一、胃癌细胞株化疗药物相互作用的实验研究（论文文献综述）
杨宝玉[1]（2021）在《EZH2表达调控对胃癌生长及化疗敏感性的影响》文中提出目的:1.通过公共数据库、胃癌组织和胃癌细胞三方面分析EZH2在胃癌的表达情况及与临床病理参数、化疗疗效、无进展生存时间的关系。2.通过体内外实验探讨EZH2基因对胃癌生长和化疗敏感性的影响。3探索EZH2介导胃癌生长和耐药的相关分子生物学机制。方法:1.利用公共数据库生物信息学方法分析胃癌组织中EZH2基因的表达;用定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测胃癌细胞株中EZH2 m RNA和蛋白的表达;免疫组化法检测胃癌组织中EZH2蛋白的表达,并分析其与临床病理参数、化疗有效率和无进展生存期的相关性。2.构建慢病毒载体sh EZH2,慢病毒感染EZH2高表达人胃癌细胞株MGC803,并筛选出稳转株,应用Real-time Q-PCR和Western blot检测干扰效果。3.体外细胞学试验,采用CCK-8增殖试验、Transwell侵袭试验和划痕试验研究人胃癌细胞株MGC803在EZH2沉默前后增殖、侵袭和迁移的变化;通过CCK-8毒性实验对比EZH2沉默前后对紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶化疗敏感性的改变及EZH2小分子抑制剂GSK126与这些化疗药物是否具有协同作用。体内研究,构建EZH2沉默人胃癌细胞株裸鼠移植瘤模型,腹腔灌注紫杉醇,研究EZH2下调对胃癌生长和化疗敏感性的影响。4.首先我们以胃腺癌TCGA（The Cancer Genome Atlas,TCGA）转录组数据集进行KEGG信号通路富集分析,探讨受EZH2激活调节的下游途径;接着通过细胞转录组测序分析,进一步探索EZH2在胃癌的相关分子机制和信号通路;然后利用Western blot实验验证信号通路关键蛋白表达;最后通过Real-time Q-PCR技术检测EZH2下调对信号通路下游生长和耐药相关分子的影响,探索胃癌生长和耐药的分子机制。结果:1.公共数据库结果表明,胃癌中EZH2的表达高于正常组织或相应癌症相邻的组织;MGC803、BGC823、AGS和HGC27胃癌细胞株EZH2 m RNA和蛋白均有表达,其中MGC803表达最高;免疫组化结果显示:EZH2基因在晚期胃癌中呈现高表达,EZH2蛋白表达与病理类型及化疗疗效相关,且EZH2蛋白的表达与化疗疗效呈现负相关。EZH2高表达组中位TTP低于EZH2低表达组,具有统计学差异。2.EZH2-sh RNA慢病毒载体成功构建并转染人胃癌细胞系MGC803,应用Real-time Q-PCR和Western blot检测干扰效果,证明成功构建了稳定沉默EZH2的胃癌细胞株MGC803。3.体外细胞学实验:CCK-8增殖实验结果显示,EZH2沉默组的OD值和细胞增殖率较对照组显着下降,差异有统计学意义;Transwell实验表明,EZH2沉默组的转移细胞数量显着减少,具有统计学意义;划痕损伤实验表明,与对照组MGC803-Vector对比,MGC803-sh EZH2细胞划痕愈合率从12小时就有所下降,到36小时出现明显下降,差异均具有统计学意义。CCK8毒性实验表明,EZH2沉默使MGC803细胞对紫杉醇、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的敏感性提高,IC50值明显下降,具有明显统计学差异;转化为抑制率曲线图,可以看出EZH2基因沉默后紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶作用于MGC803-sh EZH2细胞的抑制效果增强。药物协同研究发现,EZH2抑制剂GSK126和紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶均具有协同作用;其中GSK126联合紫杉醇的CI值随着紫杉醇剂量的增加而增大,说明小剂量的紫杉醇与GSK126表现出更好的协同作用。体内裸鼠移植瘤实验发现,沉默EZH2使胃癌细胞株MGC803的裸鼠皮下成瘤能力减弱,对紫杉醇的化疗敏感性提高。4.公共数据库KEGG信号通路富集分析结果显示,EZH2通过m TOR信号传导途径、MAPK信号传导途径、P53信号传导途径及ERBB信号传导途径介导胃癌的生物学特性。细胞转录组测序分析结果显示,EZH2沉默前后筛选鉴定出1735个DEGs,其中表达上调的1131个,表达下调的604个。GO功能富集分析显示上调的DEGs主要与靶向膜蛋白翻译、细胞质翻译、核糖核酸代谢、线粒体电子传递等有关,下调的DEGs主要与生长发育的调控、信号通路的调控、磷酸化的调控、蛋白激酶C活性的调节等有关。KEGG信号通路富集分析显示具有显着性意义的信号通路有19条,其中与胃癌相关的信号通路有肿瘤途径、PI3K-Akt信号通路、Fox O信号通路、Erb B信号通路、HIF-1信号通路、TGF-β信号通路等;蛋白印迹实验证实EZH2沉默使MGC803胃癌细胞PI3K和p-Akt蛋白的表达下调,而AKT的表达总量无明显变化,说明EZH2的下调可阻断AKT的磷酸化过程,从而抑制P13K-Akt信号通路的过度活化。Real-time Q-PCR技术检测EZH2参与调控胃癌生长和耐药的相关分子机制,结果显示EZH2沉默使胃癌凋亡分子P53 m RNA表达上调、Bcl-2 m RNA表达下调;胃癌耐药相关分子MDR-1、MRP-1、LRP、BCRP、GST-πm RNA表达下调,差异均具有统计学意义。结论:1.EZH2在胃癌中呈现高表达,且高表达的EZH2可能与肿瘤进展、预后不良及化疗敏感性差有关。2.成功构建了EZH2稳定沉默的人胃癌细胞株MGC803,为后来实验奠定了基础。3.体内外实验证实EZH2沉默使胃癌生长减慢、侵袭迁徙能力下降,对化疗药物的敏感性提高。4.EZH2抑制剂GSK126与紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶具有协同作用,EZH2基因有可能成为胃癌新的治疗靶点。5.EZH2激活PI3K-AKT信号通路是胃癌的重要机制之一;EZH2通过调控凋亡相关分子和耐药相关分子的表达介导胃癌的生长和耐药性。
周唯[2]（2021）在《基于整合大数据的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌上市后评价研究》文中进行了进一步梳理研究目的胃癌和食管癌是我国发病率较高的消化系统肿瘤。目前其治疗方法以放化疗为主。复方苦参注射液是常用的抗肿瘤类中药注射液,具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛之功效,临床上多用于胃癌和食管癌等消化道肿瘤的治疗。本研究在整合大数据理念指导下,综合运用网状Meta分析、网络药理学、生物信息学、分子生物学等研究方法开展复方苦参注射液治疗胃癌和食管癌的临床评价与机制研究,希冀为科学评价其临床疗效和揭示其分子机制提供高质量证据。研究方法1网状Meta分析首先全面检索国内外数据库中复方苦参注射液等抗肿瘤类中药注射剂治疗胃癌、食管癌的随机对照实验文献并依据纳入排除标准遴选文献,进而应用WinBugs1.4和Stata13.0软件对临床总有效率、生活质量改善和不良反应改善等结局指标进行分析,并生成网状关系图、曲线下面积图和三维数据立方体图,从而解析复方苦参注射液与其他同类注射剂相比的治疗优势与特点。2整合生物信息学分析本论文综合运用了网络药理学、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、芯片Meta分析、分子对接、经典生物信息学的方法整合分析了复方苦参注射液治疗胃癌、食管癌的作用机制。在复方苦参注射液治疗胃癌的作用机制研究中,首先对GEO和TCGA数据库中的miRNA表达数据进行差异分析并且对其进行靶基因预测,之后应用WGCNA对TCGA中的RNA测序数据和临床信息进行关键模块筛选,根据复方苦参注射液成分靶点和以上胃癌关键信息进行复方苦参注射液干预胃癌的ceRNA网络构建。同时,本研究运用芯片Meta分析对比了关键基因在胃癌组织和正常组织之间的表达差异。利用GO和KEGG富集分析以明确关键基因所涉及的生物调控途径;通过生存分析和免疫浸润分析进一步检测了关键基因对胃癌预后的意义。最后,采用分子对接验证关键基因和复方苦参注射液中相关成分的结合能力。在复方苦参注射液治疗食管癌的机制研究中,首先从GEO数据库中下载食管癌高通量测序芯片数据并进行整合差异分析;其次根据TCGA中的食管癌RNA测序数据进行关键模块构建筛选;最后根据DisgeNET数据进行食管癌疾病靶点的数据搜集。根据以上信息进行网络药理学分析,从而分析复方苦参注射液治疗食管癌的作用机制。3分子生物学实验本研究首先采用MTT和CCK-8方法观察复方苦参注射液对胃癌细胞和食管癌细胞的增殖影响。之后分别应用RT-qPCR和Western blot法检测复方苦参注射液对胃癌细胞及食管癌细胞中mRNA和蛋白表达的影响。同时,本研究采用TMT方法系统研究了复方苦参注射液给药后胃癌细胞蛋白变化情况。研究结果1 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗胃癌临床评价研究本部分研究共纳入随机对照试验文献68篇,涉及8种抗肿瘤类中药注射剂,相关胃癌患者5525名。网状Meta分析结果显示,与对照组仅用FOLFOX相比,联合使用复方苦参注射液在提高临床总有效率、改善免疫功能指标和生活质量以及减缓不良反应中均具有统计学意义。此外,多指标三维聚类分析结果显示,复方苦参注射液与同类注射液相比在临床疗效和缓解不良反应综合评价中亦有较好排序。2 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗食管癌临床评价研究此部分研究共纳入随机对照试验文献52篇,涉及7种抗肿瘤类中药注射剂,相关食管癌患者3876名。网状Meta分析结果显示,与对照组仅用化疗相比,在提高临床总有效率、改善生活质量、减少恶心呕吐方面复方苦参注射液联合化疗使用成为最优干预措施的概率最大。相关结局指标聚类分析显示,复方苦参注射液在多结局指标评价中亦有明显优势。3 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗胃癌作用机制研究采用网络药理学与生物信息学相结合的方法,预测得到复方苦参注射液可能参与调控的ceRNA网络以及复方苦参注射液直接干预胃癌的基因靶点。对胃癌基因表达谱芯片进行 Meta 分析后发现关键基因 AKR1B1,CTSK,MMP2,TLR4,ADRB2,PDE1C和PTGER3在胃癌组织中具有显着差异。生存分析亦显示AKR1B1,MMP2和PTGER3在影响胃癌患者生存率方面具有重要意义。功能富集分析表明复方苦参注射液可以通过激活诸如PI3K-Akt和Toll样受体信号通路等信号通路来抑制癌细胞增殖并调节免疫力,从而治疗胃癌。4 基于整合高通量数据分析的食管癌关键基因研究此部分旨在确定与食管癌的发病机制和预后相关的潜在关键基因。差异分析结果表明,与正常组织相比,癌症组织中共有134个上调和183个下调的差异表达基因并且据此构建蛋白互作网络。根据度值筛选出十个关键基因（AURKA,CDC20,BUB1,TOP2A,ASPM,DLGAP5,TPX2,CENPF,UBE2C和NEK2）。功能富集分析表明,多种细胞外相关条目和ECM-受体相互作用途径均与食管癌密切相关。5 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗食管癌作用机制研究首先应用WGCNA方法研究基因表达数据与食管癌患者临床特征之间的联系,进而结合芯片分析的差异基因、疾病数据库基因和复方苦参注射液成分对应的预测靶标进行网络药理分析。结果显示EGFR、ERBB2、CCND1和AURKA是与复方苦参注射液治疗食管癌相关的核心基因。此外,通过富集分析预测发现,复方苦参注射液还可以调控食管癌中的ERBB信号通路和PI3K-AKT信号通路等相关通路。6 基于蛋白组学分析复方苦参注射液治疗胃癌的分子作用机制本研究采取TMT定量蛋白质组学研究方法来进行复方苦参注射液干预胃癌细胞后的差异表达蛋白质分析。研究发现,共有差异蛋白794个,其中包括上调蛋白490个以及下调蛋白304个。此外,结果发现复方苦参注射液可以通过影响如PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路等遏制胃癌进展。7 复方苦参注射液对胃癌细胞和食管癌细胞的作用影响实验结果表明,复方苦参注射液可以抑制胃癌细胞和食管癌细胞的增殖。通过RT-qPCR和Western blot实验证实复方苦参注射液可以抑制胃癌细胞中AKR1B1和MMP2的过表达,还可以上调胃癌细胞中的PTGER3;此外,复方苦参注射液也可以下调食管癌细胞中的EGFR和AURKA的异常高表达。研究结论本论文在整合大数据理念指导下,综合运用临床大数据与生物信息大数据研究方法开展复方苦参注射液临床评价与机制研究。结果显示,复方苦参注射液治疗胃癌、食管癌疗效确切且与同类注射液对比有优势或特色,其核心机制与调控胃癌、食管癌关键基因密切相关。同时,本研究还探索实践了以网状Meta分析、网络药理学、生物信息学、分子生物学实验为主链的中医药整合大数据研究模式,为中药上市后再评价特别是疗效与机制评价的有效联通提供了示范与路径。
陈伟妍[3]（2021）在《基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的机制研究》文中提出目的:本实验运用细胞学、细胞生物学、分子生物学、裸鼠移植瘤实验等技术手段,通过熊果酸对裸鼠体内胃癌移植瘤的干预实验及体外胃癌细胞MGC-803干预实验,从细胞水平及分子水平探讨熊果酸对体内、外胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的影响,分析凋亡及自噬性死亡的发生机制,为熊果酸抗胃癌的治疗提供丰富的实验依据,为胃癌的中医药治疗提供理论支持。材料与方法:1.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡第一部分实验选取雄性BALB/c裸鼠为研究动物,建立人胃癌MGC-803细胞皮下移植瘤动物模型。实验动物分两组:模型组及熊果酸干预组。首先通过观察肿瘤,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞增殖的作用。进一步通过免疫组织化学染色法及免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。检测自噬性死亡相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞自噬性死亡的作用。最后利用免疫组织化学法及免疫印迹法,阐明熊果酸通过干预PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制胃癌组织生长,抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及自噬性死亡。2.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡第二部分实验选取人胃癌细胞MGC-803进行培养,建立人胃癌细胞模型。首先通过倒置相差显微镜观察细胞数量变化与形态学改变明确细胞的生长状态,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞生长的作用。利用CCK8法探明不同浓度熊果酸对胃癌细胞MGC-803生长的抑制作用。筛选组实验浓度分别为0、20、40、60、80（μmol/L）,时间分别为0、12、24、36、48、72（h）。筛选出熊果酸最佳药物作用浓度40μmol/L与时间48h。实验分为三组:对照组、40μmol/LUA干预组、40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组。时间设定为48h。利用流式细胞术法检测各组细胞凋亡水平,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。通过免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、p-AKT、p-mTOR表达情况,阐明熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803凋亡。3.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞自噬性死亡第三部分实验选取人胃癌细胞MGC-803进行培养,建立人胃癌细胞模型。实验细胞分组:对照组,40μmol/LUA干预组、40μmol/LUA+3-MA组。时间设定为48h。首先通过MDC法制成玻片倒置荧光显微镜下观察细胞内绿色点状荧光信号表达的数量及强度变化情况,及利用双荧光m RFP-e GFP-LC3质粒转染细胞法,荧光显微镜下观察细胞内红色和绿色点状荧光的数量变化,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞发生自噬性死亡的作用。利用免疫印迹法,观察各组细胞自噬性死亡相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达情况,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞自噬性死亡的作用。最后利用免疫印迹法及免疫荧光细胞化学染色法检测PI3K、p-AKT、p-mTOR及ULK1蛋白表达情况,阐明熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803自噬性死亡。结果:1.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡第一部分实验构建胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型成功。熊果酸对裸鼠胃癌移植瘤的生长具有明显抑制作用。与模型组相比,熊果酸干预组移植瘤体积明显减小,差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,熊果酸干预组移植瘤质量明显减小,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色法检测细胞增殖指数结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PCNA蛋白表达减少。与模型组相比,熊果酸干预组中Ki67蛋白表达减少。免疫组织化学染色法检测凋亡相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达增加,Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白结果:与模型组相比,熊果酸干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显着增加,Bax蛋白表达水平也显着增加,Bcl-2蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色法检测自噬相关蛋白结果:与模型组相比,熊果酸干预组中LC3Ⅱ蛋白表达增加,Beclin-1蛋白表达增加,P62蛋白表达减少。免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显着增加,Beclin-1蛋白表达水平也显着增加,P62蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达减少,ULK1蛋白表达增加。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着减少,ULK1蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡倒置相差显微镜观察细胞生长状态结果:对照组胃癌细胞生长旺盛,呈上皮细胞样型,细胞大小不等,多角形或细长形,细胞轮廓清晰,细胞核较大,细胞间连接比较紧密。随着浓度增加,胃癌细胞数量减少。CCK8法检测结果:0-80μmol/L的熊果酸对胃癌细胞生长的抑制作用,随着熊果酸浓度的增加而增加。熊果酸具有抑制胃癌细胞生长的作用,并呈浓度和时间依赖性。熊果酸的最佳药物作用浓度是40μmol/L,最佳药物作用时间是48h。流式细胞术法检测细胞凋亡结果:与对照组比,40μmol/LUA干预组中细胞凋亡率显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中细胞凋亡率显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术法检测显示,凋亡抑制剂仅抑制熊果酸诱导部分胃癌细胞发生死亡,提示除凋亡外胃癌细胞仍存在其它死亡形式。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显着增加,Bax蛋白表达水平也显着增加,Bcl-2蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显着减少,Bax蛋白表达水平也显着减少,Bcl-2蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着增多,差异有统计学意义（P<0.05）。3.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803自噬性死亡采用MDC法检测细胞自噬性死亡结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组细胞内绿色点状荧光数量增多、强度增加。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组细胞内绿色点状荧光数量减少、强度减弱。采用双荧光m RFP-e GFP-LC3质粒转染细胞法检测细胞自噬性死亡结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中黄色和红色点状荧光数量均显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中黄色和红色点状荧光数量均显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。采用免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显着增加,Beclin-1蛋白表达水平也显着增加,P62蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显着减少,Beclin-1蛋白表达水平也显着减少,P62蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着减少,其下游ULK1蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1蛋白表达水平无显着差异,差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光细胞化学染色方法检测各组细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中ULK1蛋白表达增加,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达减少。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1蛋白表达情况无显着变化。结论:1.熊果酸具有抑制体内、外胃癌细胞生长的作用。2.熊果酸通过诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡,从而抑制胃癌细胞生长。3.熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡,从而抑制胃癌细胞生长是通过干预PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。
王玲[4]（2021）在《双硫仑联合铜通过调控应激反应与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞生长》文中认为目的:胃癌对人类生命和经济造成严重负担。化学治疗是胃癌的主要治疗方式之一,然而胃癌患者对化疗药物的敏感性差及不耐受副作用等原因,导致其预后不佳。开发新的化疗药物成为胃癌研究的热点。双硫仑作为一种临床用戒酒药,在癌症中表现出广谱的抗肿瘤作用。双硫仑与铜联合可以增强其抗肿瘤能力。因此,为了给胃癌的治疗提供更多可选择的药物,我们研究双硫仑联合铜对胃癌细胞的作用,同时探讨其效应机制。方法:在体外细胞实验中,以胃癌细胞株MKN-45细胞和BGC-823细胞为细胞模型,采用CCK8法和细胞克隆形成实验分别检测双硫仑联合铜对MKN-45细胞和BGC-823细胞的毒性和增殖活力作用;使用Transwell和细胞划痕实验研究双硫仑联合铜对胃癌细胞的侵袭迁移效应;使用Annexin V-FITC/PI流式细胞凋亡染色和免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白（BCL2、BAX）的表达,研究双硫仑联合铜对MKN-45细胞和BGC-823细胞的凋亡作用;采用透射电镜、免疫印迹、瞬时转染和慢病毒稳定转染等多种方法从结构、分子和蛋白水平研究双硫仑联合铜对MKN-45细胞和BGC-823细胞的自噬作用;使用荧光探针检测活性氧的表达,免疫印迹法检测P21、P53、γ-H2AX、Fzd7、β-catenin、C-myc、Cyclin D1蛋白的表达,使用Seahorse XF24分析仪检测细胞中氧耗率和细胞外酸化率,研究双硫仑联合铜通过调节应激反应和Wnt/β-catenin信号通路发挥对MKN-45细胞和BGC-823细胞的抗肿瘤作用。在体内研究中,以雄性Balb/C裸鼠为动物模型,使用MKN-45细胞建立胃癌的皮下移植瘤模型,通过研究肿瘤体积大小,对肿瘤组织进行苏木素-伊红染色,并利用免疫组化染色检测Ki67的表达,研究双硫仑联合铜对胃癌细胞体内增殖的抑制作用;通过记录裸鼠的体重,研究双硫仑联合铜在体内的毒副作用;通过Tunel凋亡染色及免疫组化（Beclin1、LC3、P53、γ-H2AX、Fzd7、β-catenin、C-myc和Cyclin D1）研究双硫仑联合铜抑制胃癌细胞体内生长的作用机制。结果:双硫仑联合铜抑制MKN-45细胞和BGC-823胃癌细胞的体外增殖活力和侵袭迁移能力,存在时间-剂量依赖性;双硫仑联合铜也可以在体内抑制胃癌皮下移植瘤的生长（抑制率为48.24%）和增殖（Ki67的表达降低）,且无明显毒副作用。在体外,双硫仑联合铜可以诱导MKN-45细胞和BGC-823细胞发生凋亡,调控线粒体凋亡途径中的BCL2和BAX蛋白;在体内,双硫仑联合铜可以诱导凋亡,Tunel染色结果显示实验组移植瘤组织中的凋亡细胞增加。双硫仑联合铜可以在体外诱导MKN-45细胞和BGC-823细胞发生自噬和自噬流,在电镜下可以观察到自噬体,在蛋白水平上调Beclin 1和LC3的表达;通过瞬时转染GFP-LC3和稳定转染m RFP-GFP-LC3分别构建表达GFP-LC3和m RFP-GFP-LC3的胃癌细胞,双硫仑联合铜可以上调MKN-45细胞和BGC-823细胞中GFP-LC3和m RFP-GFP-LC3的表达。双硫仑联合铜可以增加活性氧、抑制糖酵解和氧化磷酸化,在蛋白水平上调P53、P21和γ-H2AX的表达,下调β-catenin、Cyclin D1、C-myc、Fzd7的表达。结论:双硫仑联合铜具有抑制胃癌细胞生长、迁移及侵袭的能力,可以诱导胃癌细胞发生凋亡和自噬,通过调控应激反应和Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肿瘤作用,且在体内无明显毒性作用。双硫仑有潜力成为治疗胃癌的抗肿瘤药物。
李玲[5]（2021）在《基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响》文中进行了进一步梳理研究目的:前期研究证实归芪白术方辅助治疗胃癌（Gastric Cancer,GC）有效改善机体不良反应,提高患者的生存质量,但发挥作用的物质基础和分子机制尚不清楚。本研究运用化学信息学-分子对接-分子动力学结合蛋白检测方法及细胞生物学方法,揭示归芪白术方通过健脾扶正促进免疫活性（靶向免疫检查点PD-L1（程序性死亡受体配体1,Programmed cell death ligand 1）调节免疫细胞功能）同时兼备化瘀祛邪抑制肿瘤增殖（靶向HER2（人表皮生长因子受体2,Human epidermal growth factor receptor 2）抑制肿瘤细胞增殖）的药效物质基础,以及探讨该复方“多点显效,协同增效”的功效特点。研究方法:1.结合临床治疗靶向及数据库筛选归芪白术方治疗GC的作用靶点。使用化学信息学方法构建归芪白术方小分子成分结构库,筛选促进肿瘤细胞增殖的HER2和抑制淋巴细胞活性的PD-L1作为研究靶蛋白;确定靶蛋白（HER2/PD-L1）晶体结构及活性位点,应用分子对接技术,筛选能够与靶蛋白有效结合的代表性靶向成分,并进行分子动力学模拟、结合自由能计算和微量热泳动实验（Microscale thermophoresis,MST）,验证其与靶蛋白结合的亲和力,酶活实验检测中药（Traditional Chinese Medicine,TCM）小分子对HER2的作用。2.检测靶向HER2的中药小分子在不同GC细胞株的抗肿瘤效果;使用靶向HER2的中药小分子干预EGF（表皮细胞生长因子,Epidermal growth factor）刺激的胃癌MKN-45细胞,检测其对GC细胞增殖、克隆形成能力以及对PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT））通路相关蛋白及基因表达的影响;使用抑制PD-L1的中药小分子干预可溶性PD-L1刺激的人外周血T淋巴细胞,检测其对T细胞增殖、细胞因子IFN-γ/IL-2（干扰素γ（Interferon-gamma,IFN-γ）/白介素2（Interleukin-2,IL-2））表达量、PD-1+（程序性死亡受体1,Programmed cell death protein 1）T细胞数量及T细胞功能相关蛋白、基因表达的影响。3.构建人胃癌MKN-45细胞和人外周血T淋巴细胞共培养体系;使用抑制PD-L1的中药小分子formononetin,靶向HER2的中药小分子quercetin,以及quercetin和formononetin配伍干预共培养体系,检测中药小分子干预对T细胞增殖、细胞因子（IFN-γ/IL-2）表达量、T细胞凋亡的影响,观察中药小分子对共培养体系中T细胞功能抑制的干预作用;同时检测中药小分子对GC细胞增殖、凋亡的影响,研究其对GC细胞增殖的抑制作用。研究结果:1.筛选得到HER2和PD-L1作为研究归芪白术方治疗GC物质基础及作用机制的有效靶点。2.归芪白术方中有385个中药小分子与HER2蛋白对接得分值≤-4,189个中药小分子与PD-L1蛋白对接得分值≤-4。选择对接得分较高的中药小分子进行MST,黄芪中的daidzein（大豆苷元）、黄芪/甘草中的quercetin（槲皮素）与HER2具有较高结合亲和力,Kd值分别为3.7μM/490 n M;黄芪/甘草中的isorhamnetin（异鼠李素）/formononetin（刺芒柄花素）与PD-L1具有较高结合亲和力,Kd值分别为667 n M/355 n M。50 ns分子动力学模拟结果显示quercetin与HER2结合模式较稳定,结合自由能为-26.55 Kcal/mol,formononetin与PD-L1结合模式较稳定,结合自由能为-19.41 Kcal/mol。酶活性检测结果显示quercetin能够明显抑制HER2激酶活性,IC50为570.7 n M,daidzein对HER2没有明显的抑制作用。3.通过单独干预EGF刺激的胃癌MKN-45细胞和PD-L1刺激的人外周血T淋巴细胞,发现quercetin能够抑制EGF诱导的GC细胞增殖和克隆形成（P<0.05）,同时抑制HER2、PI3K、AKT蛋白及基因的表达（P<0.05）。Quercetin可通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制GC细胞增殖;formononetin能够一定程度降低PD-1在T淋巴细胞的表达,提高细胞上清液中细胞因子（IFN-γ/IL-2）的表达量,提高PI3K、AKT、p-zap70（T细胞受体相关蛋白激酶70,Zeta chain of T cell receptor associated protein kinase 70）等蛋白的表达（P<0.05）,解除PD-L1导致的T淋巴细胞功能抑制,是通过阻断PD-1/PD-L1信号通路及活化下游PI3K/AKT信号通路实现的。4.靶向HER2和PD-L1的中药小分子配伍干预GC细胞与T淋巴细胞共培养体系,结果显示formononetin、quercetin以及formononetin和quercetin配伍干预能够解除T淋巴细胞增殖抑制、减少T淋巴细胞凋亡、提高细胞因子（IFN-γ/IL-2）表达量、降低PD-1在T淋巴细胞的表达（P<0.05）,并抑制GC细胞增殖（P<0.05）、促进GC细胞凋亡、降低靶蛋白（HER2/PD-L1）在GC细胞的表达,且中药小分子配伍干预效果更好,表明中药小分子配伍干预可以提高共培养体系中的T淋巴细胞活性并且抑制胃癌MKN-45细胞增殖。研究结论:1.分子对接结果从大数据角度初步表明归芪白术方的药效物质基础中既具有可以与促进肿瘤细胞增殖靶蛋白HER2结合的小分子成分,也具有与抑制淋巴细胞活性靶蛋白PD-L1结合的小分子成分,通过“多点显效,协同增效”的功效特点,在阻断HER2抑制肿瘤细胞增殖的同时干预PD-L1通路促进免疫细胞活性;2.细胞生物学研究揭示了归芪白术方“多点显效,协同增效”促进免疫活性并抑制肿瘤的物质基础及健脾化瘀法治疗GC的作用机制;3.揭示中药归芪白术方通过健脾化瘀法治疗胃癌的科学内涵,为归芪白术方的有效性提供更具体的化学、生物信息学支撑,为归芪白术方的开发与转化提供依据,同时为中药复方的现代化研究提供方法学参考。
王登峰[6]（2021）在《FXa通过GOSR1/ROS/bcl-2信号轴调控胃癌失巢凋亡抵抗的相关研究》文中研究指明背景胃癌（gastric cancer,GC）是现阶段最常见的一种恶性肿瘤,其特点主要以复发概率高、侵袭速率快和扩散转移性强等方面,且在临床治疗中完全治愈的概率较低。而我国是该病最高发之一,大多数患者就诊时已处于进展期或晚期,无论从诊断、治疗及干预措施等方面较为有限,患者生存周期较短。既往较多研究表明失巢凋亡抵抗现象在肿瘤浸润转移中发挥了一定作用,但是否经由凝血因子调控此表型并无相关报道。其中凝血因子Xa（FXa）是凝血过程中的关键酶,然而我们探索其在胃癌中是否参与、调控失巢凋亡抵抗表型过程中,惊喜的发现其与失巢凋亡抵抗密切相关,其具体调控机制在下文详细表述。目的探索FXa在胃癌进程中介导失巢凋亡抵抗的现象及机制,为防治胃癌浸润转移提供新的策略。方法1.通过TCGA数据库分析FXa与胃癌的关系,免疫组化染色检测FXa在胃癌组织标本中的表达情况。2.通过q PCR和WB研究FXa在胃癌细胞系中相对m RNA及蛋白表达水平;使用polyhema胶构建悬浮细胞模型;使用慢病毒载体构建FXa的胃癌稳转细胞株,并通过WB技术验证FXa调控胃癌细胞凋亡及浸润转移相关蛋白表达水平;使用流式细胞技术检测FXa调控胃癌细胞失巢凋亡表型;使用Transwell实验、划痕实验、CCK8实验验证FXa调控胃癌细胞的浸润、增殖、转移表型;借助于WB和Elisa方法研究FXa在能量代谢途径中丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）、活性氧（ROS）以及乳酸脱氢酶（LDH）表达情况。3.通过TMT蛋白质谱测序得出FXa下游靶点GOSR1蛋白,通过Co-IP验证与FXa的相关作用关系,通过敲减GOSR1来验证其在细胞内的表型;借助于WB及Elisa技术手段论证FXa在糖酵解和线粒体氧化磷酸化不同信号通路中的乳酸脱氢酶（LDH）、丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）、活性氧（ROS）表达情况。4.体内构建胃癌细胞皮下成瘤模型验证FXa及GOSR1在胃癌中的调控作用。结果1.利用TCGA肿瘤数据库分析375例肿瘤样本和32例正常样本,得出与胃癌相关的62个凝血相关基因证实FXa m RNA表达与胃癌进展相关。并且通过在线网站及TCGA数据分析表明癌旁相较癌组织表达高,且与胃癌不良预后呈负相关;单因素回归分析表明,年龄、UICC分期（Ⅲ,Ⅳ）、巨噬细胞、FXa与胃癌患者预后相关（HR=1.350,95%CI=0.956-1.543,P=0.020）;多因素COX回归分析中,FXa与胃癌患者预后相关也与预后显着相关（HR=1.050,95%CI=0.905-1.217,P=0.004）,GEO数据库（GSE22237）验证FXa与胃癌患者不良预后相关,与TCGA数据结果一致,这些提示较其他因素,FXa可以作为胃癌的独立预后因子。并且我们通过免疫组化显示74例高低分化胃癌标本中,FXa在癌旁组织中的表达相较于癌组织高,FXa的表达与瘤径大小（P=0.049）、TNM分期（P=0.001）有关。2.采用q RT-PCR和WB检测FXa m RNA和蛋白在GES-1及不同分化程度胃癌细胞系SNU216、NCI-N87、MKN45、HGC27和AGS中的表达。结果表明:与正常胃上皮细胞GES-1相比,FXa在HGC27细胞株中的表达呈明显增高（P<0.001）,在MKN45、N87和SNU216等三株细胞中表达均降低。然后证实FXa是否在胃癌细胞失巢凋亡抵抗中发挥作用,我们将MKN45和NCI-N87细胞进行悬浮24小时处理。分别检测MKN45和NCI-N87细胞在贴壁、悬浮状态下的FXa表达量,结果表明:两株细胞MKN45和NCI-N87在悬浮24h后FXa表达量均减低。转染FXa过表达病毒,与贴壁细胞相比,悬浮24后,MKN45和NCI-N87凋亡率明显增加（P<0.01）,透过小室的细胞明显减少,过表达FXa细胞的侵袭能力明显下降（P<0.001）,迁移间距在24h明显减小（P<0.001）,细胞的增值能力下降（P<0.05）。在MKN45细胞中,与对照组细胞相比,FXa过表达且悬浮24h后凋亡蛋白caspase-7和caspase-3的相对表达量明显增加（P<0.001）,抗凋亡蛋白bcl-2的表达量则明显减低（P<0.001）;同样,在人胃癌细胞株NCI-N87中,与未过表达FXa相比,过表达FXa的细胞且悬浮24h后凋亡蛋白caspase-7和caspase-3的相对表达量也与MKN45结果一致,但是,不同的是,在贴壁和悬浮状态下,bcl-2的相对表达量无差异（P>0.05）。3.通过ELISA方法检测了FXa过表达后胃癌细胞LDH活性,在MKN45细胞中,与对照组细胞相比,FXa过表达且悬浮24h后LDH活性明显增加（P<0.001）;同样,在人胃癌细胞株NCI-N87与上述结果一致（P<0.001）。同样的方法检测胃癌细胞中ROS活性,在MKN45细胞中,与对照组细胞相比,FXa过表达且悬浮24h后ROS活性明显降低（P<0.001）;同样,在人胃癌细胞株NCI-N87中,过表达FXa且悬浮24h后ROS活性明显下降（P<0.001）。与对照组细胞相比,过表达FXa且悬浮24h后PDK1和PDK4的相对表达量在MKN45和NCI-N87细胞中均升高明显（P<0.001）,而PDK2和PDK3蛋白相对表达量均无明显变化（P>0.05）。4.蛋白质谱结果提示过表达FXa且悬浮后,GOSR1的表达上调。且通过Co-IP证实FXa在细胞内与GOSR1有相互作用关系。5.采用WB检测GOSR1蛋白在GES-1及不同胃癌细胞系SNU216、AGS、NCI-N87、MKN45和HGC27中的表达,结果表明:与正常胃上皮细胞GES-1相比,GOSR1蛋白在NCI-N87、MKN45细胞株中的表达明显增高（P<0.05）,在AGS和HGC27细胞中表达均降低（P<0.05）,在SNU216细胞中表达无明显差异（P>0.05）。对MKN45和NCI-N87细胞进行了悬浮处理表明,悬浮24h后GOSR1蛋白的相对表达量增加（P<0.001）,而在48h后GOSR1表达量较24h表达降低（P<0.05）,但仍明显高于贴壁状态。6.质粒转染敲低GOSR1,流式方法检测了过表达FXa组、敲减GOSR1对照组、敲减GOSR1组以及过表达FXa+敲减GOSR1组后悬浮24h状态下细胞的凋亡率,结果显示:与对照组相比,敲减GOSR1后悬浮24h细胞凋亡率明显增加（P<0.05）。与未敲减GOSR1的MKN45细胞迁移间距相比,敲减GOSR1组以及过表达FXa+敲减GOSR1后细胞的迁移间距在24h明显减小,具有统计学差异（P<0.05）。与FXa未表达组相比,过表达FXa且悬浮24h后bcl-2的表达量减少（P<0.05）,与未敲减GOSR1组相比,敲减GOSR1且悬浮24h后bcl-2的表达量减少（P<0.05）,同时过表达FXa且敲减GOSR1组bcl-2的表达量均明显低于前两组（P<0.01）。与FXa未表达组相比,过表达FXa且悬浮24h后ROS的表达量明显减少（P<0.001）,与未敲减GOSR1组相比,敲减GOSR1且悬浮24h后ROS的表达量明显减少（P<0.001）,同时过表达FXa且敲减GOSR1组ROS的表达量均明显低于前两组（P<0.01）。7.构建OE-NC-FXa、OE-FXa和sh-NC-GOSR1、sh-GOSR1小鼠背部皮下MKN 45细胞成瘤模型。结果显示:过表达FXa组肿瘤成长缓慢,瘤体生长速度明显小于未过表达组;而与未敲减GOSR1组相比,在敲减GOSR1胃癌细胞株中,趋势同前FXa过表达组。在MKN45细胞中,与NC组细胞相比,OE-FXa组及sh-GOSR1组抗凋亡蛋白bcl-2及ROS的表达量均降低（P<0.05）。结论1.本研究证实FXa在胃癌组织及胃癌细胞株上阳性表达。FXa在胃癌组织上的表达水平显着低于癌旁组织,胃癌组织上FXa的表达水平与肿瘤大小、TNM分期存在显着相关性;2.FXa促进胃癌细胞的侵袭、增殖、迁移能力;3.FXa通过GOSR1/ROS/bcl-2信号轴来调控肿瘤细胞的失巢凋亡抵抗,从而影响胃癌的浸润、转移。
俞泽元[7]（2021）在《新型UBE2T抑制剂通过阻止RACK1泛素化抑制Wnt/β-catenin信号通路激活及胃癌生长》文中研究说明第一章Wnt/β-catenin信号通路异常激活及抑制剂在胃癌中的作用目的:研究Wnt/β-catenin信号通路异常激活在胃癌中的作用,探究目前处于临床或临床前研究中的Wnt抑制剂对胃癌细胞生长增殖的影响。方法:利用Oncomine platform和GEPIA公共数据库挖掘探讨β-catenin m RNA在胃癌组织中的表达水平。免疫组化实验检测β-catenin在胃癌与癌旁组织中蛋白表达水平。MTT实验检测九种抑制剂对胃癌细胞和正常胃黏膜细胞活力的影响。结果:Oncomine platform数据库中的五个基因组芯片数据分析显示胃癌组织中β-catenin m RNA水平显着高于癌旁组织,这与GEPIA数据库分析结果一致。免疫组化染色实验证实β-catenin的蛋白表达水平在胃癌组织中的表达明显升高。MTT试验结果显示三种抑制剂（NCB-0846,nicosamide,and PRI-724）对正常胃黏膜细胞有显着细胞毒性,而另外六种抑制剂（IWP-2,LF3,ethacrynic acid,ETC-159,LGK-974,and Wnt-C59）不仅不能抑制胃癌细胞的生长,还对正常胃黏膜细胞具有较高细胞毒性。结论:过度激活Wnt/β-catenin信号通路在胃癌的发生发展中起着重要作用。目前应用于其他癌症中临床前或临床研究的Wnt通路抑制剂要么具有较高的细胞毒性,要么对抑制胃癌细胞生长无效。第二章基于Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin破坏复合物组分胃癌新靶点的筛选及验证目的:探讨β-catenin破坏复合物组分RACK1在胃癌组织中下调的调控机制。方法:利用免疫组化方法在胃癌组织中筛选β-catenin破坏复合物主要组分,应用免疫组化,q RT-PCR,West blotting实验检测RACK1在胃癌中的表达水平。大量液相色谱-串联质谱分析寻找与RACK1相互作用的互作蛋白。免疫共沉淀及MST实验证实UBE2T与RACK1直接相互作用。泛素化实验验证UBE2T介导的RACK1泛素化。结果:免疫组化及West blotting实验证实RACK1蛋白水平在胃癌中低表达,并且胃癌中低表达RACK1与胃癌患者总体生存呈负相关,而q RT-PCR实验显示RACK1m RNA水平在胃癌与胃癌癌旁组织表达相似。通过大量质谱分析,我们鉴定出与RACK1相互作用的泛素结合酶UBE2T。免疫共沉淀及微量热运动实验证实了UBE2T与RACK1存在直接相互作用。我们通过泛素化实验数据显示UBE2T促进RACK1的泛素化。结论:β-catenin破坏复合物中重要组分RACK1在胃癌中通过泛素蛋白酶途径调节。第三章UBE2T通过泛素化调控RACK1降解激活Wnt/β-catenin信号通路的机制研究目的:探讨UBE2T通过泛素化调控RACK1激活Wnt/β-catenin信号通路的机制。方法:在HEK-293T细胞中,分别瞬时感染RACK1质粒和不同浓度UBE2T质粒,Western blot分析RACK1蛋白表达水平。利用Western blotting实验检测UBE2T敲除对RACK1蛋白水平表达的影响,IP实验检测RACK1的具体泛素链。应用胃癌病例石蜡样本连续切片,研究UBE2T与RACK1及β-catenin在胃癌组织中蛋白表达水平的相关性。通过免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）和WB方法分析UBE2T活性位点C86对RACK1泛素化水平的调控作用。在无E3参与情况下,体外泛素化实验检测UBE2T对RACK1泛素化影响。应用分子克隆技术构建RACK1的截断体,通过免疫沉淀和Western blotting方法分析UBE2T催化RACK1泛素化的具体赖氨酸位点。在HEK-293T细胞中瞬时感染RACK1及UBE2TC86突变质粒后,提取细胞浆蛋白及核蛋白,用Western blot检测β-catenin蛋白表达水平。结果:Western blotting实验显示UBE2T过表达可导致RACK1蛋白的减少,且在UBE2T敲除的胃癌细胞株AGS中RACK1蛋白升高,UBE2T通过K48泛素链催化RACK1的多聚泛素化。免疫组化实验结果显示胃癌组织中UBE2T与RACK1表达水平呈负相关,而与β-cateninin表达水平呈正相关。UBE2T促进RACK1的多聚泛素化降解依赖于UBE2T活性位点半胱氨酸C86位点,主要通过RACK1的赖氨酸位点K172,K225及K257促进其降解的,且这个过程不依赖于E3酶。UBE2T通过诱导RACK1降解促进β-catenin进入核细胞激活Wnt/β-catenin信号通路导致胃癌的发展。结论:UBE2T在缺少E3的情况下,通过RACK1赖氨酸位点K172,K225及K257促进RACK1的泛素化降解,继而导致Wnt/β-catenin信号通路激活。第四章泛素结合酶UBE2T在胃癌中的表达及其对胃癌细胞功能的研究目的:探究UBE2T对胃癌进展的影响。方法:利用Oncomine platform和GEPIA公共数据库挖掘探讨UBE2T在胃癌及多种癌组织中的表达水平。应用Western Blotting和q RT-PCR方法检测胃癌标本及癌旁组织中UBE2T表达水平情况。免疫组化检测UBE2T在胃癌及胃癌癌旁组织中的蛋白表达水平,分析UBE2T蛋白表达水平与临床病理参数的相关性。Western Blotting方法检测UBE2T在胃癌细胞株和正常胃黏膜细胞中的表达水平情况。通过CRISPR/Cas9敲除技术,应用克隆形成及裸鼠成瘤实验方法,检测UBE2T对胃癌细胞增殖和肿瘤生长的影响。结果:来自Oncomine及GEPIA数据库的数据显示胃癌组织中UBE2T m RNA表达水平较胃癌癌旁组织表达水平明显升高,且在24种癌中UBE2T m RNA水平也明显升高。免疫组化检测结果显示UBE2T蛋白表达水平与肿瘤大小,T分期,淋巴结转移数,临床病理分期及较差预后呈正相关。克隆形成实验证实敲除UBE2T后胃癌细胞生长增殖能力明显减弱。敲除UBE2T基因表达可显着抑制胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。结论:敲除UBE2T能够抑制胃癌生长,UBE2T有望成为治疗胃癌的靶点.第五章新型UBE2T小分子抑制剂的发现及其对胃癌细胞作用的研究目的:UBE2T抑制剂的发现及其对胃癌细胞的抗肿瘤效应。方法:应用虚拟筛选软件Schrodinger（薛定谔）软件在Chemdiv和SPECS小分子化合物数据库中筛选靶向UBE2T的抑制剂进行分子对接并评分,选择评分较高的化合物。利用MTT实验检测18种化合物对三种胃癌细胞株的抑制作用,筛选目标化合物并测量IC50。应用微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）实验测定分析UBE2T蛋白和化合物之间的相互作用。通过免疫沉淀和WB方法分析小分子抑制剂对RACK1泛素化水平的影响。利用Western blot检测加入小分子抑制剂后β-catenin在胃癌细胞核蛋白,胞浆蛋白及总蛋白的表达水平。应用克隆形成,Traswell实验及裸鼠成瘤实验方法,检测UBE2T抑制剂对胃癌细胞增殖侵袭能力和肿瘤生长的影响。结果:本实验通过计算机虚拟筛选出18个UBE2T小分子抑制剂。MTT实验显示仅有小分子抑制剂M435-1279能够显着抑制三种胃癌细胞株生长。研究结果也证实小分子抑制剂M435-1279不能够阻碍UBE2T与RACK1的结合,但是能够显着抑制RACK1的泛素化水平,继而抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。UBE2T小分子抑制剂M435-1279能够在体外显着抑制胃癌细胞生长迁移能力,抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。结论:M435-1279有望成为针对泛素结合酶UBE2T治疗胃癌的有效小分子抑制剂。
李永红[8]（2020）在《空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究》文中提出研究目的以手术及放化疗为主的胃癌治疗已经进入平台期。过去三十年中,以凋亡蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物研发取得了一定的进展,但受凋亡蛋白高频可变剪接、肿瘤异质性等因素的影响,凋亡相关靶向药物在临床应用特别是在胃癌等实体肿瘤中疗效欠佳。因此,基于凋亡因子可变剪接调控的抗肿瘤研究引起广泛关注,但在胃癌中的相关研究尚未见相关报道。Mcl-1分子是Bcl-2凋亡基因家族的核心成员,Mcl-1 pre-mRNA可通过可变剪接表达抗凋亡蛋白Mcl-1L和促凋亡蛋白Mcl-1S两种剪接异构体。基于Mcl-1可变剪接的干预有望通过改变肿瘤细胞抗凋亡状态、促进肿瘤细胞凋亡而成为胃癌治疗的新策略和新靶点。本研究通过临床研究,明确凋亡因子Mcl-1可变剪接与胃癌病理分级、临床分期、生存预后的相关性;通过细胞学实验,探讨空间阻滞寡核苷酸（SBOs）调控Mcl-1可变剪接进而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖的生物学效应;通过裸鼠移植瘤实验,在体内验证SBOs治疗对肿瘤组织Mcl-1可变剪接的调控作用及其促进肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤生长增殖的作用。研究方法临床研究:应用基因表达谱交互分析软件GEPIA分析来源于TCGA数据库的408例胃癌组织以及36例正常胃粘膜组织中Mcl-1 mRNA表达情况及其与胃癌病理分级、临床分期、生存预后之间的相关性;收集59例胃腺癌患者新鲜胃癌组织和31例胃炎患者胃黏膜组织,应用荧光定量PCR技术定量检测Mcl-1可变剪接产物Mcl-1L及Mcl-1S的mRNA表达;利用Western blotting技术对Mcl-1L及Mcl-1S蛋白表达水平进行半定量检测;Mcl-1L及Mcl-1S表达水平与胃癌病理分级、临床TNM分期、生存预后的相关性分析。体外实验:合成Mcl-1特异性SBOs,应用Endo-Porter系统转染至不同分化程度的胃癌细胞系（MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、MKN-45（低分化））;RT-q PCR及Western blotting技术检测转染不同浓度SBOs细胞的Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡活化状态;CCK8增殖实验评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的增殖能力。体内实验:应用胃癌细胞系种植裸鼠背前壁皮下部位建立MKN-45和HGC-27两种胃癌移植瘤模型;通过瘤体局部多点注射不同剂量Mcl-1特异性SBOs,注射3天后处死裸鼠;记录裸鼠移植瘤体积治疗前后变化并组间比对分析;RT-q PCR及Western blotting技术检测不同浓度SBOs治疗后癌组织Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;HE染色后计算SBOs治疗后肿瘤组织细胞死亡面积;免疫荧光技术原位观察肿瘤组织细胞凋亡;组织研磨后制备组织细胞悬液,应用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率,同时应用Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价不同剂量SBOs治疗的胃癌组织的肿瘤凋亡活化状态;应用免疫组化技术检测细胞增殖指标Ki-67表达。研究结果临床研究:与正常胃粘膜组织相比,肿瘤组织中Mcl-1L mRNA表达显着升高（p<0.05）,与之相反,Mcl-1S mRNA表达则显着降低（p<0.01）,Mcl-1S/Mcl-1L mRNA亦明显降低（p<0.001）;与mRNA表达水平差异相一致,在胃癌组织中,Mcl-1L蛋白表达明显升高,Mcl-1S蛋白表达水平显着降低;同时,Mcl-1S与Mcl-1L mRNA表达水平的比值与胃癌T分期呈负相关,与N分期无明显关联性;Kaplan Meier生存分析显示,低Mcl-1S/Mcl-1L mRNA水平胃癌患者的总生存期低于Mcl-1S/Mcl-1L mRNA高水平胃癌患者。体外实验:相对GES-1正常细胞,不同分化程度的胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Mcl-1L表达明显升高,Mcl-1S表达显着降低,但胃癌细胞株组间无显着差异;转染不同浓度SBOs 48 h后,Mcl-1L mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性降低,而Mcl-1S mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性增加;与mRNA水平的定量变化相似,SBOs处理的胃癌细胞系中,Mcl-1L蛋白表达水平下降,Mcl-1S蛋白表达水平升高;流式细胞术检测SBOs处理的胃癌细胞系显示三株细胞凋亡率均呈SBOs剂量依赖性升高;SBOs处理的胃癌细胞系中,细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）表达显着升高;转染不同浓度SBOs胃癌细胞的CCK8 OD值呈SBOs剂量依赖性升高。体内实验:SBOs治疗后,MKN-45和HGC-27两种小鼠移植瘤组织中Mcl-1S mRNA及蛋白表达上调,而Mcl-1L表达显着下调;肿瘤组织HE染色显示,相对于对照组,SBOs治疗组移植瘤组织细胞死亡面积呈SBOs剂量依赖性增加;免疫荧光原位检测显示,治疗后癌组织原位肿瘤细胞凋亡数量亦呈SBOs剂量依赖性增加;流式细胞术定量检测细胞凋亡显示,MKN-45异种移植模型中Con-SBO、6.25和12.5 mg/kg SBOs治疗组肿瘤细胞凋亡率分别为2.76%、14.44%和28.75%,在HGC-27异种移植模型中肿瘤细胞凋亡率分别为2.49%、31.26%和50.57%;SBOs治疗后,肿瘤组织中细胞凋亡关键标志物Bak、cleaved caspase9和cleaved caspase 3表达水平明显升高;SBOs治疗组肿瘤体积基本保持稳定,而对照组肿瘤体积增长超过30%;免疫组化检测显示,SBOs治疗组肿瘤生存能力和增殖的指标Ki-67表达率呈SBOs剂量依赖性下降。研究结论1.凋亡因子Mcl-1可变剪接异构体Mcl-1L和Mcl-1S在胃癌中表达不平衡,与胃癌临床进展及预后不良密切相关。2.Mcl-1特异性SBOs可以调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接从Mcl-1L转换为Mcl-1S mRNA剪接模式,抑制抗凋亡可变剪接异构体Mcl-1L的表达,诱导促凋亡异构体Mcl-1S的表达;这种干预能有效促进不同分化程度胃癌细胞的凋亡并抑制胃癌细胞增殖。3.在活体肿瘤组织内Mcl-1特异性SBOs亦可靶向调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接,使剪接模式从Mcl-1L向Mcl-1S mRNA转换,进而诱导胃癌移植瘤组织细胞凋亡并抑制移植瘤增殖和生长。4、以Mcl-1可变剪接为靶标的细胞凋亡调控,具有较高的特异性和有效性可作为抗胃癌治疗的新方向。
韩文秀[9]（2020）在《钙库操纵钙内流通过调节COL1A1蛋白对胃癌细胞增殖和上皮间质转化的影响》文中提出胃癌是全球发病率第5,死亡率第3的恶性肿瘤。胃癌的诱因主要有幽门螺杆菌的感染、肥胖、吸烟等。此外,胃癌的发生还与患者的基因和生活环境相关。我国是胃癌的高发国家,由于胃癌早期筛查尚不普及,因此我国胃癌患者往往发现时已进入中晚期。早期胃癌经内镜下或外科手术切除预后较好,而中晚期胃癌由于肿瘤的浸润、转移,手术效果往往不佳,需要联合化疗,提高手术的成功率,延长患者术后生存时间。德国外科医生Siewert在1999年提出食管胃交界部腺癌这一概念,并把胃癌分为食管胃交界部腺癌和非贲门区腺癌,两者在病因、临床病理学特征和预后等方面均有明显不同。在过去的十几年中,虽然全球的胃癌发病率逐渐下降,食管胃交界部腺癌的发生率却不降反增。我国是胃癌的高发地区,由于我国的胃镜筛查覆盖患者还比较少,大多数患者均在出现明显的胃灼热、上腹痛和进食哽噎等临床症状后才就诊。此时胃癌已经发展至中晚期,手术难度较大且容易复发,通常需要联合化疗或者放疗进行肿瘤的综合治疗。因此,研究影响胃癌增殖、侵袭和转移的分子机制,寻找胃癌的化疗靶点,有利于提高胃癌治疗效果和患者的预后,减轻患者的痛苦与负担。Ⅰ型胶原蛋白（COL1A1）是一种细胞外基质中起连接作用的关键结构蛋白,之前的研究发现COL1A1在成骨过程和骨质疏松中发挥作用,最近文章提出COL1A1与多种恶性肿瘤的发生相关联,可能参与调节肿瘤的增殖、迁移等过程。钙库操纵钙内流(store-operated Ca2+entry,SOCE)是最常见的维持细胞内Ca2+稳态的方式之一,其通过细胞膜表面的钙释放激活Ca2+通道家族蛋白(Ca2+-releaseactivated Ca2+channel protein,Orai)形成Ca2+进入细胞的离子通道,内质网/肌浆网上的基质相互作用分子（Stromal-interacting molecule,STIM）感受Ca2+内流并调节Orai蛋白的活性,从而实现调节细胞内Ca2+浓度的功能。众所周知,Ca2+本身作为第二信使参与调节细胞的收缩、胞吐、基因表达以及增殖等过程,并能够激活多种下游信号通路实现各种生理功能。SOCE信号通路已经被发现参与多种肿瘤细胞的增殖和迁移过程。但其在胃癌中是否参与细胞的增殖和迁移尚不清楚。STIM蛋白质家族是一种位于内质网的蛋白,可以感知内质网腔中钙浓度的变化。在多种细胞内,STIM1和STIM2都是调节内环境钙离子水平稳定的必需蛋白质。Orai蛋白分布在细胞的细胞质膜中,当内质网内存储的钙离子减少时可以被激活控制钙离子从细胞外进入细胞质内。有研究发现Orai1和STIM1蛋白在多种癌症中的过度表达,如:宫颈癌、肝癌以及胶质瘤。且Orai1和STIM1蛋白的表达水平与肿瘤患者的术后生存时间相关。肝细胞核因子4α（Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF 4α）是一种在肝脏中参与调节细胞糖、脂质代谢、上皮细胞分化和上皮细胞间连接的转录因子。之前的研究已经发现其可以通过影响细胞中STIM1蛋白的表达来调节细胞中的钙库操纵钙内流。此外,肝细胞核因子4α还在腺、肾脏、胃和肠道的上皮中广泛表达。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指上皮细胞在受到外来信号分子的刺激或者内内源性基因的选择表达后,发生细胞骨架的重构和细胞功能的改变,从而转变成具有间质细胞特点的过程。上皮间质转化已经被发现参与包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌和胃癌等多种恶性肿瘤的侵袭和转移。当细胞发生上皮间质转化后,其表达的上皮细胞特征蛋白会减少,如:E-cadherin。而表达的间质细胞特征蛋白会增多,如:N-cadherin、vinmentin和STAT3/Snai。同时,发生上皮间质转化的细胞迁移运动的能力增强,相邻细胞的连接更加松散,因此容易随血液、淋巴液向远端转移。本研究将从以下方面阐明COL1A1影响胃癌患者预后和胃癌细胞增殖、迁徙和上皮间质转化:（1）通过生物信息学,分析了胃癌患者的基因芯片,然后分析基因表达的蛋白质间的相互作用,筛选出在胃癌中可能发生改变的基因。接着对胃癌患者进行生存分析,找出影响患者术后生存时间的基因;（2）对胃癌组织进行免疫组织化学染色,比较肿瘤组织与癌旁组织中COL1A1蛋白、STIM1蛋白和HNF 4α蛋白的表达水平差异;（3）选择人胃癌细胞株SGC7901,通过si RNA转染抑制COL1A1蛋白的表达,通过细胞增殖实验、免疫印迹实验分析COL1A1蛋白对SGC7901细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化过程的影响;（4）选择人胃癌细胞株SGC7901,使用BTP2或转染Orai1 si RNA抑制钙库操纵钙内流,通过钙成像、免疫印迹实验分析钙库操纵钙内流对SGC7901细胞COL1A1蛋白的表达和上皮间质转化的影响。（5）选择人胃癌细胞株SGC7901,通过si RNA转染抑制HNF4α蛋白的表达,通过钙成像、免疫印迹实验分析HNF 4α蛋白对SGC7901细胞钙库操纵钙内流和上皮间质转化的影响。通过本课题研究,可以分析COL1A1蛋白对胃癌细胞功能的影响以及其上下游信号通路,并在未来给胃癌的非手术治疗提供新的靶点和思路。本课题研究发现:胃癌组织中明显上调的基因有COL1A1和SPP1,在胃癌术后患者中,COL1A1高表达组术后生存时间明显短于COL1A1低表达组,SPP1高表达与低表达组之间的术后生存时间没有明显差异。并且胃癌组织中COL1A1蛋白、STIM1蛋白和HNF 4α蛋白水平明显高于正常组织和癌旁组织。接着,在胃癌SGC7901细胞株中发现COL1A1蛋白可以影响细胞的增殖和上皮间质转化。并且在胃癌SGC7901细胞株中,钙库操纵钙内流通路可以被钙库操纵钙内流抑制剂BTP2和Orai1 siRNA抑制,提示该细胞内存在钙库操纵钙内流通路。在SGC7901细胞中,钙库操纵钙内流可以调节COL1A1蛋白的表达水平,并且影响SGC7901细胞的增殖、侵袭和转移能力。最后,HNF 4α可以调节SGC7901细胞中钙库操纵钙内流和STIM1蛋白的表达以及细胞的上皮间质转化过程,并且PI3K/Akt、钙调蛋白和NFκB可能参与其中。综上所述,本课题研究得出结论:COL1A1基因在胃癌组织中上调,COL1A1蛋白在胃癌组织中表达升高,其表达水平越高,胃癌患者的预后越差。钙库操纵钙内流可以调节COL1A1蛋白的表达水平和SGC7901细胞增殖和侵袭转移能力,并且这一过程受到HNF 4α蛋白的调控。
解广东[10]（2020）在《四虫片对胃癌细胞生物学行为及瘀毒交阻型胃癌术后患者的影响和网络药理学研究》文中研究指明目的探讨中药四虫片对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其作用机制,观察四虫片对瘀毒交阻型胃癌术后患者的临床疗效,并进一步通过网络药理学方法分析四虫片治疗胃癌的潜在分子生物学机制。方法1.实验研究:采用CCK-8法检测不同浓度（0μg/ml～500μg/ml）四虫片作用48h时,对人胃癌AGS和MKN45细胞增殖的影响,计算增殖抑制率和IC50值;选用合适的四虫片浓度,并设定对照组,采用CCK-8法和克隆形成实验检测四虫片对胃癌细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,划痕实验和Transwell小室法检测细胞的迁移和侵袭能力,Western blot法检测四虫片对凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、C-Caspase 3、α-tubulin的表达水平及AKT/Cyclin D1细胞信号通路的影响,采用明胶酶谱法检测四虫片对MMP9活性的影响。2.临床研究:纳入64例瘀毒交阻型胃癌术后患者随机分为治疗组和对照组,对照组给予OLF化疗方案进行化疗,治疗组在此基础上给予四虫片口服,观察3个化疗周期,对比两组治疗前后在中医症状评分、卡氏评分（KPS）、淋巴细胞亚群、肿瘤标志物水平、循环肿瘤细胞（CTC）数量及化疗不良反应方面的差异,随访患者,观察两组患者在无病生存期（DFS）方面的差异,并对结果进行统计分析。3.网络药理学研究:从中国知网（CNKI）、中国生物医学文献（CBM）、维普、万方、Pub Med、Coremine数据库中检索四虫片中全蝎、蜈蚣、土鳖虫、地龙的所有化学成分,再通过CNKI、CBM、TCMSP、TCM Database@Taiwan、CTD数据库检索化学成分所对应的靶点,通过CNKI、CBM、Pub Med、Gene Cards、OMIM数据库检索与胃癌治疗相关的靶点,筛选共同作用靶点,利用Cytoscape构建成分-靶点-疾病网络,利用String数据库构建蛋白-蛋白作用网络,利用Cyto NCA插件对核心靶点进行网络拓扑分析,利用R程序包对核心靶点进行功能（GO）富集分析,利用Clue GO插件进行KEGG通路富集分析。结果1.实验研究:随着四虫片作用浓度的增加,胃癌AGS和MKN45细胞的增殖抑制率逐渐升高,在作用48h时,AGS和MKN45细胞的IC50值分别为240μg/ml和200μg/ml,研究选用80μg/ml作为四虫片组药物作用浓度进行后续实验;在细胞增殖实验中,四虫片组在48h、72h时对AGS和MKN45细胞的抑制水平均显着高于对照组（P<0.05）,并呈时间依赖性,同时四虫片显着减弱了胃癌AGS和MKN45细胞的克隆形成能力（P<0.05）;在细胞凋亡研究中,四虫片组AGS和MKN45细胞的凋亡比例分别为（23.44±1.2）%和（24.76±2.1）%,均显着高于对照组中的凋亡比例（4.03±0.23）%和（4.63±0.31）%;与对照组相比,四虫片组AGS和MKN45细胞的凋亡相关蛋白Bcl2、C-Caspase 3表达显着降低,Bax表达及Bax/Bcl2比值显着升高（P<0.05）;在划痕实验中,四虫片组胃癌AGS和MKN45细胞愈合面积比例显着低于对照组P<0.05);在Transwell实验中,四虫片组胃癌AGS和MKN45细胞的迁移和侵袭细胞数量均显着少于对照组（P<0.05）,且迁移及侵袭相关蛋白MMP9的活性显着低于对照组（P<0.05）;在细胞信号通路检测中,与对照组相比,四虫片组显着降低了AGS和MKN45细胞的AKT磷酸化水平以及下游效应子Cyclin D1的表达水平。2.临床研究:有效评价患者共61例,治疗组30例,对照组31例。在中医症状评分方面,治疗组在治疗后的总评分显着低于对照组,其中治疗组显效6例,有效19例,对照组显效4例,有效12例,治疗组有效率显着高于对照组（P<0.05）;治疗组KPS改善19例,稳定6例,对照组改善10例,稳定13例,治疗组KPS改善情况明显优于对照组（P<0.05）;治疗组在治疗后CD4+T、CD4+/CD8+值、NK细胞的比例均明显高于对照组（P<0.05）,在治疗后CEA、CA19-9、CA125、CA72-4的水平均明显低于对照组（P<0.05）;治疗后,两组间CTC数量无显着性差异（P>0.05）;治疗组化疗不良反应的发生例数显着少于对照组（P<0.05）;在随访周期内,治疗组DFS时间为（15.33±5.78）月,对照组DFS时间为（12.48±4.97）月,治疗组明显长于对照组（P<0.05）。3.网络药理学研究:经检索得到四虫片200种活性成分,499个药物潜在靶点,四虫片中活性成分主要有Adenosine、4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid、Uridine、alanine、Bm K M1 neurotoxin、Phenol、5,8,11,14-Eicosatetraenamide、Batyl alcohol、hypoxanthine、Dihydrocapsaicin等能够发挥治疗胃癌的功效;在疾病数据库中检索并筛选共得到胃癌相关的1227个靶点,取交集得到共同作用靶点155个,应用网络拓扑分析筛选出152个核心靶点,主要涉及NTRK1、TP53、EGFR、CUL3、XPO1、ESR1、MCM2、UBC、FN1、HSP90AA1等,GO富集分析得到157条功能区域,其中基因富集数量>10的功能有28条,主要包括细胞粘附、mRNA的转录、DNA的结合、蛋白的合成及转运等,KEGG富集得到75条信号通路,富集基因数量>10的功能有39条,主要涉及到病毒致癌信号通路、肿瘤的信号通路、肿瘤转录失调信号通路、细胞周期信号通路、PI3K-Akt信号通路、泛素介导的蛋白水解信号通路等。结论1.四虫片能（1）显着抑制人胃癌AGS和MKN45细胞的增殖,并与作用浓度、时间相关,（2）诱导人胃癌AGS和MKN45细胞的凋亡,其可能机制是通过下调Bcl2及上调Bax、C-Caspase 3等凋亡相关蛋白的表达来实现的,（3）抑制人胃癌AGS和MKN45细胞迁移和侵袭,其机制可能与抑制迁移及侵袭相关蛋白MMP9的活性有关,（4）引起AKT磷酸化水平降低以及下游效应因子Cyclin D1的表达降低,并可能通过这种机制影响胃癌细胞的生物学行为。2.在3个月的治疗周期内,四虫片能显着改善瘀毒交阻型胃癌术后患者的中医症状、生活质量、机体淋巴细胞亚群,降低患者的肿瘤标志物水平,减少化疗不良反应的发生等,在随访周期内,能明显延长患者的DFS。3.四虫片是通过多靶点、多途径、相互协调、相互影响来治疗胃癌的,主要活性成分通过干预细胞粘附、mRNA的转录、DNA的结合、蛋白的合成及转运等功能发挥抗肿瘤功能,并通过影响细胞周期类信号通路等发挥对胃癌的治疗作用,主要涉及病毒致癌信号通路、肿瘤的信号通路、肿瘤转录失调信号通路、细胞周期信号通路、PI3K-Akt信号通路、泛素介导的蛋白水解信号通路、乙型肝炎信号通路、酒精依赖信号通路、人乳头瘤病毒感染信号通路、MAPK信号通路、丙型肝炎信号通路、肿瘤Micro RNA信号通路、肿瘤蛋白聚糖信号通路等,充分体现了四虫片在治疗胃癌中的整体性和系统性特点。
二、胃癌细胞株化疗药物相互作用的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胃癌细胞株化疗药物相互作用的实验研究（论文提纲范文）
（1）EZH2表达调控对胃癌生长及化疗敏感性的影响（论文提纲范文）
| 英文略缩词 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 EZH2 基因在胃癌组织和胃癌细胞的表达 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 慢病毒介导沉默EZH2 基因稳转细胞株的构建和鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 EZH2 基因沉默对胃癌生长和化疗敏感性的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部份EZH2 基因对人胃癌细胞生长及耐药性的相关机制探讨 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 问题和展望 |
| 参考文献 |
| 综述 EZH2基因与胃癌相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）基于整合大数据的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌上市后评价研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 复方苦参注射液治疗胃癌的研究进展 |
| 综述二 复方苦参注射液治疗食管癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌临床评价研究 |
| 第一节 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗胃癌临床评价研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗食管癌临床评价研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌作用机制研究 |
| 第一节 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗胃癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 基于整合高通量数据分析的食管癌关键基因研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗食管癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌相关作用机制实验研究 |
| 第一节 复方苦参注射液干预胃癌细胞实验研究 |
| 1 仪器与器材 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 基于蛋白组学的复方苦参注射液治疗胃癌作用机制研究 |
| 1 仪器与器材 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 复方苦参注射液干预食管癌细胞实验研究 |
| 1 仪器与器材 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞自噬性死亡 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 一 熊果酸抗肿瘤机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 二 自噬在胃癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）双硫仑联合铜通过调控应激反应与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞生长（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胃癌的研究进展 |
| 1.1.1 胃癌的治疗现状 |
| 1.1.2 应激反应与Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中的作用 |
| 1.2 双硫仑的研究进展 |
| 1.2.1 双硫仑的抗肿瘤作用 |
| 1.2.2 双硫仑联合铜的抗肿瘤作用 |
| 1.3 本文的研究内容与目标 |
| 第二章 双硫仑联合铜对人胃癌细胞的体外作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 实验药物 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 实验相关抗体 |
| 2.1.7 相关液体的配置及保存方式 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 CCK-8细胞增殖(活力)检测 |
| 2.2.3 细胞克隆形成检测 |
| 2.2.4 细胞划痕实验 |
| 2.2.5 细胞Transwell迁移实验 |
| 2.2.6 细胞凋亡检测 |
| 2.2.7 细胞自噬检测 |
| 2.2.8 活性氧的检测 |
| 2.2.9 免疫印迹法检测凋亡、自噬、DNA损伤修复及Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白表达 |
| 2.2.10 糖酵解和线粒体呼吸的检测 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 双硫仑联合铜对胃癌细胞增殖活性的作用 |
| 2.3.2 双硫仑联合铜抑制胃癌细胞克隆形成 |
| 2.3.3 双硫仑联合铜对胃癌细胞划痕愈合能力的作用 |
| 2.3.4 双硫仑联合铜对胃癌细胞中的侵袭效应 |
| 2.3.5 双硫仑联合铜对胃癌细胞凋亡效应的调控 |
| 2.3.6 双硫仑联合铜对胃癌细胞自噬的影响 |
| 2.3.7 双硫仑联合铜对胃癌细胞氧化应激和DNA损伤的影响 |
| 2.3.8 双硫仑联合铜对胃癌细胞能量代谢的影响 |
| 2.3.9 双硫仑联合铜对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 2.4 实验小结 |
| 第三章 双硫仑联合铜对人胃癌细胞的体内作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验相关仪器 |
| 3.1.4 实验相关抗体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胃癌皮下移植瘤的建立及药物干预 |
| 3.2.2 苏木精-伊红染色 |
| 3.2.3 Tunel染色 |
| 3.2.4 免疫组化染色 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 双硫仑联合铜对胃癌皮下移植瘤的生长抑制效应 |
| 3.3.2 双硫仑联合铜对胃癌皮下移植瘤凋亡和自噬效应 |
| 3.3.3 双硫仑联合铜对裸鼠胃癌皮下移植瘤中应激反应与Wnt/β-catenin通路的影响 |
| 3.4 实验小结 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附 缩略词简表 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 缩略词表 |
| 第一章:基于分子对接虚拟筛选归芪白术方中可与胃癌治疗靶点结合的小分子成分 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验软件和数据库 |
| 1.1.2 主要试剂、仪器 |
| 1.1.3 胃癌靶向治疗靶点筛选 |
| 1.1.4 归芪白术方中药小分子结构库构建及类药性分析 |
| 1.1.5 靶蛋白活性位点 |
| 1.1.6 分子对接 |
| 1.1.7 微量热泳动实验测定虚拟筛选获得成分与靶蛋白的亲和力 |
| 1.1.8 分子动力学模拟和结合自由能计算 |
| 1.1.9 靶向成分的毒性预测 |
| 1.1.10 靶向HER2的小分子成分对HER2激酶活性的检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 胃癌治疗靶点筛选 |
| 1.2.2 归芪白术方小分子成分类药性分析 |
| 1.2.3 靶蛋白晶体结构确定 |
| 1.2.4 分子对接 |
| 1.2.5 MST测定虚拟筛选获得小分子成分与靶蛋白的亲和力 |
| 1.2.6 分子动力学模拟和结合自由能计算结果 |
| 1.2.7 代表性成分quercetin、daidzein、formononetin和 isorhamnetin毒性预测 |
| 1.2.8 Quercetin和daidzein对HER2激酶活性影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 HER2与PD-L1在胃癌表达的相关性分析 |
| 1.3.2 归芪白术方治疗胃癌的物质基础分析 |
| 1.3.3 分子对接-MST-分子动力学模拟-HER2激酶活性检测结果分析 |
| 1.4 小结 |
| 第二章:归芪白术方代表性中药小分子成分对胃癌细胞和T淋巴细胞的作用及机制 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 试剂与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein抗胃癌细胞增殖实验 |
| 2.2.2 胃癌细胞株的选择 |
| 2.2.3 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对胃癌细胞的干预作用 |
| 2.2.4 人外周血T淋巴细胞的分离与活化 |
| 2.2.5 抑制PD-L1的代表性成分formononetin和isorhamnetin对PD-L1干预T细胞的作用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对不同胃癌细胞的抗增殖作用 |
| 2.3.2 胃癌细胞株的选择 |
| 2.3.3 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对胃癌MKN-45细胞干预作用 |
| 2.3.4 T淋巴细胞的分离与活化 |
| 2.3.5 PD-L1刺激T淋巴细胞及干预实验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 靶向HER2的代表性成分quercettin、daidzein抑制胃癌细胞增殖结果分析 |
| 2.4.2 代表性成分Formononetin、isorhamnetin对T淋巴细胞活性的恢复作用 |
| 2.4.3 健脾扶正、化瘀祛邪治疗胃癌的中医认识 |
| 2.5 小结 |
| 第三章:归芪白术方体外有效的代表性中药小分子对胃癌细胞和T淋巴细胞共培养体系的调节作用 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胃癌MKN-45和T淋巴细胞共培养体系构建 |
| 3.2.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预T淋巴细胞与胃癌MKN-45 细胞共培养体系 |
| 3.2.3 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后细胞形态学观察和T淋巴细胞、胃癌MKN-45 细胞增殖情况 |
| 3.2.4 流式细胞术检测体外有效的代表性成分quercetin和 formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞和胃癌MKN-45 细胞凋亡情况 |
| 3.2.5 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞PD-1 表达情况 |
| 3.2.6 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后细胞上清液中细胞因子表达情况 |
| 3.2.7 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞和胃癌MKN-45 细胞相关蛋白表达情况 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌MKN-45细胞与T淋巴细胞共培养体系的建立 |
| 3.3.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 胃癌MKN-45 细胞与T淋巴细胞共培养体系构建结果分析 |
| 3.4.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系结果分析 |
| 3.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 论文综述 HER2、PD-L1生物学特性及在胃癌的相关性和应用研究 |
| 参考文献 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）FXa通过GOSR1/ROS/bcl-2信号轴调控胃癌失巢凋亡抵抗的相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 FXa在胃癌中的表达及预后 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 通过TCGA数据库得出FXa作为与肿瘤预后相关的凝血基因 |
| 2.3.2 生信分析得出 FXa 在胃癌中的表达和预后结果 |
| 2.3.3 FXa在胃癌组织中的表达及预后分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 FXa对胃癌细胞失巢凋亡抵抗的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 贴壁状态下FXa在胃癌细胞系中的表达 |
| 3.3.2 验证胃癌细胞 MKN45 和 NCI-N87 悬浮状态下的表达情况 |
| 3.3.3 慢病毒转染以及过表达情况 |
| 3.3.4 FXa 在过表达细胞系悬浮后蛋白表达水平 |
| 3.3.5 FXa 对胃癌细胞凋亡率的影响 |
| 3.3.6 FXa 调控胃癌细胞浸润表型 |
| 3.3.7 FXa 调控胃癌细胞迁移表型 |
| 3.3.8 FXa 调控胃癌细胞增殖表型 |
| 3.3.9 FXa 在胃癌细胞失巢凋亡抵抗中 bcl-2、caspase-3、caspase-7 蛋白的变化 |
| 3.3.10 FXa 通过 LDH 调控胃癌细胞的失巢凋亡 |
| 3.3.11 FXa 通过 ROS 调控胃癌细胞的失巢凋亡 |
| 3.3.12 FXa 通过 PDK 调控胃癌细胞的失巢凋亡 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 FXa 通过 GOSR1 调控胃癌浸润转移机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 FXa 调控胃癌细胞失巢凋亡抵抗蛋白质谱结果 |
| 4.3.2 贴壁状态下 GOSR1 在胃细胞系中的表达 |
| 4.3.3 GOSR1在MKN45和NCI-N87 细胞不同悬浮状态下的表达情况 |
| 4.3.4 质粒转染以及 GOSR1 表达情况 |
| 4.3.5 GOSR1 对胃癌细胞凋亡率的影响 |
| 4.3.6 GOSR1 对胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.3.7 GOSR1 对胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 4.3.8 GOSR1 在胃癌细胞失巢凋亡抵抗中抗凋亡关蛋白 bcl-2 蛋白的变化 |
| 4.3.9 GOSR1 通过ROS调控胃癌细胞的失巢凋亡 |
| 4.3.10 GOSR1 通过LDH调控胃癌细胞的失巢凋亡 |
| 4.3.11 GOSR1 通过PDK调控胃癌细胞的失巢凋亡 |
| 4.3.12 GOSR1 与 FXa 在胃癌细胞系中的调控关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 体内验证 FXa 在胃癌中的调控作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 构建FXa及 GOSR1 调控体内胃癌细胞MKN45 皮下成瘤模型 |
| 5.3.2 体内验证 FXa 及 GOSR1 调控 bcl-2 的表达量 |
| 5.3.3 检测荷瘤组织中 ROS 的表达量 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 癌症与凝血 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）新型UBE2T抑制剂通过阻止RACK1泛素化抑制Wnt/β-catenin信号通路激活及胃癌生长（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略语对照 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 Wnt/β-catenin信号通路异常激活及抑制剂在胃癌中的作用 |
| 1.研究材料和方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 经典Wnt/β-catenin信号通路异常激活参与胃癌的发生发展 |
| 2.2 目前临床前或临床研究中Wnt抑制剂对胃癌的作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin破坏复合物组分胃癌新靶点的筛选及验证 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 Wnt/β-catenin信号通路中β-Catenin破坏复合物关键组分在胃癌中的作用 |
| 2.2 β-Catenin破坏复合物稳定蛋白RACK1与β-Catenin表达水平相关性 |
| 2.3 敲除RACK1 促进胃癌细胞生长增殖能力 |
| 2.4 胃癌中β-Catenin破坏复合物关键调控成分RACK1 的降解途径 |
| 2.5 UBE2T与RACK1相互作用并介导RACK1泛素化修饰 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 UBE2T通过泛素化降解RACK1 激活Wnt/β-catenin信号通路的机制研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 泛素结合酶UBE2T介导RACK1 的泛素化降解不依赖泛素连接酶E3 |
| 2.2 RACK1 泛素化的具体赖氨酸位点鉴定 |
| 2.3 基于UBE2T-RACK1-β-catenin轴激活Wnt/β-catenin信号通路 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 泛素结合酶UBE2T在胃癌中的表达及对胃癌细胞功能的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 生物信息数据库中UBE2T在胃癌组织及多种癌症中的表达情况 |
| 2.2 UBE2T在胃癌临床样本中表达情况及与临床病理、患者生存预后的相关性 |
| 2.3 CRISPR/Cas9 技术敲除UBE2T抑制胃癌细胞增殖能力 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 UBE2T抑制剂的筛选及其对胃癌细胞生长增殖的抑制作用 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 泛素结合酶UBE2T小分子抑制剂的筛选 |
| 2.2 UBE2T小分子抑制剂M435-1279 通过阻碍β-catenin入核而抑制胃癌进展 |
| 2.3 小分子抑制剂M435-1279 对胃癌细胞生长及侵袭能力的影响 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述 人泛素偶联酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 1.2.2 可变剪接与肿瘤治疗 |
| 1.2.3 凋亡因子Mcl-1可变剪接与肿瘤 |
| 1.2.4 空间阻滞寡核苷酸应用现状 |
| 1.2.5 小结 |
| 1.3 主要研究内容与研究方案 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 Mcl-1可变剪接与胃癌的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器和设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 实验对象 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Mcl-1表达与胃癌的相关性 |
| 2.3.2 Mcl-1 可变剪接异构体mRNA在胃癌组织中的表达 |
| 2.3.3 Mcl-1S和 Mcl-1L mRNA表达与胃癌临床进展的相关性 |
| 2.3.4 胃癌组织Mcl-1L与 Mcl-1S表达的蛋白水平验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验仪器和设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 实验对象 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌细胞株 Mcl-1L 及 Mcl-1S 基础表达 |
| 3.3.2 空间阻滞寡合苷酸(SBOs)转染效率评价 |
| 3.3.3 SBOs 对 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 3.3.4 SBOs对胃癌细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.3.5 SBOs对胃癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导凋亡的体内实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验仪器和设备 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 研究对象 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 SBOs对裸鼠的毒性反应 |
| 4.3.2 SBOs 治疗对移植瘤体 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 4.3.3 SBOs 治疗对移植瘤体细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.3.4 SBOs 对移植瘤增殖生长的抑制作用 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）钙库操纵钙内流通过调节COL1A1蛋白对胃癌细胞增殖和上皮间质转化的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩写词对照表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 细胞 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 仪器与设备 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 细胞制备与培养 |
| 3.2 实验溶液配制 |
| 3.3 免疫印记实验(Western Blot)检测蛋白的表达水平 |
| 3.4 免疫组织化学染色 |
| 3.5 细胞活性检测(CCK8) |
| 3.6 细胞钙成像 |
| 3.7 基因芯片数据分析 |
| 3.8 生存分析 |
| 3.9 数据处理 |
| 4.结果 |
| 4.1 人胃癌组织的差异基因表达(Differential gene expression,DEGs)及蛋白质间相互作用(Protein-protein interaction,PPI)分析 |
| 4.2 COL1A1和SPP1 基因表达水平与胃癌患者的生存时间的关系 |
| 4.3 COL1A1蛋白在食管胃交界部腺癌组织中表达增加 |
| 4.4 STIM1 蛋白和Orai1 蛋白在食管胃交界部腺癌组织中表达增加 |
| 4.5 HNF4α蛋白在食管胃交界部腺癌组织中表达增加 |
| 4.6 COL1A1 蛋白在SGC7901 细胞迁移、侵袭和上皮间质转化中的作用 |
| 4.7 钙库操纵钙内流对SGC7901 细胞中COL1A1 蛋白表达和上皮间质转化的影响 |
| 4.8 HNF4α对 SGC7901 细胞中钙库操纵钙内流和上皮间质转化的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述:钙信号与癌症的增殖和转移 |
| 参考文献 |
（10）四虫片对胃癌细胞生物学行为及瘀毒交阻型胃癌术后患者的影响和网络药理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 胃癌的中医学研究概述 |
| 第二节 中医药治疗胃癌的实验研究进展 |
| 第三节 四虫片治疗胃癌的药理及优势分析 |
| 第四节 网络药理学在中医药领域的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 四虫片IC50 值的确定 |
| 2.2 四虫片对胃癌细胞增殖的影响 |
| 2.3 四虫片对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 2.4 四虫片对胃癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 2.5 四虫片对AKT/Cyclin D1 信号通路的影响 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三章 临床研究 |
| 1.临床资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 样本量估算 |
| 1.3 研究方案技术路线图 |
| 1.4 诊断标准 |
| 1.5 病例筛选 |
| 2.研究方法 |
| 2.1 分组 |
| 2.2 治疗药物 |
| 2.3 化疗方案 |
| 2.4 治疗方案 |
| 2.5 合并用药及辅助治疗 |
| 2.6 观察指标 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 入组完成情况 |
| 3.2 基线资料的比较 |
| 3.3 中医症状评分 |
| 3.4 KPS评分 |
| 3.5 淋巴细胞亚群的比较 |
| 3.6 肿瘤标志物的比较 |
| 3.7 两组治疗前后CTC数量的比较 |
| 3.8 两组不良反应发生情况的比较 |
| 3.9 两组DFS的比较 |
| 4.讨论 |
| 第四章 网络药理学研究 |
| 1.研究目的 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第五章 结论 |
| 1.论文结论 |
| 2.创新点 |
| 3.不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 发表论文 |
四、胃癌细胞株化疗药物相互作用的实验研究（论文参考文献）
- [1]EZH2表达调控对胃癌生长及化疗敏感性的影响[D]. 杨宝玉. 福建医科大学, 2021(02)
- [2]基于整合大数据的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌上市后评价研究[D]. 周唯. 北京中医药大学, 2021(02)
- [3]基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的机制研究[D]. 陈伟妍. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [4]双硫仑联合铜通过调控应激反应与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞生长[D]. 王玲. 兰州大学, 2021(09)
- [5]基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响[D]. 李玲. 甘肃中医药大学, 2021(01)
- [6]FXa通过GOSR1/ROS/bcl-2信号轴调控胃癌失巢凋亡抵抗的相关研究[D]. 王登峰. 兰州大学, 2021(09)
- [7]新型UBE2T抑制剂通过阻止RACK1泛素化抑制Wnt/β-catenin信号通路激活及胃癌生长[D]. 俞泽元. 兰州大学, 2021(09)
- [8]空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究[D]. 李永红. 兰州大学, 2020(04)
- [9]钙库操纵钙内流通过调节COL1A1蛋白对胃癌细胞增殖和上皮间质转化的影响[D]. 韩文秀. 安徽医科大学, 2020(04)
- [10]四虫片对胃癌细胞生物学行为及瘀毒交阻型胃癌术后患者的影响和网络药理学研究[D]. 解广东. 山东中医药大学, 2020