD大鼠,180-200g,随机分为假手术组（sham组,n=10）、假手术+Closantel 组（sham+Closantel 组,n=5）、骨癌痛组（BCP 组,n=10）、骨癌痛+载体（BCP+vehicle 组,n=10）、骨癌痛+Closantel 组（BCP+Closantel 组,n=10）;其中,sham+Closantel组和BCP+Closantel组在造模后的第9-11天连续三天鞘内注射Closantel（SPAK/OSR1 抑制剂）60μg/10μl DMSO,BCP+vehicle 组连续鞘内注射 10μl DMSO,sham组和BCP组处理同前;除sham+Closantel组外,各组第12天处死5只大鼠,提取L4-6节段脊髓DH和DRG。通过疼痛行为学、实时荧光定量PCR、免疫荧光及Western Blot方法进行以下研究:1、观察鞘内注射Closantel后,BCP大鼠的疼痛行为学;2、鞘内注射Closantel后,分别在BCP大鼠的脊髓DH和DRG观察NKCC1/KCC2蛋白的表达变化;3、鞘内注射Closantel后,在BCP大鼠DRG观察SPAK/OSR1和NKCC1/KCC2蛋白的相应表达情况。结果1、与BCP组比较,鞘内注射Closantel后BCP+Closantel组大鼠PWMT值明显上升（P<0.05）,并明显降低肢体使用指数（limb use score）（P<0.01）;2、与BCP组比较,鞘内注射Closantel后,BCP+Closantel组大鼠NKCC1 mRNA和蛋白在DRG中的表达明显降低（P<0.01）,而在脊髓DH中无显着改变;3、与BCP组比较,BCP+Closantel组大鼠在脊髓DH中KCC2 mRNA和蛋白的表达明显上调（P<0.01）;4、免疫荧光显示,NKCC1和SPAK/OSR1共表达于大鼠DRG,与BCP组比较,鞘内注射 Closantel 后 BCP+Closantel 组大鼠 DRG 中 SPAK/OSR1 和 NKCC1 的免疫荧光强度显着减少（P<0.01）。结论鞘内注射Closantel可明显缓解BCP大鼠的骨癌痛,同时抑制SPAK/OSR1-NKCC1在DRG中的表达和KCC2在脊髓DH中的表达。第四部分:NKCC1/KCC2表达对大鼠骨癌痛的影响目的探讨骨癌痛大鼠NKCC1/KCC2的表达及其变化对骨癌痛的影响方法雌性SD大鼠,随机分为5组:假手术组（sham组,n=10）、骨癌痛组（BCP组,n=10）、骨癌痛+溶媒组（BCP+vehicle 组,n=10）、骨癌痛+CLP257 组（BCP+CLP257组,n=5）、骨癌痛+bumetanide 组（BCP+bumetanide 组,n=5）。sham 组大鼠于左后肢胫骨干骺端注射10μl Hank’s液,BCP组大鼠则注射Walker256乳腺癌细胞（1×105/10μl Hank’s）。其中,在造模后的第9、10、11天,BCP+vehicle组鞘内注射DMSO 10μl;BCP+CLP257 组鞘内注射 CLP257（KCC2 激动剂）100μg/10μl DMSO;BCP+bumetanide 组鞘内注射 bumetanide（NKCC1 选择性抑制剂）100μg/10μlDMSO。造模后第12天,各组处死大鼠,分别提取脊髓DH和DRG。通过疼痛行为学、实时荧光定量PCR、Western Blot方法进行以下研究:1、观察鞘内注射bumetanide对骨癌痛大鼠疼痛行为学的影响及NKCC1表达的变化;2、观察鞘内注射CLP257对骨癌痛大鼠疼痛行为学的影响及KCC2表达的变化。结果1、比较BCP组,BCP+bumetanide组大鼠在鞘内给予bumetanide后的1-4h,其PWMT值升高（P<0.05或0.01）,肢体使用指数（Limbusescores）减小（P<0.01）,同时BCP+bumetanide组大鼠DRG中NKCC1蛋白表达显着降低（P<0.01）;2、比较BCP组,BCP+CLP257组大鼠在鞘内注射CLP257后2-4h,其PWMT值升高（P<0.05）,Limb use scores减小（P<0.01）,同时BCP+CLP257组大鼠脊髓DDH中KCC2蛋白表达明显上调（P<0.01）。结论NKCC1/KCC2参与骨癌痛过程,且NKCC1/KCC2表达变化影响BCP大鼠机械痛阈。
范博华[5]（2020）在《TMEM16A型Ca2+激活氯离子通道在前列腺癌细胞增殖和迁移中的作用》文中研究指明前列腺癌（Prostate cancer）是一种男性高发的恶性肿瘤,该病的患病率在全世界规模内占据男性易患肿瘤的第二位,其死亡率位居第六。早期前列腺癌可通过手术进行去势治疗,但大多数患者在治疗不久后会转变成去势抗性前列腺癌,这不仅增加了治疗的难度同时也提高了死亡率。因此探究前列腺癌的产生以及发展机制,找寻新的基因靶标和药物抑制剂,对于人类的健康以及患者寿命的延长至关重要。近年来的研究发现,一种Ca2+激活氯离子通道TMEM16A基因表达的变化可以参与前列腺癌的某些生物学功能的调控,但对于其调控的方式以及具体机制仍存在争议。TMEM16A（ANO1）是Anoctamin家族成员之一。该基因位于人类染色体11q13的CCND1-EMS1区域,此区域是肿瘤扩增区域,多种癌症的发生与该区域的扩增紧密相关。因此,TMEM16A可作为在前列腺癌研究中的重点对象之一。本论文选择了人的前列腺癌细胞系PC-3、LNCap、DU145以及前列腺上皮细胞RWPE-1,通过q PCR实验、免疫细胞化学以及Western Blot实验对TMEM16A在前列腺癌细胞中的表达进行分析;利用免疫荧光实验确定TMEM16A的表达定位;根据药理学抑制以及si RNA转染,采用CCK-8实验、划痕实验以及Transwell实验对TMEM16A在前列腺癌细胞的增殖和迁移中的作用进行分析,并观察雄激素DHT是否能通过影响TMEM16A的表达而在前列腺癌细胞生长和转移中发挥作用。本论文的研究目的是探讨TMEM16A在前列腺癌细胞增殖和迁移中的具体作用及其相关机制,为促进前列腺癌细胞增殖和迁移相关信号通路的研究提供新的思路,并且为TMEM16A有希望作为治疗转移性去势抗性前列腺癌的新靶标奠定基础。实验结果:1.通过免疫荧光实验结果显示,TMEM16A主要存在于前列腺癌细胞的质膜上,部分在胞质内。2.实时荧光定量PCR与WB的结果相一致,TMEM16A在RWPE-1、PC-3、DU145以及LNCap中均有表达。TMEM16A的表达在这四种细胞系中的顺序为PC-3>DU145>LNCap>RWPE-1。3.利用CCK-8实验检测当加入不同浓度的TMEM16A选择性抑制剂T16Ainh-A01和Ca CCinh-A01后,由于其离子通道活性减弱,降低了TMEM16A的活性,从而抑制了前列腺癌细胞的增殖。在PC-3中,抑制剂是以剂量依赖和时间依赖性的方式抑制其增殖;在10μM时,这两种抑制剂对LNCap和DU145细胞才开始有抑制作用。4.通过细胞划痕实验和Transwell实验观察,当加入不同浓度的TMEM16A抑制剂T16Ainh-A01和Ca CCinh-A01后,细胞的迁移速率被抑制。其中PC-3是以浓度和时间依赖的方式被抑制,对于DU145细胞,在T16Ainh-A01浓度为16μM时,抑制作用显着;Ca CCinh-A01浓度为8μM时抑制效果最好。5.利用终浓度为50n M的si RNA敲低TMEM16A的表达后,可以抑制PC-3细胞的增殖和迁移。6.利用雄性激素DHT来参与雄激素依赖型前列腺癌细胞LNCap中TMEM16A的表达,选择不同浓度的DHT刺激LNCap细胞,从mRNA以及蛋白水平观察其表达量的改变。q PCR以及WB实验结果表明,DHT能够诱导LNCap细胞中TMEM16A过表达,其中当DHT浓度为1μM时的效果显着。7.CCK-8实验和划痕实验结果显示,加入TMEM16A抑制剂T16Ainh-A01和Ca CCinh-A01以及雄激素受体AR拮抗剂比卡鲁胺BCT后,能够抑制由DHT参与的TMEM16A在LNCap中过表达导致的前列腺癌细胞的增殖和迁移。8.为了研究TMEM16A的表达在前列腺癌细胞增殖和迁移中的具体作用机制,选择由NF-κB通路介导的与增殖和迁移相关的蛋白Cyclin D1、Cyclin E1、E-cadherin、Vimentin,观察敲低TMEM16A的表达后,这些蛋白表达的变化,同时检测NF-κB（p65）的蛋白变化。结果显示:（1）当敲低PC-3细胞中TMEM16A的表达后,Cyclin D1、Cyclin E1、Vimentin蛋白表达被下调,而E-cadherin的表达被上调;（2）TMEM16A表达减少后,p65的表达也降低。综上所述,研究结果显示抑制Ca2+激活氯离子通道TMEM16A在前列腺癌细胞中的活性和表达可抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移。并且运用TMEM16A的选择性抑制剂同样可以抑制由DHT参与的细胞增殖和迁移的作用。本研究中发现通过敲低前列腺癌细胞中TMEM16A的表达后,由NF-κB通路介导的与增殖和迁移相关基因的表达也发生改变,这为揭示由于TMEM16A过度表达而促进前列腺癌发生发展的作用机制提供了重要的理论意义。
罗勇[6]（2020）在《电压门控氯离子通道2的异常表达与前列腺癌的进展和预后相关》文中认为研究背景及目的:前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）是男性泌尿生殖系常见的恶性肿瘤,近几年在中国的发病率呈明显上升趋势。传统的指标如PSA仍然不能准确判断和评估患者的前列腺癌的进展和预后。从基因和蛋白水平出发,寻找有效的标志物是针对PCa治疗的重要研究方向。有生物信息学预测电压门控氯离子通道2（voltage-gated chloride ion channel-2,CLCN2）可能作为潜在的标志物能够用来区分PCa与非PCa,并且能够判断PCa处于惰性还是进展状态。我们在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中分析发现CLCN2与细胞过程和代谢进程密切相关,目前还没有关于CLCN2对PCa预后和进展的报道,因此我们拟探究CLCN2在PCa中的表达水平,CLCN2与PCa患者临床病理特征和预后的关系及其在PCa细胞中增殖、侵袭和代谢等作用机制。材料和方法:利用前列腺组织芯片进行免疫组织化学染色检测CLCN2在PCa和良性前列腺组织中的蛋白表达差异,通过TCGA和Taylor数据库分析CLCN2与PCa患者的临床病理特征和预后的关系。通过细胞实验检测CLCN2表达下降对PCa的细胞过程和代谢进程的影响。结果:1.人PCa组织中CLCN2表达增加（P=0.035）,Gleason score（GS）>7中的CLCN2表达水平比GS≤7明显更高（P=0.047）。TCGA数据库中CLCN2高表达与血清PSA、GS、病理分级、临床分期、是否转移显着相关（P=0.024,P<0.000,P=0.002,P=0.035,P=0.014）,Taylor数据库中CLCN2高表达与是否转移显着相关（P=0.008）。2.Kaplan-Meier生存分析TCGA与Taylor数据库分别发现CLCN2高表达与低表达在无生化复发生存时间（BCR free survival time）和总体生存时间（Overall survival time）存在显着统计学差异（P<0.000、P=0.034、P=0.021、P=0.822）。Cox回归模型多因素分析TCGA数据库中CLCN2基因表达水平（P=0.046）、PSA水平（P<0.000）和病理分级（P=0.001）以及Taylor数据库中CLCN2基因表达水平（P=0.042）、Gleason评分（P=0.011）和远处转移（P<0.000）是PCa根治术后生化复发风险的独立预测指标。3.CLCN2表达下降抑制PCa细胞增殖、迁移和侵袭,但增大细胞周期,促进细胞凋亡。4.CLCN2表达下降抑制PCa糖代谢和线粒体代谢。结论:1.CLCN2促进PCa发生与进展,是前列腺根治性切除术后生化复发和转移风险的独立预测指标。2.通过分析PCa患者CLCN2的表达情况,可预测早期生化复发的概率,为临床提供有效信息,帮助制定个性化的治疗方案。
李瑶[7]（2020）在《CLIC4在食管鳞状细胞癌中的作用及机制初探》文中指出背景我国是世界上食管癌高发地区之一,食管癌是导致死亡的第五大癌症,每年平均病死约15万人。中国食管癌患者的主要类型是食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）。虽然诊断技术和疗法不断进步,但五年总体生存率仍不高,预后差[1]。因此,ESCC生物标志物或药物靶标的研究十分重要,尤其是对于ESCC高发地区的中国而言。胞内氯离子通道（chloride intracellular channels,CLICs）蛋白家族成员,具有广泛的功能,如电介质转运、离子稳态、细胞p H和细胞体积调节等,参与调节肿瘤细胞的增殖、迁移和对非肿瘤组织的侵袭,可能是潜在的肿瘤治疗靶标。尤其是CLIC4,不仅在特定的肿瘤类型或它们相应的基质中高表达,改变其定位和功能,既可以作为活性离子通道,亦可在某些细胞周期进程中参与信号转导,可以靶向肿瘤细胞而不影响正常细胞的生理功能,可能是肿瘤治疗的潜在药物靶点。目的研究ESCC患者癌组织中CLIC4的表达情况;研究CLIC4是否参与调控ESCC细胞的增殖、迁移或侵袭;本研究旨在进一步揭示CLIC4在ESCC中的作用及其调控机制,为治疗ESCC药物的研发提供新的思路。方法免疫组织化学和Western blot分析正常组织与癌组织中CLIC4的表达情况;构建慢病毒载体介导的CLIC4稳定低表达细胞株;克隆形成实验和CCK-8实验检测CLIC4敲低对ESCC细胞增殖的影响;Western blot检测CLIC4敲低后ESCC细胞中迁移相关蛋白如E-cadherin和N-cadherin等的变化情况。Western blot检测在ESCC病人组织样本中与CLIC4相关的蛋白,如雌激素反应性指蛋白（tripartite motif-containing 25,TRIM25）、微小染色体维持蛋白2（mini-chromosome maintenance protein2,MCM2）等的蛋白水平的变化情况。结果CLIC4在ESCC患者组织和ESCC细胞系中均高表达,与组织的转录组测序结果一致;成功构建稳定低表达CLIC4的ESCC细胞株;CLIC4不影响ESCC细胞的增殖,而是通过促进ESCC细胞的迁移发挥促癌作用;Western blot结果表明CLIC4敲低后,上调TRIM25的蛋白表达水平,下调MCM2和N-myc下游调节基因1（N-myc downstream related gene 1,NDRG1）的蛋白水平。结论CLIC4通过促进ESCC细胞的迁移发挥促癌作用,但不影响ESCC细胞的增殖,其机制可能为通过下调TRIM25的蛋白表达水平、上调NDRG1和MCM2的蛋白表达水平实现的。
黄波[8]（2020）在《替格瑞洛通过抑制NLRP3炎症小体缓解炎症性疾病的功能及其分子机制》文中提出机体的固有免疫细胞受到病原相关分子模式（PAMPs,Pathogen-associated molecular patterns）或危险相关分子模式（DAMPs,Danger-associated molecular patterns）的刺激时,NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3,NOD-,LRR-and pyrin domain-containing protein 3）与凋亡相关斑点蛋白（ASC,Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）和Pro-Caspase-1组装形成蛋白复合体,NLRP3炎症小体的激活能够促进Caspase-1和IL-1β的成熟和分泌,帮助免疫系统抵御感染和有害刺激。但是,过度激活的NLRP3炎症小体可以导致多种疾病的发生发展,如炎症性疾病和自身免疫性疾病等。我们的研究发现,一种靶向血小板嘌呤能受体P2Y purinoceptor 12(P2Y12)的口服抑制剂——替格瑞洛,能够在巨噬细胞中有效抑制NLRP3炎症小体的激活,并且这一过程不依赖于P2Y12受体信号通路。进一步的研究显示,替格瑞洛通过诱导氯离子通道蛋白降解和影响氯离子通道蛋白膜定位影响氯离子外流,从而抑制接头蛋白ASC多聚体的形成。小鼠疾病动物模型进一步证实,替格瑞洛能够在体内发挥抑制炎症激活的功能并缓解炎症状态,这一体内功能的实现也不依赖于P2Y12受体。更重要的是,冠心病患者口服替格瑞洛能够快速有效地抑制外周血单个核细胞中NLRP3炎症小体的激活。我们的研究证明替格瑞洛可能作为NLRP3炎症小体的有效抑制剂用于保护机体免受有害刺激造成的免疫损伤。
王清华[9]（2020）在《钙激活氯通道TMEM16A在急性胰腺炎中的表达及作用机制研究》文中指出急性胰腺炎是一种常见的内科急腹症,发病急,病情发展快,若不及时治疗,可能会危及生命。其发病原因多种多样,多与胆结石等胆道疾病,酗酒及暴饮暴食,胃十二指肠疾病等相关联。急性胰腺炎的病理机制仍未阐明,临床上也没有特异性的治疗药物,特别是急性重症胰腺炎,目前仍是对症治疗,愈后很差。各种因素如酶原激活、炎症介质、氧化应激、微循环障碍、核因子κB（NF-κB）途径等均参与了该发病过程。尽管胰腺炎的发病机制还没有完全阐明,研究表明激活胰腺腺泡细胞内的炎症信号通路是产生急性胰腺炎至关重要的分子机制。急性胰腺炎时,胰腺本身病变及由此引起的巨噬细胞和中性粒细胞被激活,释放大量的促炎性细胞因子,引发炎症的“瀑布样级联反应”,进而引起全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征（MODS）。胰腺腺泡细胞释放的促炎症细胞因子如TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-10和ICAM-1,以及免疫细胞是影响炎症死亡率的重要因素。这些炎症介质通过复杂的信号通路促进胰腺炎的发生与发展,其中IL-6/IL-6R/STAT3信号通路在急性胰腺炎及其全身炎症反应中起十分重要的作用。跨膜蛋白16A（TMEM16A）于2008年同时被3个实验室证明为钙激活氯离子通道,并提示其功能可能与细胞分裂周期、细胞增殖有关,是一类能被细胞内钙离子激活的阴离子通道。TMEM16A表达在多种细胞上,参与唾液腺、汗腺、呼吸道、及肠道上皮细胞钙依赖性氯离子分泌,调控平滑肌收缩,控制胃肠道起搏等生理过程。另外,TMEM16A参与肿瘤、高血压、疼痛等疾病的病理生理过程。在哮喘等呼吸道炎症的发病过程中都有TMEM16A的参与。TMEM16A在胰腺导管细胞,胰岛和腺泡细胞上均有表达,参与了导管细胞癌的发生和胰岛素分泌,并且参与胰腺细胞的酸性调节作用。但是,存在于腺泡细胞上的TMEM16A在急性胰腺炎中有什么样的作用及其作用机制有哪些仍未见报道。对此我们做了以下的研究:第一部分TMEM16A在急性胰腺炎胰腺腺泡细胞上高表达目的:在动物和细胞水平观察雨蛙肽引起急性胰腺炎不同时间点的TMEM16A通道蛋白的改变。方法:在体研究:全部小鼠按体重随机分组,分为对照组、雨蛙肽6h组、雨蛙肽12h组和雨蛙肽24h组,每组6只。小鼠购进后适应性饲养3天,各组小鼠实验前一天晚自由饮水条件下禁食12小时,各雨蛙肽实验组小鼠腹腔注射雨蛙肽的生理盐水溶液,剂量为50μg/kg,每间隔1小时1次,连续注射7次,对照组小鼠同法腹腔注射等体积生理盐水。于最后一次注射后6小时、12小时和24小时分批取材:小鼠眼眶内眦部位进行采血,取出血后离心,保存血清。小鼠颈椎脱臼法处死后,摘取胰腺组织,western blot方法检测胰腺组织中TMEM16A通道蛋白;另取一部分,放置于4%的多聚甲醛溶液中进行固定,采用HE染色的方法进行验证病理形态学检测,采用免疫组织化学方法检测胰腺组织TMEM16A通道蛋白的表达。体外实验:急性分离小鼠胰腺细胞,原代培养细胞,待细胞长到培养皿90%时,加入10-8M雨蛙肽,作用不同时间后收集细胞;保留细胞培养上清液;大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J细胞进行细胞培养,用10-8M雨蛙肽作用不同时间点后收集细胞,保留细胞培养上清液。免疫荧光方法检测TMEM16A通道蛋白在AR42J上的表达;提取细胞提取蛋白,western blot方法检测TMEM16A通道蛋白的表达。结果:雨蛙肽成功诱导急性胰腺炎小鼠模型;急性胰腺炎小鼠胰腺组织中TMEM16A通道蛋白表达上调;原代培养小鼠胰腺腺泡细胞炎症模型中TMEM16A通道蛋白表达上调;TMEM16A通道蛋白在正常AR42J细胞膜上表达,炎性AR42J细胞中TMEM16A通道蛋白表达上调。结论:TMEM16A通道蛋白在胰腺腺泡细胞上表达,雨蛙肽诱导的急性胰腺炎腺泡细胞TMEM16A通道蛋白表达上调。第二部分急性胰腺炎IL-6增多激活IL-6/IL-6R/STAT3促进TMEM16A表达目的:观察急性胰腺炎时IL-6表达增多及其对IL-6/IL-6R/STAT3信号通路的激活与TMEM16A蛋白调节作用。方法:ELISA方法检测急性胰腺炎小鼠胰腺组织及血清、原代培养小鼠胰腺腺泡细胞炎性培养上清液和AR42J细胞炎性培养上清液中IL-6含量。雨蛙肽处理AR42J细胞后western blot方法检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路激活和TMEME16A的表达。检测IL-6对AR42J细胞TMEM16A表达的浓度曲线筛选;IL-6处理AR42J细胞后检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路激活和TMEM16A的表达;IL-6和IL-6R中和抗体同时处理AR42J细胞后检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路激活和TMEM16A的表达;IL-6和STAT3抑制剂CucurbitacinⅠ同时处理AR42J细胞后检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路和TMEM16A的表达。结果:急性胰腺炎小鼠胰腺及血清中IL-6含量升高;炎性急性分离小鼠胰腺腺泡细胞培养上清液中IL-6含量增多,炎性AR42J细胞培养上清液中IL-6含量增多;雨蛙肽处理的AR42J细胞引起IL-6增多,激活IL-6/IL-6R/STAT3信号通路促进TMEM16A的高表达;IL-6促进AR42J细胞TMEM16A高表达,并且具有浓度依赖性;IL-6通过与IL-6R结合促进AR42J细胞TMEM16A的高表达;IL-6通过促进STAT3磷酸化促进AR42J细胞TMEM16A的高表达。结论:雨蛙肽引起的急性胰腺炎IL-6增多,激活IL-6/IL-6R/STAT3信号通路促进TMEM16A的高表达;IL-6促进AR42J细胞TMEM16A高表达;IL-6通过IL-6/IL-6R/STAT3促进TMEM16A的高表达。第三部分TMEM16A高表达促进急性胰腺炎的发生发展目的:观察急性胰腺炎高表达TMEM16A对炎症病理进程、IL-6含量及核转录因子NF-κB的影响。方法:全部小鼠按体重随机分组,分为对照组、模型组、T16Ainh-A01预先组和T16Ainh-A01后治组,除对照组外各组小鼠腹腔注射雨蛙肽的生理盐水溶液,剂量为50μg/kg,每间隔1小时1次,连续注射7次,对照组小鼠同法腹腔注射等体积生理盐水。T16Ainh-A01预先组于第一次注射雨蛙肽前30分钟时腹腔注射TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01,剂量为1mg/kg。T16Ainh-A01后治组于第一次注射雨蛙肽后30分钟时腹腔注射TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01,剂量为1mg/kg。于最后一次注射后12小时取材:小鼠眼眶内眦部位进行采血,取出血后,离心取上清。小鼠颈椎脱臼法处死后,摘取胰腺组织,采用ELISA法检测血清和胰腺组织匀浆液中IL-6的含量;western blot方法检测胰腺组织中TMEM16A通道蛋白和胞浆胞核内NF-κB活性亚基p65表达;另取一部分,放置于4%的多聚甲醛溶液中进行固定,采用HE染色的方法进行病理形态学检测,采用免疫组织化学方法检测胰腺组织TMEM16A通道蛋白的表达。通过质粒的转化、质粒扩增、质粒DNA提取、pEGF-TMEM16A和pEGF-TMEM16A-siRNA质粒与lipofection2000转染试剂共同转染AR42J细胞,荧光显微镜下观察转染效率,经过G418进行筛选,分别提取细胞胞浆蛋白和核蛋白,观察细胞核与胞浆中NF-κB的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-6的表达。通过免疫共沉淀方法检测TMEM16A与IP3R的相互作用,用BAPTA阻断细胞内的钙离子,观察钙离子升高对NF-κB活性的影响。结果:雨蛙肽作用于AR42J细胞12小时已经出现显着炎症反应,此时TMEM16A通道蛋白表达增多;对细胞内NF-κB活性亚基p65检测发现胞浆中的p65蛋白减少,而细胞核中的p65蛋白表达增多,p65蛋白发生了细胞核转移;而给予T16Ainh-A01后TMEM16A通道蛋白下降,胞浆中p65蛋白增加,而减少细胞核中的p65蛋白增多,抑制了p65蛋白发生了细胞核转移。腹腔注射雨蛙肽12小时的小鼠血清和胰腺组织中IL-6的含量明显增加,与雨蛙肽组小鼠相比,给予TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01后血清和胰腺组织IL-6的含量均下降;HE染色结果显示,与对照组（生理盐水）相比,雨蛙肽作用小鼠12小时,胰腺发生急性炎症表现:小叶间隙增宽、水肿、炎性细胞渗出、腺泡细胞肿胀细胞水肿。而腹腔注射TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01后,炎症病理变化得到改善。pEGF-TMEM16A过表达质粒和敲除质粒转染成功的AR42J细胞呈现绿色荧光,经过G418进行筛选后检测TMEM16A蛋白,转染效率约为50%;过表达TMEM16A的细胞,胞浆中p65蛋白减少,细胞核中p65蛋白增多,核p65/浆p65比值明显增大,p65发生核转移;敲除TMEM16A后,应用雨蛙肽复制急性炎症模型时发现胞浆中p65蛋白增多,细胞核中p65蛋白减少,抑制了p65发生核转移,同时细胞上清中IL-6的含量减少。TMEM16A与IP3R具有直接结合作用;BAPTA阻断细胞内的钙离子,减少了钙离子对NF-κB激活作用。结论:急性胰腺炎时TMEM16A蛋白表达,通过与胞浆内IP3R直接作用,增加细胞内的钙离子浓度,促进胰腺炎症细胞NF-κB核转移,促进IL-6的合成与释放,促进急性胰腺炎的病理进程。
陈艺方[10]（2020）在《MicroRNA-381靶向调控TMEM16A对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的影响》文中指出在我国,肺癌已经成为病发率和致死率最高的恶性肿瘤之一。由于肺癌具有十分复杂的发生发展机制,因此对其确切的发病的分子机理仍处于探究阶段。TMEM16A（Transmembrane protein 16A）是钙激活氯离子通道Ca CCs（Calcium-activated Chloride Channels）的分子基础,广泛分布于哺乳动物的各种组织内。最近研究发现TMEM16A的表达失调和癌症的发生发展相关。本研究利用生物信息学系列在线软件分别对TMEM16A、miR-381以及TMEM16A与癌症之间的相关性进行了系统分析;将非小细胞肺癌的各细胞系作为研究对象,通过脂质体转染、实时荧光定量PCR、Western blot、细胞免疫荧光、CCK、划痕、上皮-间充质（EMT）以及Transwell方法,分析了TMEM16A在非小细胞肺癌细胞系中的表达和细胞定位,系统探究了miR-381与TMEM16A之间的表达相关性及调控关系,分析了miR-381靶向调控TMEM16A的表达对制非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭的影响。生物信息学分析发现TMEM16A是miR-381的预测靶基因,TMEM16A的3’-UTR中存在miR-381的结合位点,因此,TMEM16A可能是miR-381的直接靶点。且TCGA分析发现TMEM16A在癌症的发生发展中具有重要影响。Western Blot和荧光实时定量PCR结果均显示TMEM16A在非小细胞肺癌细胞系中的表达量高于正常肺上皮细胞,且经过细胞免疫荧光实验发现TMEM16A主要表达于细胞的细胞膜和细胞质中。但是肺腺癌与肺鳞癌的差别不明显。荧光实时定量PCR检测发现miR-381在非小细胞肺癌细胞系中的表达量明显低于正常肺上皮细胞系;荧光实时定量PCR和Western Blot的结果均表明miR-381与TMEM16A之间呈负调控关系,提高非小细胞肺癌细胞系中miR-381的表达量可以明显降低非小细胞肺癌细胞系中TMEM16A在m RNA和蛋白水平上的表达量。CCK、划痕、EMT的Western Blot以及Transwell等实验结果表明miR-381可以靶向负调控TMEM16A的表达进而有效的抑制非小细胞肺癌在增殖、迁移和侵袭方面的进展。综上本研究为非小细胞肺癌的靶向药物研发和靶向治疗提供新的线索。
二、氯离子通道蛋白1的细胞转染定位（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、氯离子通道蛋白1的细胞转染定位（论文提纲范文）
（1）氯离子通道ClC-3在人晶状体上皮细胞凋亡中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 细胞凋亡 |
| 1.1.2 氧化应激 |
| 1.1.3 内质网应激 |
| 1.1.4 氧化应激与内质网应激的关系 |
| 1.2 CLC-3 在细胞中的作用 |
| 1.2.1 C1C-3 在细胞凋亡中的作用机制 |
| 1.2.2 C1C-3 在细胞增殖中的作用机制 |
| 1.2.3 C1C-3 在细胞迁移和侵袭中的作用机制 |
| 1.3 总结 |
| 第2章 NPPB对晶状体上皮细胞凋亡的影响及其机制 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 晶状体上皮细胞的常规培养、传代、冻存及计数 |
| 2.2.2 CCK-8 检测细胞存活率 |
| 2.2.3 ROS的测定 |
| 2.2.4 线粒体膜电位检测(JC-1)法检测细胞早期凋亡 |
| 2.2.5 细胞内钙离子的测定 |
| 2.2.6 提取蛋白样本、测定蛋白浓度及Western Blot法检测细胞内蛋白质的表达 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 NPPB对 HLECs活性的影响 |
| 2.3.2 NPPB对 HLECs凋亡的影响 |
| 2.3.3 NPPB对 HLECs内 ROS含量的影响 |
| 2.3.4 NPPB对 HLECs内质网应激的影响 |
| 2.3.5 NAC和4-PBA对 NPPB诱导的HLECs凋亡的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 氧化应激损伤及光损伤对晶状体上皮细胞凋亡的影响及其机制 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 统计学方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CCK-8 检测细胞存活率 |
| 3.2.2 ROS的测定 |
| 3.2.3 JC-1 检测细胞早期凋亡 |
| 3.2.4 细胞内钙离子的测定 |
| 3.2.5 提取蛋白样本、测定蛋白浓度及Western Blot法检测细胞内蛋白质的表达 |
| 3.2.6 细胞的免疫荧光 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 氧化应激损伤和光损伤对HLECs活性的影响 |
| 3.3.2 氧化应激损伤和光损伤对HLECs凋亡的影响 |
| 3.3.3 氧化应激损伤和光损伤对HLECs内 ROS含量的影响 |
| 3.3.4 氧化应激损伤和光损伤对HLECs内质网应激的影响 |
| 3.3.5 ClC-3在HLECs 中的定位及氧化应激损伤和光损伤对HLECs 中 ClC-3 表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 CLC-3 过表达对晶状体上皮细胞凋亡的影响及其机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 验仪器 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒介导的ClC-3 过表达HLECs的构建及验证 |
| 4.2.2 ROS的测定 |
| 4.2.3 JC-1 法检测细胞早期凋亡 |
| 4.2.4 细胞内钙离子的测定 |
| 4.2.5 提取蛋白样本、测定蛋白浓度及Western Blot法检测细胞内蛋白质的表达 |
| 4.2.6 引物设计、提取RNA样本、测定RNA浓度、RNA逆转录及q-PCR法检测细胞内ClC-3 m RNA的表达 |
| 4.2.7 统计学处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 慢病毒感染HLECs最适浓度的测定及转染效率的验证 |
| 4.3.2 氧化应激损伤和光损伤对ClC-3 过表达HLECs稳定转染细胞凋亡的影响 |
| 4.3.3 氧化应激损伤和光损伤对ClC-3 过表达HLECs内 ROS含量的影响 |
| 4.3.4 氧化应激损伤和光损伤对 ClC-3 过表达 HLECs 内质网应激的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（2）MicroRNA-217-5p靶向作用于CLIC4在动脉粥样硬化过程中对血管内皮细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:研究动脉粥样硬化中CLIC4及miR-217-5p在动脉内皮细胞中的表达情况 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和生产公司 |
| 2.2 主要配制试剂及配制方法 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法及步骤 |
| 2.4.1 动物模型建立及分组 |
| 2.4.2 小鼠主动脉内皮细胞分离 |
| 2.4.3 HE染色 |
| 2.4.4 油红0色 |
| 2.4.5 人主动脉内皮细胞培养及分组处理 |
| 2.4.6 实时荧光定量PCR |
| 2.4.7 Western blot检测蛋白表达 |
| 2.4.8 免疫荧光染色检测 |
| 2.4.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠主动脉苏丹Ⅳ染色结果 |
| 3.2 小鼠主动脉HE染色结果 |
| 3.3 小鼠主动脉油红O染色结果 |
| 3.4 实时荧光定量PCR结果 |
| 3.5 Western blot结果 |
| 3.6 免疫荧光染色检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 过表达miR-217-5p及敲低CLIC4对ox-LDL处理的主动脉内皮细胞的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及生产公司 |
| 2.2 主要配制试剂及配制方法 |
| 2.3 主要仪器与设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实验分组 |
| 2.4.2 人主动脉内皮细胞转染 |
| 2.4.3 实时荧光定量PCR检测miR-217-5p的水平 |
| 2.4.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.4.5 Hoechst染色检测细胞凋亡 |
| 2.4.6 Western blot测定蛋白含量 |
| 2.4.7 JC-1 测定线粒体膜电位 |
| 2.4.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 过表达miR-217-5p后的相关实验结果 |
| 3.1.1 过表达miR-217-5p后荧光定量PCR检测miR-217-5p结果 |
| 3.1.2 过表达miR-217-5p后细胞凋亡检测结果 |
| 3.1.3 过表达miR-217-5p后JC-1 检测线粒体膜电位结果 |
| 3.1.4 miR-217-5p过表达后Hoechst染色检测细胞凋亡结果 |
| 3.1.5 过表达miR-217-5p后Westernblot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况 |
| 3.1.6 miR-217-5p过表达后线粒体及胞质中细胞色素C水平Western lot检测结果 |
| 3.2 敲低CLIC4 后的相关实验结果 |
| 3.2.1 Western blot检测验证转染效果 |
| 3.2.2 敲低CLIC4后细胞凋亡检测结果 |
| 3.2.3 敲低CLIC4后JC-1 检测线粒体膜电位结果 |
| 3.2.4 敲低CLIC4后Hoechst染色检测细胞凋亡结果 |
| 3.2.5 敲低CLIC4后Western lot检测细胞中凋亡相关蛋白表达情况 |
| 3.2.6 CLIC4敲低后线粒体及胞质中细胞色素C水平Western blot检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 miR-217-5p与CLIC4的靶向关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂及生产公司 |
| 2.2 主要配制试剂及其配制方法 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 过表达miR-217-5p后测定人主动脉内皮细胞中CLIC4 水平 |
| 2.4.1.1 细胞转染 |
| 2.4.1.2 荧光定量PCR检测细胞模型中CLIC4水平 |
| 2.4.1.3 Western blot检测细胞模型中CLIC4水平 |
| 2.4.2 荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性 |
| 2.4.2.1 双荧光素酶检测 |
| 2.4.3 miR-217-5p、CLIC4共转染 |
| 2.4.3.1 细胞培养及转染 |
| 2.4.3.2 实时荧光定量PCR检测CLIC4转染效果 |
| 2.4.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.4.3.4 Western blot检测 |
| 2.4.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 实时荧光定量PCR检测细胞模型中CLIC4水平 |
| 3.2 Western blot检测细胞模型中CLIC4水平 |
| 3.3 荧光素酶报告法验证miR-217-5p与CLIC4之间的靶向性 |
| 3.4 实时荧光定量PCR及Western lot验证CLIC4过表达转染效果 |
| 3.5 流式细胞术测定细胞凋亡 |
| 3.6 Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞内氯离子通道蛋白 4(CLIC4)的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）CFTR氯离子通道对肺癌细胞增殖、迁移的影响及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 CFTR概述 |
| 1.1.1 CFTR的结构 |
| 1.1.2 CFTR的基本功能 |
| 1.1.3 CFTR在肺组织中的作用 |
| 1.1.4 CFTR的突变 |
| 1.2 CFTR与癌症的关系 |
| 1.2.1 CFTR与肿瘤细胞生长和增殖的关系 |
| 1.2.2 CFTR与肿瘤细胞迁移和侵袭的关系 |
| 1.3 CFTR与肺癌 |
| 1.3.1 肺癌的诱因及治疗手段 |
| 1.3.2 CFTR与非小细胞肺癌 |
| 1.3.3 CFTR与肺鳞状细胞癌 |
| 1.4 CFTR参与的信号通路 |
| 1.4.1 CFTR—NF-κB信号途径 |
| 1.4.2 CFTR—NF-κB—uPA/uPAR信号途径 |
| 1.4.3 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.5 CFTR的激活剂与抑制剂 |
| 1.5.1 CFTR的激活剂 |
| 1.5.2 CFTR的抑制剂 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 实时荧光定量PCR |
| 2.2.3 Western Blot |
| 2.2.4 免疫细胞化学 |
| 2.2.5 免疫荧光 |
| 2.2.6 细胞毒性实验 |
| 2.2.7 细胞增殖实验 |
| 2.2.8 细胞凋亡实验 |
| 2.2.9 细胞划痕实验 |
| 2.2.10 细胞侵袭实验 |
| 2.2.11 数据统计分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 CFTR在肺癌细胞中的表达和定位 |
| 3.1.1 CFTR在肺癌细胞中mRNA水平的表达 |
| 3.1.2 CFTR在肺癌细胞中蛋白水平的表达 |
| 3.1.3 免疫细胞化学法检测CFTR在肺癌细胞中的表达 |
| 3.1.4 CFTR在 HBE和 A549 细胞中的定位 |
| 3.2 CFTR氯离子通道对肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.2.1 CFTR通道活性对肺癌细胞活力的影响 |
| 3.2.2 抑制CFTR通道活性对肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.2.3 激活CFTR通道活性对肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.2.4 CFTR通道活性对肺癌细胞凋亡的影响 |
| 3.3 CFTR氯离子通道对肺癌细胞迁移的影响 |
| 3.3.1 抑制CFTR通道活性对肺癌细胞迁移的影响 |
| 3.3.2 激活CFTR通道活性对肺癌细胞迁移的影响 |
| 3.3.3 CFTR通道活性对肺癌细胞侵袭的影响 |
| 3.4 CFTR氯离子通道在肺癌细胞增殖和迁移中的作用机制 |
| 3.4.1 CFTR通道活性对肺癌细胞周期蛋白和波形蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 CFTR通道活性对肺癌细胞EMT进程的影响 |
| 3.4.3 CFTR通道活性对肺癌细胞NF-κB信号蛋白p65 表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CFTR在不同类型肺癌细胞中的表达可能与支气管至肺泡的分级、肺癌细胞的分类、细胞的来源有关 |
| 4.2 CFTR氯离子通道可能通过NF-κB信号通路影响肺癌细胞的迁移 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）WNK1-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2信号转导通路在大鼠骨癌痛中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 WNK1在骨癌痛大鼠脊髓背角和背根神经节中的表达 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 鞘内注射WNK1 SIRNA对大鼠骨癌痛的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 鞘内注射CLOSANTEL对大鼠骨癌痛的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 NKCC1/KCC2表达对大鼠骨癌痛的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 神经病理痛的脊髓抑制机制 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）TMEM16A型Ca2+激活氯离子通道在前列腺癌细胞增殖和迁移中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 前列腺癌概述 |
| 1.1.1 前列腺癌发生发展的风险因素 |
| 1.1.2 前列腺癌的诊断 |
| 1.1.3 前列腺癌的治疗方法 |
| 1.1.4 前列腺癌常见的肿瘤标志物 |
| 1.1.5 前列腺癌细胞系的研究进展 |
| 1.2 Ca~(2+)激活氯离子通道TMEM16A |
| 1.2.1 TMEM16家族的结构 |
| 1.2.2 TMEM16家族的功能 |
| 1.2.3 TMEM16A的结构 |
| 1.2.4 TMEM16A 蛋白的功能研究 |
| 1.2.5 Ca CCs 抑制剂的研究进展 |
| 1.2.6 TMEM16A在癌症中的研究进展 |
| 1.3 本论文研究的目的和意义 |
| 2 TMEM16A 在前列腺癌细胞中表达及定位 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实时荧光定量PCR检测细胞中的TMEM16A |
| 2.2.2 免疫细胞化学 |
| 2.2.3 免疫荧光检测TMEM16A的表达定位 |
| 2.2.4 蛋白质免疫印迹检测细胞中的TMEM16A |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 TMEM16A在前列腺癌细胞中mRNA水平上的表达情况 |
| 2.3.2 TMEM16A 在前列腺癌细胞中的表达定位情况 |
| 2.3.3 TMEM16A在前列腺癌细胞中蛋白水平上的表达情况 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 TMEM16A的表达在前列腺癌细胞增殖和迁移中的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验材料 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CCK-8检测细胞增殖活力 |
| 3.2.2 划痕实验观察细胞的迁移 |
| 3.2.3 Transwell检测细胞的迁移 |
| 3.2.4 细胞转染 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 药理学抑制TMEM16A的活性对前列腺癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 药理学抑制TMEM16A的活性对前列腺癌细胞迁移的影响 |
| 3.3.3 si RNA干扰TMEM16A的表达对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 TMEM16A在雄激素DHT参与下对前列腺癌细胞LNCap增殖和迁移的探究 |
| 4.1 主要实验材料与试剂 |
| 4.1.1 主要实验材料 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 qPCR检测TMEM16A在 LNCap细胞中的表达 |
| 4.2.2 WB检测TMEM16A在 LNCap细胞中的表达 |
| 4.2.3 CCK-8 检测LNCap细胞的增殖活力 |
| 4.2.4 划痕实验观察LNCap细胞的迁移 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 DHT作用于LNCap细胞后TMEM16A在 mRNA水平上的表达情况 |
| 4.3.2 DHT作用于LNCap细胞后TMEM16A在蛋白水平上的表达情况 |
| 4.3.3 药理学抑制对DHT参与LNCap细胞增殖的影响 |
| 4.3.4 药理学抑制对DHT参与LNCap细胞迁移的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 TMEM16A参与前列腺癌细胞增殖和迁移相关信号通路的初探 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要实验材料 |
| 5.1.2 主要实验试剂 |
| 5.1.3 主要实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 PC-3细胞的转染 |
| 5.2.2 蛋白质免疫印迹实验 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 TMEM16A 的表达对参与 NF-κB 通路相关增殖和迁移基因在蛋白水平上的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（6）电压门控氯离子通道2的异常表达与前列腺癌的进展和预后相关（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 前列腺及前列腺癌流行病学概述 |
| 1.2 前列腺癌发生和发展的机制 |
| 1.2.1 肿瘤的分子生物学基础和特征 |
| 1.2.2 前列腺癌发生和发展的机制 |
| 1.3 前列腺癌临床诊疗进展 |
| 1.3.1 前列腺癌的症状 |
| 1.3.2 前列腺癌的诊断 |
| 1.3.3 前列腺癌Gleason评分系统 |
| 1.3.4 前列腺癌的分期与分级 |
| 1.4 前列腺癌的治疗 |
| 1.4.1 保守治疗 |
| 1.4.2 根治性前列腺切除术 |
| 1.4.3 放射治疗 |
| 1.4.4 化疗 |
| 1.4.5 内分泌治疗 |
| 1.4.6 免疫治疗 |
| 1.4.7 前列腺癌术后的生化复发(BCR) |
| 1.5 电压门控氯通道(ClC)基因家族研究进展 |
| 1.5.1 ClC基因家族转运蛋白的概述 |
| 1.5.2 ClC基因家族转运蛋白的生理功能 |
| 1.6 电压门控氯通道2(CLCN2)基因研究进展 |
| 1.6.1 CLCN2基因研究概述 |
| 1.6.2 CLCN2基因分子特性 |
| 1.6.3 CLCN2基因生物学特点 |
| 1.6.4 CLCN2基因的功能 |
| 1.6.5 CLCN2基因调控机制 |
| 1.6.6 CLCN2基因相关疾病 |
| 1.7 氯离子基因与肿瘤增殖和侵袭 |
| 1.8 本研究拟解决的问题 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 人前列腺癌组织中CLCN2表达增加 |
| 3.2 CLCN2的表达水平与前列腺癌临床病理特征的关系 |
| 3.3 .CLCN2表达下降抑制细胞增殖、侵袭和迁移,增大细胞周期,促进细胞凋亡 |
| 3.4 CLCN2表达下降抑制糖代谢和线粒体代谢 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 CLCN2在前列腺癌诊断和治疗的临床意义 |
| 4.2 CLCN2促进前列腺癌的发生发展及转移 |
| 4.3 CLCN2促进前列腺癌进展的可能机制 |
| 结论 |
| 本研究的不足之处 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）CLIC4在食管鳞状细胞癌中的作用及机制初探（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要实验耗材及来源 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 质粒、细胞株 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 45例临床样本的基本信息及医学伦理 |
| 3 结果 |
| 3.1 ESCC组织的RNA-seq检测结果 |
| 3.2 CLIC4在组织样本中的表达 |
| 3.3 体外实验验证CLIC4对ESCC细胞生理功能的影响 |
| 3.4 CLIC4发挥生物学作用的机制研究 |
| 3.5 CLIC4对消化道肿瘤的作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 本课题的创新性发现 |
| 4.2 开展本课题的设想和目的 |
| 5 进一步展望 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 CLIC4与肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
（8）替格瑞洛通过抑制NLRP3炎症小体缓解炎症性疾病的功能及其分子机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验小鼠 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 引物及基因编辑序列 |
| 2.1.5 实验耗材 |
| 2.1.6 实验仪器 |
| 2.2 细胞实验 |
| 2.2.1 小鼠巨噬细胞分离培养 |
| 2.2.2 人外周血单个核细胞分离实验 |
| 2.2.3 小鼠血小板分离实验 |
| 2.2.4 炎症小体细胞模型构建 |
| 2.2.5 细胞样品收集及处理 |
| 2.2.6 siRNA干扰细胞基因表达实验 |
| 2.2.7 CRISPR-Cas9构建基因敲除细胞系 |
| 2.3 分子生物学及生化实验 |
| 2.3.1 酶联免疫吸附实验 |
| 2.3.2 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.3.3 免疫荧光 |
| 2.3.4 免疫沉淀/免疫共沉淀 |
| 2.3.5 流式细胞术 |
| 2.3.6 荧光实时定量PCR |
| 2.3.7 ASC多聚体检测 |
| 2.3.8 胞内氯离子检测 |
| 2.3.9 小鼠基因型鉴定 |
| 2.4 小鼠疾病模型 |
| 2.4.1 铝佐剂诱导的小鼠腹腔炎 |
| 2.4.2 LPS诱导的小鼠脓毒血症 |
| 2.5 冠心病患者外周血样收集及检测 |
| 2.6 数据处理及统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 替格瑞洛具有抑制NLRP3炎症小体的新功能 |
| 3.1.1 替格瑞洛对NLRP3炎症小体激活不同阶段的影响 |
| 3.1.2 替格瑞洛在巨噬细胞中抑制NLRP3炎症小体的激活 |
| 3.2 替格瑞洛抑制NLRP3炎症小体不依赖于抗血小板信号通路 |
| 3.2.1 替格瑞洛抑制NLRP3 炎症小体不依赖于P2Y12受体 |
| 3.2.2 替格瑞洛抑制NLRP3 炎症小体不依赖于ADCY-c AMP-PKA轴 |
| 3.2.3 替格瑞洛抑制NLRP3 炎症小体不依赖于ENT1-腺苷通路 |
| 3.3 替格瑞洛抑制NLRP3炎症小体的分子机制 |
| 3.3.1 替格瑞洛不影响NLRP3 的泛素化、NLRP3和ASC的相互作用 |
| 3.3.2 替格瑞洛抑制ASC多聚体的形成 |
| 3.3.3 替格瑞洛抑制ASC依赖型炎症小体的激活 |
| 3.3.4 替格瑞洛抑制ASC聚集不依赖于Syk和 JNK |
| 3.3.5 替格瑞洛抑制氯离子外流影响ASC多聚体形成 |
| 3.3.6 替格瑞洛通过自噬途径降解氯离子通道蛋白 |
| 3.3.7 替格瑞洛影响氯离子通道蛋白膜定位抑制NLRP3炎症小体 |
| 3.4 替格瑞洛治疗NLRP3相关炎症性疾病的潜在疗效 |
| 3.4.1 替格瑞洛缓解小鼠腹腔炎炎症状态 |
| 3.4.2 替格瑞洛在小鼠脓毒血症动物模型中的保护作用 |
| 3.4.3 口服替格瑞洛改善冠心病患者外周血炎症水平 |
| 3.4.4 替格瑞洛抑制NLRP3炎症小体工作模式 |
| 4 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 外源性化学物对NLRP3炎症小体的调控作用及其分子机制 |
| 主要参考文献 |
| 附录 |
| 附件1 浙江大学实验动物福利伦理委员会项目审批件 |
| 附件2 杭州市第一人民医院伦理委员会审查意见 |
| 作者简历及博士期间取得的科研成绩 |
（9）钙激活氯通道TMEM16A在急性胰腺炎中的表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :TMEM16A在急性胰腺炎胰腺腺泡细胞上高表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及来源 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.4 小鼠分组及急性胰腺炎模型的建立 |
| 2.4.1 分组及给药 |
| 2.4.2 取材 |
| 2.5 小鼠胰腺腺泡细胞的分离培养及细胞炎症模型建立 |
| 2.5.1 小鼠胰腺腺泡细胞的分离培养 |
| 2.5.2 急性分离腺泡细胞炎症模型建立 |
| 2.6 AR42J细胞传代培养及炎症模型的建立 |
| 2.6.1 AR42J细胞传代培养 |
| 2.6.2 AR42J细胞炎症模型的建立 |
| 2.7 观察指标及检测方法 |
| 2.7.1 胰腺病理学检测—苏木素/伊红(HE)染色 |
| 2.7.2 免疫组织化学技术 |
| 2.7.3 western blot |
| 2.7.4 细胞免疫荧光技术 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎病理模型 |
| 3.2 TMEM16A在急性胰腺炎小鼠胰腺中高表达 |
| 3.3 TMEM16A在小鼠胰腺原代培养腺泡细胞的急性炎症中高表达 |
| 3.4 炎性AR42J细胞中TMEM16A表达结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :急性胰腺炎IL-6 增多激活IL-6/IL-6R/STAT3 促进TMEM16A表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及来源 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3.1 IL-6不同浓度的配制 |
| 2.3.2 CucurbitacinⅠ液体 |
| 2.3.3 含Ig G抗体1μg/ml的培养液 |
| 2.3.4 含IL-6R中和抗体的培养液 |
| 2.3.5 TMEM16A抗体稀释液 |
| 2.4 IL-6--酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 2.4.1 标准品的配置 |
| 2.4.2 标准品曲线的制备 |
| 2.4.3 待测样品IL-6含量检测 |
| 2.5 不同浓度IL-6处理AR42J细胞 |
| 2.6 IL-6和IL-6R中和抗体共同处理AR42J细胞 |
| 2.7 IL-6和STAT3 抑制剂CucurbitacinⅠ共同处理AR42J细胞 |
| 2.8 IL-6R抗体和CucurbitacinⅠ分别处理AR42J炎性细胞 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 急性胰腺炎小鼠胰腺及血清中IL-6增加 |
| 3.2 炎性AR42J细胞上清液中IL-6增加 |
| 3.3 炎性细胞中激活 IL-6/IL-6R/STAT3 信号通路促进 TMEM16A 的高表达 |
| 3.4 IL-6对AR42J细胞TMEME16A影响浓度筛选 |
| 3.5 IL-6与IL-6R相互作用促进AR42J细胞TMEM16A的高表达 |
| 3.6 IL-6 通过激活STAT3 信号促进腺泡细胞TMEM16A的高表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 IL-6急性胰腺炎早期升高 |
| 4.2 STAT3在急性胰腺炎中被激活 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :TMEM16A高表达促进急性胰腺炎发生发展 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及来源 |
| 2.3 常用试剂的配制 |
| 2.4 动物实验 |
| 2.5 质粒的基因表达 |
| 2.5.1 质粒的转化 |
| 2.5.2 质粒扩增 |
| 2.5.3 单个菌落培养 |
| 2.5.4 质粒DNA提取 |
| 2.5.5 转染 |
| 2.5.6 细胞基因表达及细胞处理 |
| 2.5.7 细胞核蛋白提取 |
| 2.6 免疫共沉淀 |
| 2.7 western blot |
| 2.8 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TMEM16A高表达促进急性胰腺炎的病理进程 |
| 3.1.1 T16Ainh-A01 抑制急性胰腺炎病理进程 |
| 3.1.2 T16Ainh-A01 抑制急性胰腺炎胰腺细胞TMEM16A蛋白表达 |
| 3.2 T16Ainh-A01 减少胰腺炎症中IL-6 含量 |
| 3.3 TMEM16A高表达激活小鼠胰腺炎腺泡细胞NF-κB信号通路 |
| 3.4 TMEM16A高表达激活AR42J细胞NF-κB信号通路 |
| 3.4.1 TMEM16A质粒在AR42J细胞过表达 |
| 3.4.2 TMEM16A质粒过表达促进AR42J细胞NF-κB核转移 |
| 3.4.3 敲除TMEM16A抑制胰腺炎细胞NF-κB核转移及减少IL-6 的释放 |
| 3.4.4 T16Ainh-A01 能抑制AR42J炎症细胞TMEM16A表达 |
| 3.4.5 TMEM16A增加钙离子释放促进急性胰腺炎病理进程 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1.急性胰腺炎病因 |
| 2.急性胰腺炎发病机制 |
| 3.细胞因子与急性胰腺炎 |
| 3.1 促炎性细胞因子 |
| 3.1.1 白细胞介素1β(IL-1β) |
| 3.1.2 白细胞介素6(IL-6) |
| 3.1.3 白细胞介素8(IL-8) |
| 3.1.4 白细胞介素17A(IL-17A) |
| 3.1.5 白细胞介素18(IL-18) |
| 3.1.6 白细胞介素33（IL-33） |
| 3.1.7 肿瘤坏死因子（TNF-α） |
| 3.2 抗炎性细胞因子 |
| 3.2.1 白细胞介素-10(IL-10) |
| 3.2.2 白细胞介素-22(IL-22) |
| 4.展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）MicroRNA-381靶向调控TMEM16A对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 TMEM16蛋白家族研究进展 |
| 1.1.1 钙激活氯离子通道(CaCCs) |
| 1.1.2 TMEM16A及其他家族成员 |
| 1.1.3 TMEM16A与癌症的关系 |
| 1.2 肺癌研究进展 |
| 1.2.1 肺癌的分类 |
| 1.2.2 非小细胞肺癌不同亚型间的差异 |
| 1.2.3 KRAS突变 |
| 1.3 miRNA与miR-381进展概况 |
| 1.3.1 miRNA及其研究价值 |
| 1.3.2 miR-381与非小细胞肺癌 |
| 1.4 本论文的研究目的和意义 |
| 第2章 TMEM16A、miR-381 与癌症间相关性的生物信息学分析 |
| 2.1 TMEM16A的蛋白性质和功能的分析 |
| 2.1.1 TMEM16A生物信息学分析结果 |
| 2.2 TMEM16A蛋白对癌症的影响 |
| 2.2.1 TMEM16A蛋白与癌症相关性分析 |
| 2.2.2 在线网站分析结果 |
| 2.3 miR-381的生物信息学分析 |
| 2.3.1 miR-381生物信息学分析软件 |
| 2.3.2 生物信息学软件分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 TMEM16A在非小细胞肺癌中的表达及定位 |
| 3.1 TMEM16A在非小细胞肺癌细胞系中m RNA水平上的相对表达量 |
| 3.1.1 实验材料、试剂与设备 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.2 Western Blot法检测TMEM16A蛋白在个细胞系蛋白水平中的表达情况 |
| 3.2.1 实验材料、试剂与设备 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 TMEM16A蛋白在各细胞系中的分布 |
| 3.3.1 实验材料、试剂与设备 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 miR-381 在非小细胞肺癌细胞系中的表达及对TMEM16A的靶向调控 |
| 4.1 miR-381在非小细胞肺癌细胞系中的表达及细胞系间的差异 |
| 4.1.1 实验材料、试剂与设备 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 miR-381对TMEM16A的靶向调控 |
| 4.2.1 实验材料、试剂与设备 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 miR-381 靶向TMEM16A对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的调控作用 |
| 5.1 miR-381 靶向TMEM16A对非小细胞肺癌增殖的调控作用 |
| 5.1.1 实验材料、试剂与设备 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 实验结果 |
| 5.2 miR-381 靶向TMEM16A对非小细胞肺癌迁移的调控作用 |
| 5.2.1 实验材料、试剂与设备 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 实验结果 |
| 5.3 miR-381 靶向TMEM16A对非小细胞肺癌侵袭的调控作用 |
| 5.3.1 实验材料、试剂与设备 |
| 5.3.2 实验方法 |
| 5.3.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
四、氯离子通道蛋白1的细胞转染定位（论文参考文献）
- [1]氯离子通道ClC-3在人晶状体上皮细胞凋亡中的作用[D]. 牛灵芝. 吉林大学, 2021(01)
- [2]MicroRNA-217-5p靶向作用于CLIC4在动脉粥样硬化过程中对血管内皮细胞凋亡的影响[D]. 张晓天. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]CFTR氯离子通道对肺癌细胞增殖、迁移的影响及机制[D]. 高晓誉. 辽宁师范大学, 2020(02)
- [4]WNK1-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2信号转导通路在大鼠骨癌痛中的作用[D]. 高建瓴. 苏州大学, 2020(06)
- [5]TMEM16A型Ca2+激活氯离子通道在前列腺癌细胞增殖和迁移中的作用[D]. 范博华. 辽宁师范大学, 2020(02)
- [6]电压门控氯离子通道2的异常表达与前列腺癌的进展和预后相关[D]. 罗勇. 华南理工大学, 2020(02)
- [7]CLIC4在食管鳞状细胞癌中的作用及机制初探[D]. 李瑶. 安徽医科大学, 2020(04)
- [8]替格瑞洛通过抑制NLRP3炎症小体缓解炎症性疾病的功能及其分子机制[D]. 黄波. 浙江大学, 2020(01)
- [9]钙激活氯通道TMEM16A在急性胰腺炎中的表达及作用机制研究[D]. 王清华. 中国医科大学, 2020(01)
- [10]MicroRNA-381靶向调控TMEM16A对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的影响[D]. 陈艺方. 辽宁师范大学, 2020