一、重组葡激酶N端缺失突变体对纤溶酶原的激活作用（论文文献综述）
王贵鑫,吕莉[1]（2011）在《溶栓药物的药理学研究进展》文中进行了进一步梳理血栓栓塞（thromboembolism,TE）性疾病是较常见的血管病变,心脑血管的血栓栓塞性疾病更是危及患者生命的病症,药物溶栓是目前较为有效的治疗方法之一。溶栓药物大多是纤溶酶原激活物或类似物,能直接或间接激活纤维蛋白溶解酶原变成纤维蛋白溶解酶,并降解纤维蛋白。自上世纪80年代应
王旻[2]（2011）在《融合蛋白SRH的构建及治疗动脉粥样硬化的作用机制研究》文中指出动脉粥样硬化（ atherosclerosis, AS）是众多心脑血管疾病共同的病理基础,也是心血管系统疾病中最常见的疾病,严重危害人类健康。AS的发病机制存在多种学说,但任何一种学说均不能全面的解释AS的发生发展。近年来大量细胞及分子水平的实验研究表明尽管AS的致病因素多种多样,但是AS所导致的是一条相似的发展途径即慢性炎症病理过程。血管内皮受损,脂质氧化及浸润,血小板、炎性细胞活化、粘附并浸润,平滑肌细胞迁移、增殖等伴随着AS发生、进展、恶化及斑块破裂并血栓形成的全过程。针对AS的发展特点,我们考虑是否可以通过构建多靶点的治疗药物,针对不同病理过程从多个方面抑制AS的进展。研究表明炎症贯穿于动脉粥样硬化发生和发展的全过程,是动脉粥样硬化过程中许多病理生理改变的共同基础。凝血酶和血小板作为参与凝血过程的重要因子是多种抗凝药物作用的靶点,同时越来越多的研究表明在动脉粥样硬化发生发展过程中血管损伤处聚集的凝血酶,血小板对血管壁炎症反应具有重要促进作用。由于局部凝血功能亢进在损伤内皮表面常常有纤维蛋白形成的网状结构出现,在这种网状结构中聚集了大量血小板,白细胞,凝血酶等,这些物质的存在加剧了损伤血管处的炎症反应促进了动脉粥样硬化的发展。由此可见凝血酶和血小板同时参与了凝血及炎症两个反应过程。在AS发展的晚期,患者常常伴有冠状动脉综合征的症状,临床应用抗凝及溶栓治疗。因此我们设计构建了多功能融合蛋白SRH,针对抗凝、抗炎及溶栓三个方面实现抗AS的作用。天然葡激酶（staphylokinase, SAK）可以选择性地作用于纤维蛋白原,具有纤维蛋白特异性高,对血小板富集型血栓作用强,副作用小,价格便宜等优点。我室研制的rSAK已经完成临床试验评价,研究结果表明,rSAK的再通率显着高于r-tPA,显示出良好的临床应用前景。因此我们设计了以SAK为骨架的多功能融合蛋白SRH,其分子结构主要包括三个部分:SAK分子,RGD序列,水蛭素12肽。SAK主要发挥其溶解纤维蛋白的作用,RGD序列具有抑制血小板聚集功能,水蛭素12肽具有抗凝血酶功能。本研究的主要内容包括以下四个部分一利用重叠延伸PCR方法,在SAK突变体的基础上构建了SRH融合蛋白基因,将编码融合基因的DNA片段重组入表达载体pBV220,转化E.coli BL21感受态细胞进行诱导表达。结果显示,SRH在E.coli/pBV220受体菌中主要以可溶性形式表达。将E.coli BL21/pBV220-SRH菌株进行发酵,大量表达后,进行纯化。经过阴离子交换层析和凝胶过滤层析两步纯化,SRH纯度达95%以上。我们进一步对融合分子SRH的各个功能域进行了功能检测分析,使用纤维蛋白平板溶圈法,底物发色法等检测SRH溶栓活性,结果显示SRH蛋白溶栓活性为（1.3±0.15）×104 AU/mg低于SAK（4.1±0.12）×104 AU/mg;ELISA检测SRH蛋白结合凝血酶能力,结果显示SRH蛋白具有结合凝血酶的能力,进一步使用纤维蛋白凝块法检测SRH的抗凝血酶功能,结果显示与SAK相比SRH蛋白具有显着抗凝血酶功能;检测SRH的抗血小板聚集功能结果显示SRH蛋白保持了RGD序列的抗血小板聚集功能。以上研究结果表明我们构建的SRH蛋白保持了各功能域的活性,具有溶栓,抑制血小板聚集和抗凝血酶的功能。二药效学评价,使用apoE-/-小鼠为动物模型,高脂饲料喂养,观察连续静脉注射SRH后其动脉粥样硬化进展情况。结果显示SRH给药组具有抗AS的作用。主动脉窦部HE染色结果显示,模型组主动脉窦部粥样硬化病变非常显着,AS斑块占管腔面积为91%,SRH治疗组:1mg/kg体重组斑块占管腔面积为:39%,0.125mg/kg体重组斑块占管腔面积为:43%。结果显示与模型组相比,治疗组AS斑块病变有明显减轻的趋势。对小鼠CRP检测显示SRH可以显着降低apoE-/-小鼠CRP水平,这一结果提示我们SRH治疗动脉粥样硬化的功能可能通过抗炎性机制实现。三为进一步研究SRH蛋白的抗动脉粥样硬化机制,我们选择血管内皮细胞系HUVEC,检测了SRH蛋白对HUVEC细胞的作用。研究发现SRH蛋白可以抑制凝血酶诱导的动脉粥样硬化相关基因PAI-1,ICAM-1,VCAM-1,IL6,IL8,MCP-1,TF的mRNA表达水平,抑制IL6,MCP-1的分泌,抑制细胞膜粘附分子ICAM-1,VCAM-1的表达,抑制凝血酶诱导的单核细胞与血管内皮细胞的粘附。这些研究结果提示SRH蛋白可以通过抑制凝血酶对内皮细胞的作用发挥其抗炎功能,进一步抑制动脉粥样硬化。四由于SRH蛋白在SAK基础上融合了其它分子,这种变化可能会造成在体内代谢的变化。为了初步检测SRH蛋白在体内的代谢情况并与SAK进行比较,我们制备了SRH的兔源及鼠源多克隆抗体,建立了双抗夹心ELISA方法检测SRH及SAK含量的方法,并使用该方法检测了动物体内SRH蛋白及SAK蛋白的代谢情况,结果显示这两种蛋白在动物体内代谢存在一定的差异,SRH半衰期有延长的趋势,为进一步研究SRH蛋白的药学功能奠定了基础。总之,我们针对AS发生和发展的特点构建了多功能融合蛋白SRH,以实现多靶点治疗AS。在本研究中我们完成了SRH的构建表达和纯化,对各功能域的体外活性检测;在AS动物模型中评价了SRH的对AS治疗作用,并初步探讨了其作用机制;建立了SRH含量检测方法,并在动物体内初步检测了SRH的代谢情况。这些工作为SRH的成药性做了初步评价,也为新型抗AS药物的研制奠定基础。
王少华[3]（2011）在《日本刺沙蚕蛋白酶的纯化、鉴定及日本刺沙蚕纤溶酶的部分药效学研究》文中进行了进一步梳理血栓性疾病（thrombotic disease, TD）包括血栓形成（thrombosis）和血栓栓塞（thromboembolism）。血栓性疾病已经成为严重危害人类生命健康的“头号杀手”,不仅发病率高居各种疾病之首,而且致残率、致死率和复发率也很高。目前,临床上常用的抗栓治疗方法主要是溶栓治疗。过去十年中,国内外临床常用的溶栓剂有尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤溶酶原激活剂、蛇毒降纤酶类（东菱迪芙）及蚓激酶等。但是所有这些溶栓剂都有不可避免的副作用,包括需要加大剂量治疗、有限的纤维蛋白特异性、再阻塞和出血倾向等。所以,从各种天然生物资源中寻找和研发溶解纤维蛋白特异性高、出血副作用小及相对较便宜的溶栓剂一直是研究的热点。日本刺沙蚕是一种海洋无脊椎动物,广泛分布于我国的渤海、黄海沿岸及长江口等地区,此外还有日本太平洋沿岸。目前日本刺沙蚕主要被用作鱼虾的优质饵料,同时也是海洋垂钓的优质钓饵。本实验室前期已经从日本刺沙蚕体内发现了一种新的名为日本刺沙蚕纤溶酶（NJF）的丝氨酸蛋白酶,该实验过程中还发现有另外一种特殊纤溶活性及性质的蛋白酶—日本刺沙蚕蛋白酶（NJP）,有可能开发成新的溶栓剂,更好的实现其经济和社会价值。本论文主要包括两个部分的研究,第一部分包括前三章,是关于日本刺沙蚕蛋白酶（NJP）的分离纯化工艺的建立,分子特征及酶学性质的检测；第二部分包括第四章,是关于NJF的体内部分药效学实验。现将主要研究结果分述如下：1.通过酶的粗提、硫酸铵分级盐析、苯柱疏水层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,最终得到单一成分的、纯度较高的酶制剂,命名为日本刺沙蚕蛋白酶（N.japonica protease, NJP）,最终纯化了1556倍,回收率为13%；以S-2238为特异性底物时,生色底物法测得NJP的特异性酶活力为10113.9 U/mg。2.通过MALDI-TOF MS和SDS-PAGE电泳检测NJP是一个相对分子量为28.6～33.5kDa的单链蛋白质；2-DE检测其等电点为9.2。3.通过串联质谱MALDI-TOF/TOF MS测序并进行De Novo分析,获得3段共28个氨基酸序列,分别是：V-T-V-V-Q-Y-R; S-T-N-A-S-S-G-Y-L-N-L-R和V-Y-L-L-D-T-G-L-R.将此序列在NCBI的non-redundant protein sequences （nr）和Swiss-Prot数据库利用protein-protein BLAST （blastp）软件进行比对,发现NJP是一种新发现的蛋白酶；将此序列登陆UniProt knowledgebase数据库中,获得登录号P86834, EC 3.4.21.-。4. Azocasein水解法测定NJP的最适温度为40℃,且在30℃-60℃比较稳定；其最适pH为9.0,且在pH7.0-pH11.0时能保持最大活性的80%以上,表明NJP是-种碱性蛋白酶。5. Azocasein水解法测定的结果表明Hg2+几乎能完全抑制NJP的酶活性,Co2+和Mg2+也能部分抑制其酶活性,其它金属离子对酶活性的抑制和活化作用都不明显。6. Azocasein水解法测定的结果表明NJP的酶活性可以完全被典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制,其他蛋白酶抑制剂的抑制作用均不明显,表明NJP属于典型的丝氨酸蛋白酶类。7.纤维蛋白平板法表明,NJP可以直接降解纤维蛋白,基本上无激酶作用,不是纤溶酶原激活剂；NJP具有很强的纤溶活性,以UK标准品为对照,NJP的纤溶活力为12000U/mg；8.采用SDS-PAGE电泳法分析NJP水解纤维蛋白原的活性,结果表明NJP水解纤维蛋白原的先后顺序是：Aα链>Bp链>γ链。9.生色底物法表明,NJP对凝血酶特异性底物S-2238特异性较高,其特异性水解活性为10.11±2.7 mmol/min/mg;以上结果表明NJP是一种新的碱性凝血酶样丝氨酸蛋白酶。10.采用纤维蛋白平板法,以UK为对照,本实验所用的NJF酶制剂的纤溶活力为30000U/mg,我们将NJF的纤溶活性定为10BU/mg。。11.本实验采用管腔内线栓法成功建立了大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。12.通过神经功能损害评分和TTC染色,结果表明静脉输注NJF可以显着降低神经功能损害评分并剂量依赖性的降低缺血再灌注引起的脑梗死。13.静脉输注NJF可以剂量依赖性的降低缺血再灌注引起的脑水肿。14.静脉输注NJF可以显着降低MDA水平,提高SOD的活性,对抗脂质过氧化,提高内源性的抗氧化功能。15.静脉输注5BU/kg的NJF和临床等效剂量的15000U/kg的UK在减少脑梗死和降低脑水肿,以及对抗脂质过氧化和增强抗氧化活性等方面有几乎相等的功效；NJF对缺血再灌注大鼠大脑引起的局灶性脑缺血有潜在的神经保护功能；NJF具有神经保护功能的机制可能是：抑制脂质过氧化和增强内源性的抗氧化酶类。综上所述,本论文从日本刺沙蚕体内分离纯化并鉴定出一种明显不同于NJF和其他纤溶酶的新蛋白酶（NJP）。NJP是一种具有很高纤溶活性的碱性凝血酶样丝氨酸蛋白酶,可以直接降解纤维蛋白而不同于纤溶酶原激活剂。以上结果表明NJP具有成为防治血栓的新的溶栓剂的潜能；同时,本论文首次证明NJF对大鼠大脑中动脉阻断再灌注引起的局灶性脑缺血有很强的神经保护作用,此结果为NJF的进一步药效学和临床实验研究奠定了坚实的基础。
吕凤霞[4]（2009）在《内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的纯化、性质及其基因的克隆与表达》文中进行了进一步梳理血栓栓塞性疾病严重危害人类健康和生命,溶栓疗法是治疗血栓栓塞性疾病最为有效并且可靠的手段。目前临床应用的溶栓药物疗效肯定,明显降低了患者的死亡率和致残率,但还存在特异性不高、半衰期短、易出血及再栓塞等缺点。因此迫切需要研制开发高效、特异、安全、副作用小、价廉的新型溶栓药物。已有研究表明,许多中药具有抗血小板聚集、抗血栓形成的作用,包括生物碱类、黄酮类以及皂甙等化合物,尤其是活血化瘀中草药具有不同程度的抗凝血、血小板聚集及溶解血栓的作用。生活在植物组织内的内生菌,由于内生菌与宿主植物长期协同进化过程中,彼此构成了稳定的生态关系,使内生菌具有产生某些与植物相同或相似化合物的能力。鉴于此,从中药植物内生菌资源中可寻找和发现一些新型的溶栓药物。本研究首次在内生细菌中筛选分离到一株具有纤溶活性较高和良好体外溶栓效果的EJS-3菌株,对其进行了形态特征、生理生化特征和分子生物学鉴定,并对内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的分离纯化及其性质进行深入的研究。同时,采用基因工程技术将内生多粘芽孢杆菌纤溶酶基因克隆到表达载体上,实现内生多粘芽孢杆菌纤溶酶异源表达,并对表达产物的提纯和重组酶的酶学性质作了初步探讨,为研制和开发新型的溶栓药物提供重要理论依据。主要研究结果分述如下：1.采用酪蛋白平板和纤维蛋白平板初筛、摇瓶复筛的筛选策略,从金银花、黄芩、蒲公英、黄连、连翘、爬山虎、鱼腥草、百部等植物的根、茎、叶分离筛选到7株具有纤溶活性的内生菌。其中从百部中分离到的内生菌株EJS-3酶活最高,达110 IU/mL。通过对其形态特征、生理生化特征进行鉴定,初步判断该菌株为多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。对菌株EJS-3的16S rDNA进行PCR扩增,对得到的1500bpPCR产物纯化和序列测定,利用GenBank数据库进行同源搜索,并构建N-J系统发育树,结果表明：菌株EJS-3的16S rDNA序列（DQ120522）与多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）的16S rDNA序列的同源性均达98%以上,亲缘关系最近。结合常规的形态特征、生理生化特征鉴定,表明该菌株在细菌系统分类学上属于多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。目前,国内外内生多粘芽孢杆菌产纤溶酶的研究尚未见报道。2.内生菌株EJS-3发酵液经离心除菌,硫酸铵分级沉淀,Hiprep phenyl FF疏水层析,RESOURCEM Q离子交换层析和Sephacryl S-300HR凝胶过滤,获得电泳纯的多粘芽孢杆菌纤溶酶（PPFE-Ⅰ）, HPLC为单一峰,纯度为94.1%。每升发酵液中可获得1.6 mg活性蛋白,每毫克蛋白活力达2096 IU,纯度提高了14.5,回收率为3.3%。3. SDS-PAGE测定PPFE-Ⅰ的相对分子质量为63 KDa, MALDI-TOF质谱法准确测定其相对分子质量为63.3 KDa。该酶最适反应温度37℃,最适反应pH7.5,具有较好的热稳定性和pH稳定性。金属离子Cu2+和Ca2+能抑制其纤溶活性, Mg2+, Fe2+和Zn2+对该酶存在明显的激活作用。1 mmol/L PMSF完全抑制其纤溶活性,EDTA能部分抑制纤溶活性,这表明PPFE-Ⅰ属于丝氨酸蛋白酶,此酶还可能是一种金属蛋白酶。4.利用几种人工合成的底物测定水解酰胺键活性的高低。结果表明,PPFE-Ⅰ的最适底物是枯草杆菌蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的最适底物,即N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe -pNA;水解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA的米氏常数Km为0.20 mM,表明PPFE-Ⅰ对该底物有较好的亲和性；PPFE-Ⅰ在普通纤维蛋白平板和加热平板上测定的纤溶活性没有显着的差别,这表明PPFE-Ⅰ对纤维蛋白具有直接的降解作用,不具有激活纤溶酶原形成纤溶酶的活性,因而PPFE-Ⅰ是一种纤溶酶,而不是纤溶酶原激活剂；通过PPFE-Ⅰ对人血纤维蛋白原的体外降解过程的研究,结果表明纤溶酶PPFE-Ⅰ最先降解α链,其次是β链,而对γ链降解最缓慢,1-4 h逐渐降解至完全；通过体外血凝块的溶解作用实验,结果表明当PPFE-Ⅰ酶溶液对血凝块作用24h时,其对体外血凝决的溶解率91.33%,表明PPFE-Ⅰ有明显的体外溶栓作用,直接溶解作用的结果,同时具有显着的抗凝活性,并且抗凝血效果优于尿激酶。5.为了实现内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的异源高效表达,以内生菌株EJS-3基因组DNA为模板,运用PCR扩增PPFE-Ⅰ基因,并克隆到pMD-19T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-Ⅰ,经测序正确后,将PPFE-Ⅰ克隆至表达载体pET-DsbA上,成功构建了pET-DsbA/PPFE-Ⅰ重组表达质粒,将其转化E. coli BL21（DE3）中,在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-Ⅰ的表达,表达产物酶活性达228 IU/mL.表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。SDS-PAGE电泳检测融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4%。Western blot结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-Ⅰ融合蛋白。6.表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步骤进行分离纯化,并用MALDI-TOF质谱对重组酶进行了鉴定。纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性。对纯化的重组纤溶酶进行最适温度及其稳定性、最适pH及其稳定性以及蛋白酶抑制剂、金属离子的影响等性质的研究,结果表明,重组酶与天然纤溶酶是一致的。7.为了进一步探讨内生多粘芽孢杆菌纤溶酶基因异源表达特性,从内生菌株EJS-3总DNA中PCR扩增出PPFE-Ⅰ基因,将PPFE-Ⅰ基因克隆到本实验室构建大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHPQ中,并转化枯草杆菌WB800中进行了分泌表达,在含氯霉素10μg/mL.红霉素10μg/mL的LB液体培养基中培养32h,纤溶酶活性为60 IU/mL.
狄静芳[5]（2008）在《N-端引入RGD序列的葡激酶突变体的构建、表达、纯化及性质研究》文中研究说明血栓性疾病特别是脑血栓、心肌梗塞、深度静脉血栓等均有较高的致死、致残率,溶栓治疗法是治疗此类疾病的常规疗法。自从二十世纪八十年代以来,已先后开发了多种溶栓制剂,现已被广泛应用于临床,例如:重组组织型纤溶酶原（recombinant tissue-type plasminogen activator,rt-PA）、尿激酶（UK）、重组链激酶（recombinant streptokinase,r-SK）等,这些溶栓制剂各有优缺点,其中以rt-PA疗效最佳,但因其价格昂贵使用范围受到很大限制。科研工作者正在努力寻找一种既有较好溶栓疗效价格又便宜的新一代溶栓制剂。天然葡激酶（staphylokinase,SAK）是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种蛋白质。临床研究表明,重组葡激酶（r-SAK）具有与rt-PA相当的溶栓活性,且有更高的纤维蛋白专一性,除此之外,它能在大肠杆菌中高效表达,生产成本低,是一种很有应用前景的溶栓制剂。但临床试验表明,使用r-SAK后仍有一定的再梗塞率,而活化后血小板聚集反应是成功溶栓后再栓塞的主要原因,因此在溶栓的同时进行抗凝、抗血小板聚集治疗是一种积极的预防再栓塞的治疗策略。GPIIb/IIIa拮抗剂能与纤维蛋白原竞争性结合血小板表面的GPIIb/IIIa受体,能够抑制血小板聚集通路的最后一步,具有很强的抑制血小板聚集的作用。国内外根据RGD（Arg-Gly-Asp）序列已设计了许多GPIIb/IIIa受体阻断剂,用于抑制血小板聚集。为研制兼具溶栓和防栓功能的新型溶栓剂,降低溶栓后再栓塞的发生率,本试验设计在SAK分子的N-端引入RGD序列,构建四个新型双功能SAK突变体分子,研究其表达和纯化,并分析其生物学活性。本实验采用PCR介导的定点突变的方法,通过设计N-端包含RGD短肽序列的突变引物,以野生型葡激酶（wild type staphylokinase,WT-SAK）质粒为模板,PCR克隆得到SAK突变体基因;将突变后的SAK基因序列与表达载体pBV220质粒连接后,转化大肠杆菌BL21进行表达;应用阳离子交换层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析连续三步层析法纯化表达产物,并对所得纯化产物进行生物学活性鉴定。实验结果显示,SAK突变体蛋白在大肠杆菌BL21中的表达量占菌体蛋白总量的50%以上;三步连续层析纯化后其纯度可达97%以上;测得其纤溶比活性分别为10.8×104HU/mg、10.1×104HU/mg、11.0×104HU/mg、11.2×104HU/mg,不低于WT-SAK的纤溶活性（9.8×104HU/mg）;并且具有明显的抗血小板聚集活性,实验测得血小板聚集抑制率分别为10.72%、12.36%、19.71%、21.65%,明显高于WT-SAK（3.98%）;ELISA分析结果表明,SAK突变体中大肠杆菌菌体蛋白残留量均小于0.1%,符合《中国药典》2005版中规定的要求。本实验中,突变体基因在大肠杆菌中获得高效表达,得到了高纯度、高活性的SAK突变体蛋白。突变体既保留了野生型葡激酶的纤溶活性,同时又具有了抗血小板聚集功能,为新型双功能SAK的研制奠定了良好的基础。
李奇[6]（2008）在《沙蚕蛋白酶及同工酶的分离纯化、性质及药用生物活性研究》文中研究表明本论文报告了沙蚕蛋白酶及其同工酶的分离纯化工艺,生物化学特征、酶学性质、药用生物活性。应用硫酸铵盐析、凝胶过滤层析、疏水层析等技术从沙蚕体内分离得到沙蚕蛋白酶。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱、等电聚焦电泳和质谱分析、肽指纹图谱分析、氨基酸序列分析及酶学性质、免疫原性等实验证实:沙蚕蛋白酶是一组蛋白酶,该酶由三个组分组成,均为序列未知的新蛋白质,均有纤溶活性;其中两个组分具有高度同源性,结构相似,功能、抗原性、酶学性质基本相同;另一个组分与二者功能相同、酶学性质相似,结构不同、抗原性与二者不同。它们是一组同工酶,属于丝氨酸蛋白酶类;既有纤溶酶活性又有激酶活性,以直接纤溶酶活性为主;均为酸性蛋白质。通过纤维蛋白原（Fg）、D-二聚体（D-Dimer）含量、血浆优球蛋白溶解时间（ELT）测定,凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）测定;通过二磷酸腺苷（ADP）、花生四烯酸（AA）及胶原（CG）诱导血小板聚集,测定血小板最大聚集率;建立静脉高分子右旋糖酐高粘滞血症模型,检测血液流变学指标;应用体内、外血栓形成等实验,研究结果证明:沙蚕蛋白酶具有很强的纤维蛋白原及纤维蛋白溶解活性;对凝血功能未见有影响;有显着的抑制血小板聚集作用;有显着改善血液流变学作用;有抗血栓形成作用。本文研究内容和理论成果丰富、创新性鲜明,潜在应用性很大,为蛋白酶类降纤、溶栓新药研究奠定了坚实基础。
王旻[7]（2007）在《低免疫原性葡激酶的构建及功能分析》文中进行了进一步梳理天然葡激酶（staphylokinase，SAK）是溶原性金黄色葡萄球菌合成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成，其中包括45个带电氨基酸残基不含半胱氨酸及二硫键，分子量15.5kDa。研究发现SAK可以选择性的作用于纤维蛋白原。SAK具有纤维蛋白特异性高，对血小板富集型血栓作用强等优点。与同期上市的溶栓药物相比具有溶栓效果好，专一性强，副作用小，价格便宜等优点。我室研制的重组葡激酶（rSAK）已经完成二期临床实验，对急性心梗的治疗结果表明，rSAK的再通率显着高于r-tPA，显示出良好的临床应用前景。但是SAK作为一种细菌源性蛋白，在用药后两周产生大量中和性抗体，影响其重复使用。在一定程度上限制了其临床应用范围。对SAK分子进行修饰，改造其抗原表位，是获得新型低免疫原性溶栓药物的重要方法之一。本研究利用Biosun软件，对我室的野生型SAK（wild type staphylokinase，wtSAK）的抗原表位进行了预测，并结合SAK晶体结构和对其抗原表位研究的报道，选择了多个位点的氨基酸进行了缺失和突变，构建了10个SAK的突变体。结合SAK突变体活性和表达情况对其进行了筛选。从中选择了突变体SAK2进行了表达和纯化工艺的研究，进一步对其活性和免疫原性进行了分析和评价。主要研究内容和实验结果如下：1．SAK系列突变体的构建，表达，纯化及活性分析利用重叠延伸PCR方法，构建了N端缺失及特定位点突变的系列SAK突变体（SAK1—SAK10）。将编码突变体基因的DNA片段重组入表达载体pBV220，转化E.coliBL21感受态细胞进行诱导表达。结果显示，SAK1—SAK10在E.coli/pBV220受体菌中均以包涵体形式表达。选择突变位点较多的SAK1，SAK2，SAK7及SAK8重组入pET17b载体中，转化E.coliBL21感受态细胞，诱导表达后以可溶性形式表达。活性检测结果显示突变体SAK2的溶栓活性与wtSAK相当，而其余突变体的活性与野生型SAK（wtSAK）相比均有所下降。2．SAK2大规模制备工艺的研究，多克隆抗体制备及抗原抗体反应性比较将E.coliBL21/pET17b-SAK2菌株进行发酵，大量表达后，进行纯化。经过阴离子交换层析和凝胶过滤层析两步纯化，SAK2纯度达95％以上。使用纤维蛋白平板溶圈法检测SAK2活性，其活性达到（3.5±1.4）×104AU/mg，与野生型SAK活性（4.1±0.8）×104AU/mg相当。经过两次加强免疫，制备wtSAK和SAK2的兔源多抗，抗血清的滴度达到1×107时取血。用ELISA检测抗原抗体的反应性；使用纤维蛋白平板溶圈法检测兔抗wtSAK抗血清分别与wtSAK和SAK2结合后的蛋白溶栓活性。实验结果证明SAK2与兔抗wtSAK抗体的反应性显着下降，与兔抗wtSAK结合后的溶栓活性下降程度显着低于wtSAK，说明wtSAK中的部分抗原表位已被缺失。使用饱和硫酸胺沉淀法粗提兔抗wtSAK和兔抗SAK2，再用DEAE柱阴离子交换纯化IgG抗体，得到兔抗wtSAK和兔抗SAK2多克隆抗体。经ELISA法检测抗体滴度为1×105。3．wtSAK和SAK2在猕猴体内产生抗体的比较以猕猴作为实验动物，选择小剂量多次给药的给药方案：使用0.02mg/kg体重剂量；隔天给药；给药七次持续两周。停止给药后十周再次给药，给药方案与第一次相同，给药结束后观察十一周。整个过程中选择15个时间点采血，使用ELISA方法检测猕猴血清中抗体水平。选择抗体水平最高的时间点检测血清的中和活性。对wtSAK组和SAK2组的抗体水平检测结果说明两组整体的抗体变化趋势基本一致，均在第二轮给药期出现抗体水平的明显升高，但SAK2组抗体水平显着低于wtSAK组。wtSAK组在第一轮给药中出现了抗体水平的小幅升高，而SAK2组抗体水平在第一轮给药期无明显变化。wtSAK和SAK2分别和各自的猕猴抗血清温育结合后，wtSAK的溶栓活性仅保持了3.8％，而SAK2的残余溶栓活性为75.3％。以上结果说明在小剂量反复给药方案下SAK2的效果优于wtSAK。在给药期和观察期共6个月的时间内SAK2的活性受其抗体影响较小。4．小剂量反复用药方案对机体血纤溶系统和凝血系统的影响在反复多次给药的6个月观察期内，选择反映血凝的指标PT，APTT，TT，和反映纤维蛋白溶解系统的指标FIB，PLG，α2-PI进行检测。结果显示以上各指标在用药过程中均无显着变化。综上所述，我们设计构建了SAK的系列突变体；筛选并获得了活性较高，抗原性降低，可溶性表达的突变体SAK2；建立了发酵培养和纯化制备工艺；阐明了其在灵长类动物体内的抗体动态变化规律；评价了该突变体反复多次给药对血纤溶系统和凝血系统的影响。为下一步将其研制成能够反复多次使用的溶栓新药物奠定了基础。
卢锦[8]（2007）在《重组葡激酶的高效表达与分离纯化》文中指出血栓病是人类面临的一类主要疾病，包括急性心肌梗塞、脑血栓、肺静脉血栓、动脉血栓和缺血性休克等。其中急性心肌梗塞（AMI）的死亡率高达30％。溶纤治疗被认为是治疗血栓病最为有效的方法，寻找、研制效果好、副作用小的治疗药物一直是世界范围的热门课题。重组葡激酶（Recombinant staphylokinase，rSak）具有纤维蛋白特异性高、纤维蛋白原降解少、对血小板富集型血栓作用强以及价格便宜等优点，使其成为一种极具潜力的特异性溶栓剂。本研究rSak是以活性可溶性状态存在于细胞内，在前期研究的基础上，对E.coli生产rSak的发酵工艺及其下游纯化工艺进行了全面优化，建立了一套高效表达、分离纯化简便、回收率高的工艺，为工业化生产提供了可行性研究。其主要内容包括：Ⅰ．基因工程菌生产rSak的发酵工艺优化。Ⅱ．发酵产物的分离纯化、结构性质鉴定。Ⅲ．rSak原液活性分析。本研究的主要研究结果如下：Ⅰ、通过单因素摇瓶培养实验，研究了碳源、氮源、培养温度对菌体生长和rSak表达的影响，确定合适的摇瓶培养条件：葡萄糖为碳源，氮源为酵母粉和蛋白胨（1∶2），培养温度为30～32℃；Ⅱ、将摇瓶优化出的培养条件放大至发酵罐进行单批发酵，研究了诱导维持时间对菌体的生长和rSak表达的影响，确定最佳诱导维持时间应控制在3～4h，此时rSak表达水平为35％左右，蛋白表达量和菌体密度相对较高且杂蛋白较少；Ⅲ、采用正交法对大罐发酵培养条件进一步优化，研究发现四个因素对菌体密度和目的蛋白质的表达存在这不同程度的影响，其影响大小依次为：葡萄糖浓度＞饱和氧浓度＞氮源浓度＞pH，并进一步确定了最佳的发酵培养条件：葡萄糖浓度2％、氮源浓度1.5％、pH6.8和饱和氧浓度30％。采用此优化条件对基因工程菌进行连续三批发酵，蛋白质表达量和菌体密度都较高，平均菌体密度A600为35.8，平均DCW为8.2g／L以及平均蛋白质表达量达到52％。Ⅳ、利用超滤系统进行粗纯化，大大缩短了生产周期，对制品起到提纯、浓缩和转换介质的作用；确立了最佳的纯化工艺：粗提制品经DEAE-Sepharose FF和SP-Sepharose FF两步柱层析获得重组葡激酶原液；将两种同一性质不同强度的阳离子交换柱进行对比，研究证明SP-Sepharose FF层析柱更适合于重组葡激酶的分离纯化；对SP-Sepharose FF柱层析洗脱条件进行优化，实验表明低盐浓度逐步梯度洗脱更易于去除杂蛋白、提纯目的蛋白质，蛋白质回收率达到32％，SDS-PAGE纯度高达99％；在柱层析时，上样速度和洗脱速度对蛋白回收率的影响较大，通过实验证明，DEAE-Sepharose FF层析时，上样速度以较快为宜，而SP-Sepharose FF层析时适合较慢的上样速度；在对SP-Sepharose FF层析柱洗脱时，洗脱速度宜较快。Ⅴ、经小试工艺放大，进行连续三批试生产并对rSak原液作进一步的检测。rSak经SDS-PAGE检测为单带，且与rSak标准品位置相同，通过SDS-PAGE和HPLC分析，其纯度均在99％以上，分子量为15.5kD，与文献报道的相符，分子内没有二硫键，分子为单链聚合多肽。三批原液紫外吸收光谱、抗生素残留和细菌内毒素检测结果均符合基因工程制品的规定要求。Ⅵ、采用人纤维蛋白溶解法测定rSak原液生物学活性，本方法灵敏较高，连续三批产品活性分别是2.2×108、3.1×105、2.8×108IU／ml，活性均较高并且稳定，进一步证明了发酵和纯化工艺重现性好。
陈宏山[9]（2007）在《新型重组双功能葡激酶（RGD-SAK）的中试和临床前研究》文中研究表明心肌梗死是一种严重威胁人类生命健康的疾病，溶栓治疗是临床急救心肌梗死的一种常用手段。葡激酶（Staphylokinase，SAK）具有与组织型纤溶酶原激活剂（Recombinant tissue-type plasminogen activator，t-PA）相当的溶栓活性，并有更高的纤维蛋白专一性，能以大肠杆菌为宿主大量制备，是一种很有应用前景的溶栓剂。但SAK仍存在着再通不完全、初始再灌注延迟、血栓再形成、出血和过敏反应等缺陷，限制了临床使用。血小板聚集在动脉血栓形成中起重要作用，而血小板聚集依赖于特有的功能性受体GPⅡb／Ⅲa，Arg-Gly-Asp（RGD）三肽序列能特异性结合GPⅡb／Ⅲa，从而抑制血小板聚集。因此，本实验室利用定点突变PCR技术，将SAK第35位赖氨酸（K）置换为精氨酸（R），设计了新型SAK突变体RGD-SAK，通过5L发酵罐小试发酵、纯化得到重组RGD-SAK纯品蛋白，初步生物学试验证实其具有溶栓和抑制血小板聚集的双重功能。在上述研究基础上，本课题进行了RGD-SAK的中试和临床前研究。包括建立300L发酵罐RGD-SAK工程菌大规模发酵和表达产物纯化工艺，并完成中试产品的质量检定和质量控制，为临床前研究提供足量样品；根据国家生物制品规程制定制造和检定规程；体外检测RGD-SAK功能；开展临床前药效学研究，包括：RGD-SAK溶栓、防栓及预防再狭窄等功效；研究RGD-SAK的药代动力学特征并进行安全性评价，为临床试验奠定基础。中试阶段利用300L发酵罐进行大规模发酵，42℃诱导基因表达，诱导后0.5小时开始胞内可溶性表达活性RGD-SAK，2.5小时达到表达高峰，表达产物约占菌体总蛋白的60％。高压破菌后胞液通过阳离子交换层析柱（SP-Sepharose），凝胶过滤层析柱（Sephadex G-50）和阴离子交换层析柱（Q-Sepharose）后，得到高纯度的产品。RP-HPLC分析纯度＞98％，LC-MS分析产品分子量为15，478D，每升发酵液得RGD-SAK纯品300mg，纯化得率达60％。进一步的质量检定表明各项检测指标均符合国家生物制品检定标准。RGD-SAK N端序列及一级结构序列测定结果和原设计一致，其溶栓比活性为12，000IU／mg，体外对激活血小板有较高的结合力（P＜0.05），并呈量效关系，而SAK无此功能，相对于SAK，RGD-SAK体外溶解血小板血栓所需时间明显缩短（P＜0.05）。RGD-SAK体外能抑制血小板聚集且呈量效关系，SAK无此功能。上述结果提示RGD-SAK在体内可能通过靶向结合血小板提高溶栓效率，并通过抑制血小板聚集而降低溶栓后再栓。利用球囊损伤形成血栓模型，开展了RGD-SAK溶栓及溶栓后预防再栓的药效学研究，利用DSA（digital substrate angiography）造影观察冠状动脉损伤前、血栓形成时、溶栓90分钟、24小时及30天血管通畅情况，并进行血液学分析，结果显示，RGD-SAK 50，000 IU／kg较等剂量SAK有更高的90分钟溶栓开通率（P＜0.05），RGD-SAK 30，000 IU／kg 90分钟溶栓率不低于SAK50，000 IU／kg组（P＞0.05），同时，溶栓后30天DSA造影结果显示，RGD-SAK30，000及50，000 IU／kg组中均未发现再梗塞，而SAK 50，000 IU／kg组中6只溶栓再通的猪中有4只发生再梗塞（P＜0.05）。检测血液中反应溶栓指标D-dimer和cTnT（心肌钙结合蛋白T，cardiac troponin T）发现，RGD-SAK50，000 IU／kg溶栓后90分钟及24小时后两者均高于SAK 50，000 IU／kg组；检测和动脉血栓形成相关指标血小板聚集率发现，各剂量RGD-SAK组均明显拮抗血小板聚集（P＜0.05），而SAK 50，000 IU／kg拮抗血小板聚集作用不明显；检测血液中凝血酶原时间（Prothrombin Time，PT），活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time，APTT、，凝血酶时间（Thrombin Time，TT）及纤维蛋白原（Fibrinogen，Fg）的水平发现，各组上述指标在观察时间内均无显着变化，这表明在实验浓度范围中RGD-SAK和SAK对系统凝血和纤溶系统无明显影响（P＞0.05）。上述结果表明，该模型中50，000 IU／kg RGD-SAK较等量SAK具有更高的溶栓效率，并可以预防溶栓后再栓，同时不影响系统的凝血和纤溶功能。再狭窄是经皮冠状动脉腔内血管成形术（Percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）的常见并发症，为探索RGD-SAK是否具有预防再狭窄的功效，利用球囊损伤猪冠状动脉建立了再狭窄模型，病理切片观察损伤30天后冠状动脉内膜增生程度，并检测试验血管组织中超氧阴离子(·O2-)浓度和NADPH氧化酶的活性，western blot分析NADPH氧化酶亚基p22phox和gp91phox的表达情况，同时检测血液中血小板诱导生长因子-BB（Platelet derived growth factor，PDGF-BB）浓度，结果表明，球囊损伤30天后，损伤部位明显出现内膜增生形成再狭窄，增生细胞主要为平滑肌细胞，相对于SAK50，000 IU／kg，等剂量RGD-SAK能明显抑制损伤后内膜增生（P＜0.05），并能减少血液中PDGF-BB的释放，同时能明显抑制NADPH氧化酶依赖性的·O2-浓度增高（P＜0.05），进一步试验表明RGD-SAK 50，000 IU／kg组能够显着抑制损伤引起的NADPH氧化酶亚基p22phox和gp91phox表达增加，上述结果说明RGD-SAK可能通过抑制血小板聚集、活化减少PDGF-BB的释放，从而抑制损伤引起的NADPH氧化酶亚基p22phox and gp91phox的高表达，降低血管产生·O2-，有利于预防血管损伤后再狭窄的产生。采用125I放射性示踪技术，对RGD-SAK在SD大鼠体内进行药代动力学研究发现，低（0.5m／kg）、中（1mg／kg）、高（2mg／kg）三种剂量RGD-SAK的t1/2（β）分别为51.77±11.78min、55.03±8.64min及54.82±8.11min，在所用剂量范围内（0.5-2mg／kg）其动力学特性符合线性动力学过程，肾脏是RGD-SAK的主要体内排泄途径。进一步对RGD-SAK进行了较为系统的安全性评价。急性毒性最大耐受量试验结果表明，单次皮下注射给予250mg／kg体重最大耐受剂量后14天未见小鼠死亡，体重增长正常，证实本品急性毒性低；恒河猴长期毒性试验证实RGD-SAK低（1.5mg／kg）、中剂量（7.5 mg／kg）对恒河猴无明显毒性作用，高剂量（15mg／kg）RGD-SAK主要毒性反应靶器官为凝血系统和肾脏，本试验表明RGD-SAK对猴静脉和皮下注射长期毒性剂量为15mg／kg （临床用量50倍），安全剂量为7.5 mg／kg （临床用量25倍），无毒性作用剂量为1.5 mg／kg （临床用量5倍）；溶血试验结果表明，RGD-SAK对红细胞无溶血或粘集反应；鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验和哺乳动物体外细胞染色体畸变试验结果表明RGD-SAK无致突变和致畸作用。上述结果说明，RGD-SAK符合进一步深入开展临床试验的安全毒理学要求。通过该课题研究，建立了较为成熟的中试生产工艺，为进一步深入研究和大规模生产奠定了基础。体内外研究发现，RGD-SAK具有高效溶栓和防栓的作用，同时具有预防血管再狭窄的形成。RGD-SAK临床前药效学、药代动力学和安全性评价的完成为进一步开展RGD-SAK临床研究打下了基础。
范晓丹[10]（2006）在《新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究》文中研究指明豆豉纤溶酶是从中国传统的大豆发酵食品——豆豉中发现的新型纤溶酶。这种酶不仅具有较高的纤溶活性，而且无毒副作用，不引起内出血，在体内半衰期长。因此豆豉纤溶酶无论作为抗血栓药物还是预防血栓栓塞性疾病的保健食品，都具有十分重要的开发价值。然而，现有的相关研究主要集中在纤溶酶产生菌种的筛选、发酵条件的优化等方面，对于豆豉纤溶酶的分离纯化及酶学性质的研究非常有限，对其核苷酸和氨基酸分子水平的研究更为鲜见。基于以上情况，为了获得具有自主知识产权的新型纤溶酶，本论文从广泛收集的各种豆豉成品及半成品中筛选具有纤溶活性的菌株，并进行菌种鉴定；采用物理和化学手段分别对筛选到的菌株进行诱变；对纤溶酶产生菌的突变株进行发酵条件优化；对纤溶酶进行分离纯化工艺路线的研究；另外，采用PCR技术扩增豆豉纤溶酶成熟肽编码区片段，进行核苷酸序列测定，并推导出其氨基酸序列与其它纤溶酶进行同源性分析；为了进一步验证该纤溶酶是否为新型的纤溶酶，我们对该纤溶酶的酶学性质进行了系统的研究。 从全国各地广泛收集的豆豉成品与半成品中，筛选到6株菌落形态各异，纤溶酶产量不同的菌株。其中，菌株DC-12具有最高的纤溶酶产量，其纤溶酶活性为200IU／mL，比酶活为101IU／mg。对菌株DC-12进行菌落形态、菌体特征的观察以及生理生化实验，鉴定为枯草芽孢杆菌（B．subtilis）。将菌株DC-12提交至广东省微生物分析检测中心进行权威鉴定，鉴定结果与实验结果相符，证明DC-12确为枯草芽孢杆菌。 首次采用亚硝酸对枯草芽孢杆菌DC-12进行化学诱变，得到两株突变菌株DC-12N8和DC-12N10，其纤溶酶产量比野生型菌株分别提高了3.6和3.7倍，为720IU／mL和740IU／mL。对枯草芽孢杆菌DC-12进行紫外线诱变，得到一株突变株DC-12U8，其纤溶酶产量比野生型菌株提高了4.7倍，达到950IU／mL。对这三种突变株进行了遗传稳定性分析实验，结果表明DC-12N10和DC-12U8的高产纤溶酶特性在传代过程中逐渐减弱，而DC-12N8具有良好的遗传稳定性，经连续10代传代，纤溶酶产量仍然很稳定，因此，选择DC-12N8作为本论文研究的出发菌株。 经过发酵培养基优化，突变株DC12-N8高产纤溶酶的最佳碳源为可溶性淀粉，浓度为3％；最佳复合氮源为大豆蛋白胨和酵母膏，浓度分别为3％和0.5％；最佳无机盐组合为：0.6％K2HPO4，0.1％KH2PO4，0.075％MgSO4，0.02％CaCl2。突变株DC12-N8发酵高产纤溶酶的最佳培养条件为：150mL三角瓶中装液量30mL；调节培养基初始pH为7.0；以3％接种量接入经过24h培养的种子培养液；在30℃、150r／min条件下进行振荡培养。在最佳发酵培养基和发酵条件下，突变株DC12-N8发酵液可获得的最大纤溶酶产量为2665IU／mL，最大比酶活为1329IU／mg。 枯草芽孢杆菌突变株DC-12N8发酵液经35％～60％硫酸铵分段盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤，可获得电泳纯的豆豉纤溶酶。每升发酵液经过一系列的分离纯化，可获得4.5mg活性蛋白，每毫克蛋白活力达69788Iu，纯
二、重组葡激酶N端缺失突变体对纤溶酶原的激活作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组葡激酶N端缺失突变体对纤溶酶原的激活作用（论文提纲范文）
（1）溶栓药物的药理学研究进展（论文提纲范文）
| 1 溶栓药物 |
| 1.1 第一代溶栓药物 |
| 1.2 第二代溶栓药物 |
| 1.2.1 重组人组织型纤溶酶原激活剂 (rt-PA) |
| 1.2.2 阿尼普酶 (APSAC) |
| 1.2.3 葡激酶 (SAK) 与重组葡激酶 (r-SAK) |
| 1.2.4 重组链激酶 (r-SK) |
| 1.2.5 尿激酶原 (pro-UK) |
| 1.2.6 吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 (DSPA, bat-PA) |
| 1.2.7 蚓激酶 (e-PA) |
| 1.2.8 蛇毒纤溶酶原激活剂 (TSV-PA) |
| 1.2.9 纳豆激酶 (nattokinase, NK) |
| 1.3 第三代溶栓药物 |
| 1.3.1 瑞替普酶 (r-PA) |
| 1.3.2 替奈普酶 (TNK-tPA) |
| 1.3.3 兰替普酶 (lanoteplase, NPA) |
| 1.3.4 靶向溶栓剂 |
| 1.3.5 嵌合体溶栓剂 |
| 1.4 第四代溶栓药物 |
| 2 溶栓辅助药物 |
| 2.1 低分子质量肝素 (LMWH) 类 |
| 2.2 水蛭素 (hirudin) |
| 2.3 血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂 |
（2）融合蛋白SRH的构建及治疗动脉粥样硬化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 SRH 蛋白的构建，表达，纯化及体外活性检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 SRH 蛋白抗动脉粥样硬化作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 SRH 蛋白代谢动力学初步研究 |
| 第一节 检测方法的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 重组SRH 体内代谢动力学研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）日本刺沙蚕蛋白酶的纯化、鉴定及日本刺沙蚕纤溶酶的部分药效学研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1 血栓性疾病 |
| 2 凝血与抗凝的基本原理 |
| 2.1 凝血系统 |
| 2.2 抗凝系统 |
| 2.3 纤溶系统 |
| 3 溶栓剂的研究进展 |
| 3.1 第一代溶栓剂 |
| 3.2 第二代溶栓剂 |
| 3.3 第三代溶栓剂 |
| 3.4 新来源的溶栓剂 |
| 4 血栓动物模型研究进展 |
| 4.1 不需要开颅的模型 |
| 4.2 需要开颅的模型 |
| 4.3 结束语 |
| 5 沙蚕的研究进展 |
| 5.1 双齿围沙蚕的研究 |
| 5.2 日本刺沙蚕的研究 |
| 6 立题依据及研究目标 |
| 6.1 立题依据 |
| 6.2 研究目的 |
| 6.3 研究意义 |
| 第2章 日本刺沙蚕蛋白酶的分离与纯化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 日本刺沙蚕蛋白酶的分离纯化 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 日本刺沙蚕蛋白酶的分离纯化 |
| 3.2 日本刺沙蚕蛋白酶的纯度鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NJP纯化工艺的建立 |
| 4.2 蛋白酶的活性测定 |
| 5 小结 |
| 第3章 日本刺沙蚕蛋白酶的分子特征与酶学性质研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 日本刺沙蚕蛋白酶 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分子量的测定 |
| 2.2 等电点的测定 |
| 2.3 氨基酸序列分析 |
| 2.4 温度对酶活性的影响 |
| 2.5 pH对酶活性的影响 |
| 2.6 金属离子对酶活性的影响 |
| 2.7 蛋白酶抑制剂对酶活性的影响 |
| 2.8 激酶活性及纤溶活力的检测 |
| 2.9 纤维蛋白原水解活性分析 |
| 2.10 特异性底物的确定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NJP的分子量 |
| 3.2 NJP的等电点 |
| 3.3 NJP的部分氨基酸序列分析 |
| 3.4 温度对酶活性的影响 |
| 3.5 pH对酶活性的影响 |
| 3.6 金属离子对酶活性的影响 |
| 3.7 蛋白酶抑制剂对酶活性的影响 |
| 3.8 激酶活性及纤溶活性的检测 |
| 3.9 纤维蛋白原水解活性分析 |
| 3.10 特异性底物的确定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NJP的分子特征 |
| 4.2 NJP的酶学特征 |
| 5 小结 |
| 第4章 日本刺沙蚕纤溶酶对缺血再灌注大鼠的脑保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 NJF纤溶活性的测定 |
| 2.2 管腔内线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型 |
| 2.3 分组及给药 |
| 2.4 神经功能损害评分 |
| 2.5 脑梗死范围测量 |
| 2.6 脑含水量测量 |
| 2.7 MDA水平及SOD活性的测定 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NJF纤溶活性的测定 |
| 3.2 神经功能损害评分 |
| 3.3 脑梗死范围测定 |
| 3.4 脑含水量的测定 |
| 3.5 NJF对MDA水平和SOD活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NJF对缺血再灌注大鼠的脑保护作用 |
| 4.2 NJF对缺血再灌注大鼠大脑内MDA水平和SOD活性的影响 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读博士期间取得的主要学术成果 |
| 致谢 |
（4）内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的纯化、性质及其基因的克隆与表达（论文提纲范文）
| 表格索引 |
| 图形索引 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 血栓性疾病及其危害 |
| 2 血栓形成和血栓溶解机制 |
| 2.1 血栓形成机制 |
| 2.2 栓溶解机制 |
| 3 血栓性疾病的治疗 |
| 4 溶栓剂的研究进展 |
| 4.1 溶栓剂的发展 |
| 4.2 新型溶栓剂的开发及发展趋势 |
| 4.2.1 新型溶栓剂的开发 |
| 4.2.2 溶栓剂的发展趋势 |
| 5 微生物来源溶栓剂的研究进展 |
| 5.1 微生物来源溶栓剂的研究现状 |
| 5.1.1 链激酶(Streptokinase,SK) |
| 5.1.2 葡激酶(Staphylokinase,SaK) |
| 5.1.3 纳豆激酶(Nattokinase,NK) |
| 5.1.4 豉纤溶酶与其他来自发酵食品的纤溶酶 |
| 5.1.5 真菌来源的新型纤溶酶 |
| 5.1.6 链霉菌产生的新型纤溶酶 |
| 5.1.7 海洋假单胞菌产生的纤溶酶 |
| 5.2 微生物来源的溶栓剂分子生物学研究 |
| 5.2.1 葡激酶基因的表达及其分子改造 |
| 5.2.2 纳豆激酶基因的表达及其分子改造 |
| 5.2.3 豆豉纤溶酶基因的表达及其分子改造 |
| 6 植物内生菌的研究进展 |
| 6.1 植物内生菌的定义 |
| 6.2 植物内生菌的分布及生物多样性 |
| 6.2.1 分布 |
| 6.2.2 植物内生菌的多样性 |
| 6.3 植物内生菌与宿主植物的关系 |
| 6.4 植物内生菌产生的生理活性物质 |
| 6.4.1 抗肿瘤物质 |
| 6.4.2 抗菌类物质 |
| 6.4.3 酶类物质 |
| 6.4.4 其他活性物质 |
| 7 本研究的目的意义及内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 产新型纤溶酶植物内生菌EJS-3菌株的分离、鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样品 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 内生菌分离方法 |
| 1.2.2 纤溶酶产生菌的初筛 |
| 1.2.3 纤溶酶产生菌的复筛 |
| 1.2.4 纤溶酶产生菌的鉴定 |
| 1.2.5 纤溶活性的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 纤溶酶产生菌的分离筛选 |
| 2.2 菌种鉴定 |
| 2.2.1 菌株的形态、培养特征及生理生化鉴定 |
| 2.2.2 16S rDNA序列分析鉴定 |
| 2.3 BLAST同源性搜索与系统发育树的绘制 |
| 2.3.1 BLAST同源性搜索 |
| 2.3.2 系统发育树的绘制 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的分离纯化及其性质研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 纤溶酶粗酶液的制备 |
| 1.2.2 蛋白质含量测定 |
| 1.2.3 纤溶活性的测定 |
| 1.2.4 纤溶酶的分离纯化 |
| 1.2.5 纤溶酶PPFE-Ⅰ性质研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 纤溶酶的分离纯化 |
| 2.1.1 硫酸铵分段盐析 |
| 2.1.3 RESOURCE~M Q离子交换层析 |
| 2.1.4 Sephacryl S-300HR凝胶过滤 |
| 2.1.5 分子量测定 |
| 2.1.6 HPLC纯度鉴定 |
| 2.1.7 纤溶酶PPFE-Ⅰ分离纯化效果 |
| 2.2 纤溶酶PPFE-Ⅰ性质研究 |
| 2.2.1 纤溶酶PPFE-Ⅰ的最适作用温度 |
| 2.2.2 纤溶酶PPFE-Ⅰ的热稳定性 |
| 2.2.3 纤溶酶PPFE-Ⅰ的最适作用pH |
| 2.2.4 纤溶酶PPFE-Ⅰ的pH稳定性 |
| 2.2.5 金属离子对纤溶酶PPFE-Ⅰ的影响 |
| 2.2.6 蛋白酶抑制剂对纤溶酶的作用 |
| 2.2.7 纤溶酶PPFE-Ⅰ水解酪蛋白活性的测定 |
| 2.2.8 纤溶酶PPFE-Ⅰ的酰胺水解活性 |
| 2.2.9 纤溶酶PPFE-Ⅰ对生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA作用动力学 |
| 2.2.10 纤溶酶体外溶纤性质 |
| 2.2.11 纤溶酶PPFE-Ⅰ对人血纤维蛋白原的作用方式 |
| 2.2.12 纤溶酶体外血凝块的溶解作用 |
| 2.2.13 纤溶酶体外抗凝作用效果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 内生多粘芽孢杆菌纤溶酶基因在E.coli中融合表达及其产物纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 质粒 |
| 1.1.3 工具酶和化学试剂 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 目的基因的克隆 |
| 1.2.1.1 多粘芽孢杆菌基因组的提取 |
| 1.2.1.2 多粘芽孢杆菌纤溶酶引物的设计 |
| 1.2.1.3 目的基因PCR扩增及产物纯化 |
| 1.2.1.4 PCR产物与载体pMD19-T的连接 |
| 1.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.2.1.6 载体pMD19-T连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 1.2.1.7 阳性克隆的筛选、鉴定与测序 |
| 1.2.1.8 重组质粒测序 |
| 1.2.2 序列分析 |
| 1.2.3 重组表达载体的构建 |
| 1.2.3.1 表达载体pET-DsbA和目的基因T载体的双酶切及回收 |
| 1.2.3.2 表达载体pET-DsbA去磷酸化处理 |
| 1.2.3.3 目的基因与双酶切表达载体pET-DsbA的连接 |
| 1.2.3.4 表达载体pET-DsbA连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 1.2.3.5 阳性克隆酶切鉴定 |
| 1.2.3.6 重组质粒测序 |
| 1.2.4 目的基因在大肠杆菌中的融合表达与可溶性分析 |
| 1.2.4.1 融合蛋白的诱导表达 |
| 1.2.4.2 表达形式鉴定及活性测定 |
| 1.2.5 表达产物的纯化 |
| 1.2.5.1 粗酶液的制备 |
| 1.2.5.2 Ni亲和层析纯化 |
| 1.2.5.3 Sephadex G-100 |
| 1.2.6 重组酶酶学性质研究 |
| 1.2.6.1 重组纤溶酶最适温度的确定 |
| 1.2.6.2 重组纤溶酶温度稳定性确定 |
| 1.2.6.3 重组纤溶酶最适作用pH的确定 |
| 1.2.6.4 重组纤溶酶pH稳定性确定 |
| 1.2.6.5 金属离子对重组纤溶酶的影响 |
| 1.2.6.6 蛋白酶抑制剂对重组纤溶酶的作用 |
| 1.2.7 纤溶酶活性测定 |
| 1.2.8 蛋白质浓度测定 |
| 1.2.9 SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.10 重组蛋白Western Blot分析 |
| 1.2.11 MALDI-TOF-MS检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因的克隆 |
| 2.1.1 多粘芽孢杆菌基因组的提取 |
| 2.1.2 目的基因扩增 |
| 2.1.3 克隆载体的鉴定 |
| 2.2 序列测定 |
| 2.3 序列分析 |
| 2.4 重组表达质粒的构建 |
| 2.5 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 |
| 2.6 表达产物的纯化、鉴定 |
| 2.7 重组酶酶学性质研究 |
| 2.7.1 重组纤溶酶的最适作用温度 |
| 2.7.2 重组纤溶酶的热稳定性 |
| 2.7.3 重组纤溶酶的最适作用pH |
| 2.7.4 重组纤溶酶的pH稳定性 |
| 2.7.5 金属离子对重组纤溶酶的影响 |
| 2.7.6 蛋白酶抑制剂对重组纤溶酶的作用 |
| 2.7.7 重组酶与天然酶性质比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 纤溶酶基因的克隆 |
| 3.2 PPFE-Ⅰ基因在大肠杆菌中的融合表达 |
| 3.3 重组纤溶酶的纯化 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 内生多粘芽孢杆菌纤溶酶基因在枯草杆菌WB800中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 质粒 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DNA提取与纯化 |
| 1.2.2 PPFE-Ⅰ基因的克隆 |
| 1.2.2.1 PCR引物设计 |
| 1.2.2.2 目的基因PCR扩增及产物纯化 |
| 1.2.2.3 PCR产物与载体pMD19-T的连接 |
| 1.2.2.4 大肠杆菌感受态制备 |
| 1.2.2.5 载体pMD19-T连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 1.2.3 PPFE-Ⅰ重组表达载体的构建 |
| 1.2.3.1 穿梭质粒pHPQ和pMD19-T-PPFE-Ⅰ的酶切及回收 |
| 1.2.3.2 酶切质粒pHPQ和PPFE-Ⅰ的连接 |
| 1.2.4 重组pHPQ-PPFE-Ⅰ的电转化 |
| 1.2.5 重组pHPQ-PPFE-Ⅰ在枯草杆菌WB800中的诱导表达 |
| 1.2.6 纤溶酶活性测定 |
| 1.2.7 SDS-PAGE电泳分析 |
| 1.2.8 Western blotting分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PPFE-Ⅰ基因的克隆 |
| 2.1.1 PPFE-Ⅰ基因PCR扩增 |
| 2.1.2 重组载体pMD19-PPFE-Ⅰ酶切鉴定 |
| 2.2 PPFE-Ⅰ基因的表达 |
| 2.2.1 穿梭表达载体pHPQ构建 |
| 2.2.2 重组表达载体pHPQ-PPFE-Ⅰ构建 |
| 2.2.3 重组表达载体pHPQ-PPFE-Ⅰ的PCR和酶切鉴定 |
| 2.2.4 PPFE-Ⅰ基因在枯草杆菌中的诱导表达及纤溶酶活性测定 |
| 2.2.5 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.4.6 表达蛋白的Western blotting分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新摘要 |
| 展望 |
| 攻读博士期间发表及待发表论文 |
| 致谢 |
（5）N-端引入RGD序列的葡激酶突变体的构建、表达、纯化及性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 人体内血栓的形成与溶解 |
| 1.1.1 人体内血栓形成与溶解的概况 |
| 1.1.2 溶栓药物的溶栓途径 |
| 1.2 溶栓药物的发展概况 |
| 1.2.1 第一代溶栓药物 |
| 1.2.2 第二代溶栓药物 |
| 1.2.3 第三代溶栓药物 |
| 1.2.4 天然溶栓药物 |
| 1.2.5 溶栓药物的发展方向 |
| 1.3 葡激酶的研究进展 |
| 1.3.1 葡激酶基因及蛋白质结构 |
| 1.3.2 葡激酶的作用机理 |
| 1.3.3 葡激酶的生物学活性 |
| 1.3.4 体外实验及临床应用 |
| 1.3.5 葡激酶临床应用中存在的问题 |
| 1.3.6 葡激酶的基因工程与蛋白质工程研究 |
| 1.4 葡激酶的纯化方式及溶纤活性的测定方法 |
| 1.4.1 葡激酶的纯化工艺研究 |
| 1.4.2 葡激酶溶纤活性的测定 |
| 1.5 重组葡激酶的研究展望 |
| 2 新型葡激酶突变体基因的克隆与表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料与设备 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 葡激酶突变体基因的克隆及筛选 |
| 2.2.2 测序结果 |
| 2.2.3 重组表达质粒的构建 |
| 2.2.4 表达质粒在大肠杆菌中的表达 |
| 2.3 小结 |
| 3 新型葡激酶突变体的高效表达和纯化工艺的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料与设备 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 工程菌的诱导表达时间的确定 |
| 3.2.2 不同菌体裂解方法效果对比 |
| 3.2.3 重组表达蛋白在大肠杆菌细胞中存在形式的确定 |
| 3.2.4 纯化过程的监测 |
| 3.2.5 葡激酶突变体比活性的测定 |
| 3.3 小结 |
| 4 新型葡激酶突变体的鉴定及性质研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 HPLC 鉴定葡激酶突变体纯度 |
| 4.2.2 MS 测定葡激酶突变体分子量 |
| 4.2.3 菌体蛋白的免疫印迹 |
| 4.2.4 菌体蛋白的酶联免疫分析 |
| 4.2.5 等电聚焦测定葡激酶突变体等电点 |
| 4.2.6 葡激酶突变体紫外吸收情况的测定 |
| 4.2.7 葡激酶突变体纤溶活性的测定 |
| 4.2.8 葡激酶突变体激活纤溶酶原试验 |
| 4.2.9 葡激酶突变体抗血小板聚集活性的测定 |
| 4.3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 后记（含致谢） |
| 攻读学位期间取得的科研成果清单 |
（6）沙蚕蛋白酶及同工酶的分离纯化、性质及药用生物活性研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一节 降纤、溶栓药物的作用机制 |
| 第二节 降纤、溶栓药物的研究现状 |
| 第三节 立题依据 |
| 第一章 沙蚕蛋白酶分离纯化的研究 |
| 第一节 沙蚕蛋白酶的分离纯化 |
| 第二节 沙蚕蛋白酶的活性检测与蛋白含量测定 |
| 小结 |
| 第二章 沙蚕蛋白酶及同工酶的性质 |
| 第一节 沙蚕蛋白酶的纯度鉴定 |
| 第二节 沙蚕蛋白酶的质谱分析及氨基酸序列分析 |
| 第三节 沙蚕蛋白酶的抗原性研究 |
| 第四节 沙蚕蛋白酶的酶学性质分析 |
| 小结 |
| 第三章 沙蚕蛋白酶药用生物活性的研究 |
| 第一节 沙蚕蛋白酶对家兔体内纤维蛋白溶解活性及凝血功能的影响 |
| 第二节 沙蚕蛋白酶的抗血小板聚集作用 |
| 第三节 沙蚕蛋白酶对高粘滞血症大鼠血液流变学的影响 |
| 第四节 沙蚕蛋白酶的抗血栓形成作用 |
| 小结 |
| 结论 |
| 一、本文研究创新点 |
| 二、本文主要研究结论 |
| 三、本文研究的不足之处与今后研究方向 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
（7）低免疫原性葡激酶的构建及功能分析（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 SAK突变体的构建，表达，纯化及活性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 重组蛋白SAK2制备工艺的研究，抗体制备及检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 WTSAK与 SAK2在猕猴体内产生抗体的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 附:发表文章 |
（8）重组葡激酶的高效表达与分离纯化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 重组葡激酶发酵工艺优化 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 分析方法 |
| 4. 结果与讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二章 重组葡激酶发酵产物的分离纯化、结构性质鉴定 |
| 1. 实验仪器及试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 分析方法 |
| 4. 结果与讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三章 重组葡激酶蛋白制品的生物学活性分析 |
| 1. 试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果与讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 文献综述部分 |
| 0 简介 |
| 1 葡激酶基因和蛋白质结构 |
| 2 重组葡激酶(Recombinant staphylokinase，rSak)技术 |
| 3 rSak溶栓机理 |
| 4 rSak的药学研究和临床应用 |
| 5 rSak的不良反应 |
| 6 国内外研究概况 |
| 7 立题依据 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 获奖情况 |
| 致谢 |
（9）新型重组双功能葡激酶（RGD-SAK）的中试和临床前研究（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 新型重组双功能葡激酶(RGD-SAK)的中试研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 新型重组双功能葡激酶(RGD-SAK)对实验微型猪冠状动脉血栓溶栓作用的药效学研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 新型重组双功能葡激酶(RGD-SAK)抑制猪冠状动脉球囊损伤后再狭窄及其机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 新型重组双功能葡激酶(RGD-SAK)临床前药代动力学及安全性评价 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文参考文献 |
| 综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 血栓的形成机理 |
| 1.3 抗凝疗法 |
| 1.4 抗血小板疗法 |
| 1.5 溶栓疗法 |
| 1.5.1 纤溶系统 |
| 1.5.2 溶栓药物的研究进展 |
| 1.6 本研究的主要内容和意义 |
| 第二章 豆豉纤溶酶产生菌种的筛选及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2.1 菌种来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 缓冲液的配制 |
| 2.3.2 双层纤维蛋白平板的配制 |
| 2.3.3 LB-纤维蛋白平板的配制 |
| 2.3.4 纤溶活性的测定 |
| 2.3.5 纤溶酶产生菌种的筛选 |
| 2.3.6 蛋白质含量的测定 |
| 2.3.7 菌种的鉴定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 尿激酶活性标准曲线 |
| 2.4.2 蛋白质含量标准曲线 |
| 2.4.3 菌种的筛选 |
| 2.4.4 菌种的鉴定 |
| 2.4.5 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 豆豉纤溶酶产生菌种DC-12的诱变 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.2 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 出发菌株的纯化 |
| 3.3.2 菌种活化与前培养 |
| 3.3.3 菌悬液的制备 |
| 3.3.4 诱变剂量的确定 |
| 3.3.5 诱变处理 |
| 3.3.6 后培养 |
| 3.3.7 初筛 |
| 3.3.8 复筛 |
| 3.3.9 筛选标准 |
| 3.3.10 突变株菌落形态和细胞形态观察 |
| 3.3.11 遗传稳定性试验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 诱变剂剂量的确定 |
| 3.4.2 筛选结果 |
| 3.4.3 突变株菌落形态及细胞形态观察 |
| 3.4.4 突变株的遗传稳定性分析 |
| 3.4.5 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 豆豉纤溶酶产生菌突变株DC-12N8发酵条件的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 培养基 |
| 4.2 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 斜面菌种的保存 |
| 4.3.2 种子培养条件 |
| 4.3.3 未优化的发酵培养条件 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 培养基成分及培养条件的优化 |
| 4.4.2 发酵过程曲线 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 豆豉纤溶酶的分离纯化 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 粗酶液 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 主要仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 层析缓冲液的配制 |
| 5.3.2 硫酸铵分段盐析 |
| 5.3.3 DEAE-Sepharose Fast Flow层析 |
| 5.3.4 CM-Sepharose Fast Flow层析 |
| 5.3.5 Sephadex G-75凝胶过滤 |
| 5.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 硫酸铵分段盐析 |
| 5.4.2 DEAE-Sepharose Fast Flow层析 |
| 5.4.3 CM-Sepharose Fast Flow层析 |
| 5.4.4 Sephadex G-75凝胶过滤 |
| 5.4.5 分子量的测定 |
| 5.4.6 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 豆豉纤溶酶DN-FE基因的克隆及序列分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌株与质粒载体 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 培养基 |
| 6.2 主要仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 豆豉纤溶酶DN-FE基因的PCR扩增 |
| 6.3.2 DN-FE基因的克隆 |
| 6.3.3 DN-FE基因的序列测定及分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 从豆豉纤溶酶菌株洲总DNA中克隆的DN-FE基因 |
| 6.4.2 PCR产物的克隆及重组子的鉴定 |
| 6.4.3 DN-FE基因测序及序列分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 豆豉纤溶酶DN-FE酶学性质的研究 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 菌种 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.2 主要仪器设备 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 豆豉纤溶酶DN-FE的最适反应温度 |
| 7.3.2 豆豉纤溶酶DN-FE的最适反应pH |
| 7.3.3 豆豉纤溶酶DN-FE的温度稳定性 |
| 7.3.4 豆豉纤溶酶DN-FE的pH稳定性 |
| 7.3.5 金属离子对豆豉纤溶酶DN-FE酶活力的影响 |
| 7.3.6 抑制剂对豆豉纤溶酶DN-FE酶活力的影响 |
| 7.3.7 豆豉纤溶酶DN-FE酰胺水解活性的测定 |
| 7.3.8 豆豉纤酶DN-FE水解酷蛋白活性的测定 |
| 7.3.9 豆豉纤溶酶DN-FE溶解纤维蛋白的作用方式 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 豆豉纤溶酶DN-FE的最适反应温度 |
| 7.4.2 豆豉纤溶酶DN-FE的最适反应pH |
| 7.4.3 豆豉纤溶酶DN-FE的温度稳定性 |
| 7.4.4 豆豉纤溶酶DN-FE的pH稳定性 |
| 7.4.5 金属离子对豆豉纤溶酶DN-FE酶活力的影响 |
| 7.4.6 抑制剂对豆豉纤溶酶DN-FE酶活力的影响 |
| 7.4.7 豆豉纤溶酶DN-FE酰胺水解活性的测定 |
| 7.4.8 豆豉纤溶酶DN-FE水解蛋酪蛋白活性的测定 |
| 7.4.9 豆豉纤溶酶DN-FE溶解纤维蛋白的作用方式 |
| 7.4.10 不同来源的纤溶酶酶学性质的比较 |
| 7.4.11 讨论 |
| 7.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 附录 豆豉纤溶酶产生菌DC-12菌种鉴定报告 |
| 致谢 |
四、重组葡激酶N端缺失突变体对纤溶酶原的激活作用（论文参考文献）
- [1]溶栓药物的药理学研究进展[J]. 王贵鑫,吕莉. 血栓与止血学, 2011(05)
- [2]融合蛋白SRH的构建及治疗动脉粥样硬化的作用机制研究[D]. 王旻. 中国人民解放军军事医学科学院, 2011(07)
- [3]日本刺沙蚕蛋白酶的纯化、鉴定及日本刺沙蚕纤溶酶的部分药效学研究[D]. 王少华. 吉林大学, 2011(09)
- [4]内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的纯化、性质及其基因的克隆与表达[D]. 吕凤霞. 南京农业大学, 2009(06)
- [5]N-端引入RGD序列的葡激酶突变体的构建、表达、纯化及性质研究[D]. 狄静芳. 河北师范大学, 2008(12)
- [6]沙蚕蛋白酶及同工酶的分离纯化、性质及药用生物活性研究[D]. 李奇. 吉林大学, 2008(11)
- [7]低免疫原性葡激酶的构建及功能分析[D]. 王旻. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)
- [8]重组葡激酶的高效表达与分离纯化[D]. 卢锦. 四川大学, 2007(05)
- [9]新型重组双功能葡激酶（RGD-SAK）的中试和临床前研究[D]. 陈宏山. 复旦大学, 2007(06)
- [10]新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究[D]. 范晓丹. 华南理工大学, 2006(11)