一、新生大鼠同种心脏移植免疫耐受的实验研究（论文文献综述）
叶书林[1]（2021）在《木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究》文中指出目的:同种异体器官移植是治疗终末器官衰竭的有效手段。为了维持移植物在受者体内的存活,往往需要长期服用免疫抑制剂。一方面,术后器官排斥反应因免疫抑制剂的使用得以降低;另一方面长期应用免疫抑制剂的不良反应严重影响移植物和移植患者的存活,是移植免疫学和临床医学研究亟待解决的一大难题。中药免疫调节相关的基础研究和临床研究取得许多新的进展,从中药中寻求高效、低毒的免疫抑制剂是当今移植免疫学领域的研究方向之一。木犀草素是一种黄酮类化合物,研究表明木犀草素具有许多药理作用,如抗炎、抗肿瘤、抗氧化和神经保护等。在免疫调节作用方面的研究中发现木犀草素可以抑制小鼠T细胞的增殖和活化,下调IFN-γ、IL-6、IL-5等细胞因子的表达,具有免疫抑制作用。此外,还可以通过诱导CD4+CD25T淋巴细胞向CD4+CD25+调节性T细胞分化来减轻气道炎症。然而,目前木犀草素对于同种异体器官移植排斥反应方面的作用研究仍为空白。由于皮肤上抗原呈递细胞很多,排斥反应比其他器官移植更强,若药物能抑制皮肤排斥反应,则更能抑制其他器官移植排斥。因此,本实验首先通过小鼠同种异体皮肤移植模型探讨木犀草素对移植排斥反应的作用,再以同种异体胰岛移植模型进行验证,研究木犀草素对小鼠同种异体器官排斥反应的作用,以及其免疫调节的作用机制。方法:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究建立小鼠皮肤移植模型,以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植皮片生存时间的影响,用中位存活时间（Mediansurvival time,MST）表示;移植10天后,取移植皮片检测炎症细胞浸润、CD3、Foxp3及相关细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17a、Foxp3基因的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和外周引流淋巴结检测CD4+CD44high CD62Llow 和 CD8+CD44high CD62Llow 效应 T 细胞、CD4+Foxp3+调节性 T细胞、CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟树突状细胞的比例。木犀草素联合应用Anti-CD25删除小鼠体内Treg对小鼠皮肤移植反应的实验研究,分为四组:同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）、木犀草素高剂量联合同型对照组（Lut-H+Isotype,木犀草素50mg/kg灌胃联合Isotype抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,以及木犀草素高剂量联合Anti-CD25抗体组（Lut-H+PC61,木犀草素50mg/kg灌胃联合PC61抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,观察移植皮片生存时间,同时检测移植10天后脾脏和淋巴结中CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟DC的比例。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究以BALB/c小鼠胰岛细胞为供体,移植到STZ诱导的糖尿病C57BL/6小鼠肾包膜下,建立小鼠同种异体胰岛移植模型。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体胰岛移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植后血糖的影响,用中位存活时间（Median survival time,MST）表示;移植10天后,取胰岛移植物检测胰岛素、炎症细胞浸润及CD3+T的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和引流淋巴结通过流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验流式细胞术分选CD3+T淋巴细胞,采用CCK-8法检测木犀草素对体外CD3+T细胞的细胞毒性,CFSE法检测木犀草素对体外CD3+T淋巴细胞增殖的影响,ELISA检测CD3+T细胞上清液中细胞因子IFN-y、IL-10和IL-17a蛋白的表达水平,流式细胞术分选CD4+CD25-T,检测木犀草素干预后对CD4+CD25+Treg的分化情况,Western Blotting检测木犀草素干预后CD3+T细胞中AKT/mTOR信号通路的蛋白表达。结果:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素低剂量组和高剂量组均能延长移植皮片的存活时间[MST=23.50±5.34（Lut-low）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.05;MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.01]。此外,与雷帕霉素组比较,木犀草素高剂量组在延长皮肤移植物存活率的作用差异无统计学意义（MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.35.00±6.70（Rapa）,P>0.05）。（2）在移植皮片中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均能改善炎症细胞浸润,抑制CD3+T淋巴细胞浸润,上调Foxp3的表达,同时抑制促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17amRNA的表达,上调IL-10和Foxp3mRNA的表达。（3）在受体小鼠淋巴器官脾脏和淋巴结中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均可显着降低CD4+CD44highCD62Llow和CD8+CD44highCD62Llow 效应 T 细胞以及 CD11c+CD86+和 CD11c+CD80+成熟 DC 的比例,同时显着增加引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例（P<0.05或P<0.01）。（4）在应用Anti-CD25抗体删除Treg后,可逆转木犀草素延长移植皮片生存时间的作用,同时逆转对成熟DC的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素可延长移植术后胰岛的存活时间。（2）在胰岛移植区域,与对照组相比,木犀草素可减轻炎症细胞浸润。（3）在受体小鼠周围淋巴器官中,与对照组相比,木犀草素可上调移植后引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验（1）不同浓度的木犀草素（1.25、2.5、5、10和20μM）给药48h和96h后,仅20μM浓度木犀草素对T细胞有活力有明显抑制作用（P<0.01）。（2）在T细胞增殖实验中,与对照组相比,木犀草素低浓度（Lut-low,2.5μM）和木犀草素高浓度（Lut-high,5μM）组与雷帕霉素组（Rapa,0.1μM）一样,均能显着抑制T细胞的增殖（P<0.01）。（3）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能显着抑制CD3+T细胞上清液中IFN-y和IL-17a的蛋白水平（P<0.01）,并上调IL-10蛋白的表达水平（P<0.05或P<0.01）。（4）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能明显促使CD4+CD25-T细胞向CD4+Foxp3+Treg分化（P<0.01）。（5）木犀草素（无论低浓度还是高浓度）能有效抑制P-p70S6K、P-mTOR和P-AKT蛋白的表达（P<0.01）,而雷帕霉素组对P-AKT蛋白的表达无明显作用（P>0.05）。结论:我们实验结果揭示了不管是在小鼠同种异体皮肤移植模型中还是胰岛同种异体移植模型中,木犀草素均可显着延长移植物的存活时间,提示木犀草素可抑制同种异体器官移植排斥反应,其潜在的作用机制可能是通过抑制效应性T细胞的增殖、DCs的成熟,同时诱导CD4+Foxp3+Treg的分化,以及抑制AKT/mTOR信号通路的激活而实现的。因此,我们的研究填补了木犀草素在抑制移植反应作用方面的空白,木犀草素在自然界中来源广泛,无明显毒副作用,作为一种潜在的免疫抑制剂,具有进一步深入研究的价值。
姚仲鹏[2]（2020）在《阻断OX40/OX40L通路联合ECDI结合供体脾细胞诱导预致敏小鼠心脏移植免疫耐受》文中研究表明目的:研究阻断OX40/OX40L通路联合ECDI结合供体脾细胞（ECDI-SPs）能否协同诱导预致敏小鼠心脏移植免疫耐受,并探讨其作用机制,为临床诱导预致敏受者免疫耐受提供新的方法。方法:（1）通过皮肤移植（BALB/c→C57BL/6）使小鼠致敏,在受体小鼠致敏6周后行心脏移植建立（BALB/c→C57BL/6）预致敏小鼠心脏移植模型。（2）实验分为空白对照组、单独ECDI-SPs组、单独抗OX40L抗体组、ECDI-SPs联合抗OX40L抗体组,并设置单独IgG对照组、ECDI-SPs联合IgG对照组,共6个分组（n=5-6）。（3）根据实验分组,于受体小鼠于心脏移植术前7天、手术当天和术后第7、14天（d-7、d0、d7、d14）通过阴茎背静脉予输注1×108 ECDI-SPs;在心脏移植术当天至术后第10天（d0-d10）,每天腹腔注射抗OX40L抗体（0.5 mg/只）,IgG给药方法与抗OX40L抗体一致。术后每天触诊移植心脏,以移植心脏停跳定义为排斥时间点并记录移植心脏存活时间。（4）对联合处理组小鼠,即ECDI-SPs联合抗OX40L抗体组小鼠,于心脏移植术前2天、手术当天及术后第2天（d-2、d0、d2）腹腔注射抗CD25抗体（0.5mg/只）,同时使用IgG（0.5mg/只）作为对照,给药方法与抗CD25抗体一致,比较两组小鼠移植心脏存活时间和Tregs比例。（5）对ECDI-SPs联合抗OX40L抗体组小鼠,在心脏移植术后第30、100天（d30、d100）分别过继输注供体小鼠（BALB/c）预致敏和第三方供体小鼠（C3H）预致敏的受体小鼠（C57BL/6）脾脏来源的纯化T细胞（5×106;纯度>97%）,比较两组小鼠移植心脏存活时间和Tregs比例。（6）流式细胞术检测各实验组小鼠脾脏中记忆性T细胞（包括CD4+CD44+Tms,CD8+CD44+Tms）和调节性T细胞（CD4+CD25+Foxp3+Tregs）的比例。（7）体外混合淋巴细胞反应实验:提取各实验组受体小鼠脾脏CD11c+DC细胞作为刺激细胞,供体小鼠脾脏CD3+T细胞作为反应细胞,将刺激细胞以2.5×104/well密度、反应细胞以1×105/well密度进行混合培养（刺激细胞和反应细胞比例为1:4）,培养96小时后收集细胞用于检测各组小鼠T细胞增殖程度。（8）HE染色观察移植心脏病理改变情况,通过ELISA方法检测各组小鼠血清中炎症细胞因子（IFN-γ和IL-6）的水平。结果:（1）小鼠经皮肤移植预致敏后体内脾脏中Tms比例小幅升高,当行心脏移植后Tms比例显着升高,最高可达50%以上;而采用抗OX40L抗体阻断OX40/OX40L通路后可同时抑制预致敏小鼠和预致敏行心脏移植小鼠Tms的扩增。（2）与对照组相比,单独ECDI-SPs组和单独抗OX40L抗体组均可显着延长预致敏小鼠移植心脏存活时间,其平均存活时间分别约为25天和38天,而ECDI-SPs+抗OX40L抗体组可诱导66.7%预致敏小鼠移植心脏长期存活（>100天）。（3）与对照组、单独ECDI-SPs组和单独抗OX40L抗体组相比,ECDI-SPs+抗OX40L抗体组可显着减轻移植心脏病理损伤和减少炎症细胞浸润,抑制Tms扩增,抑制血清中促炎症因子IFN-γ和IL-6释放,上调脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Tregs百分比,降低外周血中抗供体抗体水平。（4）在体外MLR实验中,对照组中T细胞被DC细胞刺激后显着增殖;单独使用抗OX40L抗体组和单独使用ECDI-SPs组的T细胞的增殖水平明显低于对照组;而ECDI-SPs+抗OX40L抗体组的T细胞的增殖水平最低,直到术后第100天仍维持在低水平。（5）在ECDI-SPs+抗OX40L抗体组中,围手术期通过注射抗CD25抗体清除受体小鼠体内的Tregs可阻断已建立的移植免疫耐受;（6）在ECDI-SPs+抗OX40L抗体组中,过继输注供体来源T细胞可抑制Tregs扩增并破坏已存在的免疫耐受,而输注第三方供体来源T细胞未能打破免疫耐受,因此推测ECDI-SPs+抗OX40L抗体诱导的免疫耐受具有供体特异性。结论:阻断OX40/OX40L通路联合ECDI-SPs可通过共同诱导调节性T细胞产生和扩增、抑制记忆性T细胞分化和扩增、抑制促炎症因子的释放、降低抗供体抗体水平,从而诱导预致敏小鼠心脏移植物的长期存活,并获得供体特异性免疫耐受。
Jianxin Qiu[3]（2019）在《小鼠自发肾移植耐受诱导系统性免疫耐受的机制研究》文中认为器官移植是治疗许多终末期疾病的最佳治疗方案,然而移植物排斥反应仍然是导致移植失败的最主要原因之一。在实体器官移植中,诱导免疫耐受从而避免长期使用免疫抑制药物带来的副反应成为该领域中最重要的目标之一。运用骨髓移植构建嵌合体可以在大动物身上诱导肾脏移植物的耐受,该方案已被应用于临床。但是该嵌合体模型却无法诱导心脏移植物耐受。本课题组在非人灵长类动物体内,联合运用非清髓性辐照和骨髓移植成功诱导肾移植耐受后,再向该受体移植同品系来源的心脏移植物,心脏移植物可获得长期耐受。但相关机制却不清楚。免疫耗竭指免疫细胞在周围过量抗原刺激的慢性炎症环境中,逐渐产生效应性功能减弱的分化状态。以阻断免疫检查点为主要手段的免疫治疗方案,激活已经进入耗竭状态的免疫细胞,为近年来治疗恶性肿瘤的最具潜质的手段之一。但免疫细胞耗竭参与器官移植的自发免疫耐受的过程仍存在诸多争议。为了探索肾脏诱导心脏移植物耐受的机制,我们运用小鼠自发免疫耐受模型（DBA/2J小鼠肾脏至C57BL/6受体）,在此基础上再联合移植供体同品系来源的移植物。肾移植后1周进行心脏移植,所有心脏移植物均可耐受,但同品系的皮肤移植物却无法被诱导耐受。肾移植后2周切除移植肾再进行心脏移植,同品系心脏移植物也可全部耐受。清除受体Treg无论在心脏移植耐受早期还是晚期都可触发心脏的排斥反应,酶联免疫斑点试验提示脾细胞对供体反应减弱。而切除胸腺后进行心肾联合移植,心脏移植物存活时间明显延长,但无法达到长期耐受。对肾脏移植物中浸润的CD8+T细胞分析发现,该群细胞表面相较于同受体来源的脾脏细胞高表达PD-1,TIGIT,TIM-3,CD39等抑制性受体和分子。且移植物浸润CD8+T细胞炎性细胞因子分泌量明显减少,增殖能力减弱。阻断CD8+T细胞的PD-1通路可打破已经建立起的免疫耐受状态,导致肾脏移植物排斥。以上结果显示小鼠移植肾自发耐受移植肾中浸润的CD8+T细胞呈现耗竭状态,且移植肾自发耐受依赖于CD8+T细胞耗竭,阻断CD8+T细胞的PD-1通路可导致肾移植物排斥。肾的自发免疫耐受还依赖于Treg功能。不仅如此,耐受移植肾介导的同品系心脏移植物耐受也依赖于Treg的存在。但该过程不完全依赖胸腺介导的中枢耐受机制。
曾巧煌[4]（2019）在《紫草素抑制小鼠皮肤移植排斥反应及其免疫调节机制研究》文中认为目的:器官移植作为一种有效的治疗手段,在临床上广泛应用。然而,几乎所有的移植患者都需要持续使用免疫抑制药物来防止同种异体移植排斥反应的发生。所以免疫抑制剂在器官移植中起着至关重要的作用。不过,目前常用的免疫抑制药物可能导致严重的副作用,如肾毒性、肿瘤和感染等。因此,对于长期接受免疫抑制剂治疗的临床患者来说,迫切需要开发一些具有更好的免疫抑制效果和最小副作用的新型免疫抑制分子。紫草素是一种从紫草根中提取的具有生物活性的萘醌类色素,现代药理学研究表明紫草素具有抗炎、抗癌和抗菌的作用。尤其是,紫草素被证明在动物模型中可以抑制关节炎的发展,在体外实验中还能抑制人类T淋巴细胞的活化。但目前紫草素对同种异体移植排斥反应的作用尚不明确,因此本实验通过建立小鼠皮肤移植模型,考察紫草素对同种异体排斥反应的作用,明确紫草素免疫调节的作用机制。方法:1.紫草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究研究采用小鼠皮肤移植模型,将BALB/C小鼠的皮肤移植到C57BL/6小鼠身上,造模成功后将C57BL/6小鼠随机分为四组,分别为同种异体皮肤移植组（Control）、环孢素A组（CsA）、紫草素低剂量组（Shikonin-20mg/kg）、紫草素高剂量组（Shikonin-40mg/kg）,考察紫草素对移植物生存时间的影响;HE染色、免疫组化和免疫荧光分别测定移植皮片中的炎性细胞浸润及Foxp3和IDO的表达,细胞流式术检测受体小鼠外周引流淋巴结和脾脏细胞中CD4+Foxp3+Treg、效应CD8+CD44high CD62LlowT细胞、CD11c+CD80+和CD11c+CD86+成熟树突状细胞的比例,荧光定量PCR 法测定移植皮片中细胞因子 IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-6、IL-10、TGF-p1、FoxP3和IDO基因表达的水平。2.紫草素联合Anti-CD25抗体对小鼠皮肤移植排斥反应的研究研究采用小鼠皮肤移植模型,造模成功后将C57BL/6小鼠随机分为五组,分别为同种异体皮肤移植组（Control）、环孢素A组（CsA）、环孢素A联合Anti-CD25抗体组（CsA+anti-CD25）、紫草素组（Shikonin）、紫草素联合Anti-CD25抗体组（Shikonin+anti-CD25）,每天给予紫草素或环孢素,在移植后第0、4和8天分别按0.2mg/只的剂量腹腔注射Anti-CD25抗体;每天观察移植皮片有无炎症、水肿、坏死、结痂及脱落等情况,并记录移植皮片的存活时间,用中位生存时间（mediansurvival time,MST）表示。3.紫草素体外实验的研究用流式细胞仪分离纯化C57BL/6小鼠的CD3+T淋巴细胞,采用CCK-8测定紫草素对T细胞的细胞毒性,流式细胞术测定CFSE标记的CD3+T淋巴细胞的增殖情况,ELISA检测培养上清液中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-17和TGF-β1的水平,Western Blotting检测mTOR信号通路的蛋白表达。分离纯化的CD4+CD25-T细胞在抗CD3e和CD28抗体（2.5μg/mL）以及rmIL-2（10ng/mL）共刺激后,分别给予TGF-β1（5ng/mL）和不同浓度的紫草素（0.25μM或0.5μM）,四天后采用流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg的比例。分离纯化C57BL/6小鼠骨髓中的树突状细胞,在rmGM-CSF（20ng/mL）和rmIL-4（1Ong/mL）的共刺激下,分别给予环孢素（0.1μM）和不同浓度的紫草素（0.25μM或0.5μM）,两天后收集细胞采用Western Blotting检测其中IDO的蛋白表达。结果:1.紫草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究紫草素低剂量（20mg/kg）和高剂量（40mg/kg）组均能显着延长同种异体皮肤移植的存活时间,MST分别是16.00±1.37和22.00±2.98天（P<0.05或P<0.01）,甚至紫草素高剂量的治疗效果接近于CsA（MST为26.00±1.49天）（PP>0.05）;紫草素低剂量和高剂量治疗后小鼠移植皮片中CD3+T细胞浸润明显减少（P<0.05或P<0.01）,同时可上调移植皮片中Foxp3和DC来源的IDO的表达（P<0.01）。在受体小鼠次级淋巴器官中,紫草素低剂量和高剂量组均能显着增加引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例（P<0.05或P<0.01）,同时可显着降低脾脏和淋巴结细胞中CD11c+CD86+成熟树突状细胞和CD8+CD44highCD62Llow效应T细胞的比例（P<0.05 或P<0.01）。在移植皮片中,紫草素低剂量和高剂量组均能显着降低促炎因子TNF-α和IL-17的mRNA表达（P<0.05或P<0.01）,以及显着升高FoxP3和IDO mRNA的表达水平（P<0.05或P<0.01）,紫草素高剂量还能抑制IFN-γ和IL-6的mRNA表达（P<0.05 或P<0.01）,同时上调 IL-10和 TGF-β1 mRNA 的表达（P<0.05）。2.紫草素联合Anti-CD25抗体对小鼠皮肤移植排斥反应的研究实验结果表明,Shikonin+anti-CD25 组的 MST 是 16.00±0.75 天,与 Shikonin 单独给药组（MST=25.00±2.83天）相比,明显减少了小鼠的存活时间（P<0.05）;而CsA+anti-CD25组与CsA单独给药组相比没有显着差异（P>0.05）。3.紫草素体外实验的研究不同浓度的紫草素（0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μM）给药24h、48h和96h后,紫草素的给药浓度至1.OμM时,对T细胞并没有细胞毒性作用。在T细胞增殖实验中,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能显着抑制T细胞的增殖（P<0.01）,尤其是高剂量组的抑制效果与CsA组接近（P>0.05）;此外,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能显着降低细胞上清液中IFN-γ的水平（P<0.01）,仅紫草素（0.5μM）组可下调IL-17的浓度（P<0.05）,同时还能上调了抑制型细胞因子IL-10和TGF-β1在细胞上清液中的水平（P<0.05或P<0.01）;而CsA可以提高细胞上清液中TGF-β1的浓度（P<0.01）但对IL-10无影响（P>0.05）;在体外分离纯化的CD4+CD25-T细胞中,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能显着提高CD4+Foxp3+Treg 的比例（P<0.05 或P<0.01）。对于T细胞上mTOR信号通路,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能显着抑制P-p70S6K和P-mTOR的活化（P<0.01）,而作为阳性对照雷帕霉素在很大程度上阻断了 P-p70S6K和P-mTOR的激活（P<0.01）。在体外诱导的髓源性树突状细胞中,紫草素（0.25μM）组和紫草素（0.5μM）组均能在体外增强树突状细胞IDO的蛋白表达（P<0.05或P<0.01）,而环孢素却没有显着差异（P>0.05）。结论:我们实验结果揭示了紫草素在诱导Tregs/IDO和抑制同种异体移植排斥反应中的新作用,表明紫草素可显着延长同种异体皮肤移植小鼠的存活时间,其可能的作用机制是诱导CD4+Foxp3+Treg的分化,促进DC来源IDO的表达以及抑制了 mTOR信号通路的激活。因此,紫草素作为一种天然产物,在未来可能作为一种潜在的免疫抑制药物用于临床器官移植手术。
何景进[5]（2018）在《安全免疫耐受型人胚胎干细胞的建立及其潜在应用》文中研究说明人胚胎干细胞（Human Embryonic Stem Cells,hESCs）拥有无限的自我复制与更新能力且能保持其分化成任何一种体细胞的多能性,在再生医学中具有广阔的应用前景。宿主对来源于hESCs的移植物的免疫排斥是阻碍其发展的关键性瓶颈之一。另一方面,当前抑制宿主免疫排斥的各种策略均会不可避免地增加hESCs及其移植物的癌变风险。为了解决上述问题,本论文的研究目的是建立一株耐受宿主免疫排斥、癌变风险安全可控的人胚胎干细胞株,并初步探讨这种胚胎细胞潜在应用于心梗治疗中的可行性。我们利用细菌人工染色体同源重组基因编辑技术在hESCs的HPRT1位点上敲入CTLA4-Ig、PD-L1和TK这3个基因,建立了 hESCs-CPTK。CTLA4-Ig和PD-L1的共同表达能诱导hESCs-CPTK及其衍生而来的细胞耐受免疫排斥,自杀基因TK的表达能使得hESCs-CPTK及其衍生而来的细胞可以在体外或体内被美国FDA批准的基因治疗药物更昔洛韦（Ganciclovir,GCV）所清除。我们在一种具有人免疫系统的小鼠模型上验证了 hESCs-CPTK的相关功能。流式细胞术和免疫荧光染色法的结果显示hESCs-CPTK在人源化小鼠体内形成的畸胎瘤的T淋巴细胞浸润率显着低于野生型hESCs形成的畸胎瘤,提示hESCs能耐受人源化小鼠的免疫排斥;小鼠体内来源于hESCs-CPTK的畸胎瘤能被腹腔注射的GCV所消除,表明hESCs-CPTK癌变风险安全可控。荧光定量PCR和流式细胞术结果表明hESCs-CPTK具有胚胎干细胞的多能性,且能在体外被诱导分化生成心肌细胞。免疫荧光染色法验证了人源化小鼠体内来源于hESCs-CPTK的心肌细胞耐受人源化小鼠免疫排斥的同时能通过腹腔注射GCV被消除。相对于小鼠,大鼠具有更大的体型,在心跳频率上与人类更接近,更适合应用于心梗研究。因此,我们建立了具有人免疫系统的大鼠模型、严重免疫缺陷的大鼠心梗模型及成功在心梗大鼠模型的心脏中移植了 hESCs分化而来的心肌细胞,为后续进一步研究hESCs-CPTK对心梗的治疗作用奠定了基础。本论文通过基因编辑技术,在诱导hESCs免疫耐受的同时降低了 hESCs的癌变风险,并在具有人免疫系统的人源化小鼠上验证了这两种作用。hESCs-CPTK具有分化成为心肌细胞的能力,可以作为细胞来源潜在应用于心梗治疗。我们建立的相关大鼠模型将促进hESCs-CPTK治疗心梗的进一步研究发展。
华菲[6]（2016）在《干细胞调控CD45RB+调节性树突状细胞在同种异体心脏移植中的作用》文中提出第一部分大鼠BMSCs对DCs表型的影响及CD45RB+DCs免疫功能的检测目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cell,BMSCs）对同种异体骨髓来源的树突状细胞（Dendritic cells,DCs）表型的影响,以及受影响显着的CD45RB+DC亚细胞群的免疫状态。方法:Wistar大鼠的BMSCs和同种异体骨髓来源的树突状细胞（DCs）在体外按等比例进行5d的共培养。根据是否加入BMSCs共同培养,我们将实验分为对照组和实验组两个组别:A组:内毒素脂多糖（LPS）与DCs共培养组,B组:在A组基础上加入BMSCs与DCs共培养组（细胞数量1:1）。对两组DC细胞表面的主要免疫标志物分子的变化情况应用流式细胞仪进行测定和分析,同时观察DCs在光镜下形态学上的改变。利用流式细胞技术分离出大鼠BMSCs诱导的CD45RB+DC细胞群,实验组共分三组:A组:未成熟DC组,B组:CD45RB+DC组,C组:成熟DC组。检测各组细胞表面主要共刺激分子（CD80、CD86、MHC-II）的表达,各组DC摄取抗原的能力（对bead-OVA复合物的摄取）、qPCR方法测各组DC细胞中FOXP3 mRNA的表达,Western Bloting检测各组Foxp3蛋白的表达。结果:和对照组相比,CD45RB、lLT4的表达在BMSCs共培组中DCs表面表达发生上升,而CD86、MHC-II的表达出现下降;同时,CD45RB+组低表达共刺激分子CD80、CD86和MHC-II,呈现出未成熟DC的表征;与此同时CD45RB+组与未成熟DC组的摄取能力也要强于成熟DC组（P<0.05）,CD45RB+DC组与imDC组FOXP3 mRNA及Foxp3蛋白的表达均明显多于mDC组（P<0.05）。结论:BMSCs体外诱导下可以使DCs表面CD45RB与ILT4的表达上调,并导致cd86与mhc2的表达下调,尤其以cd45rb的改变最为明显。经bmscs诱导的cd45rb+dcs摄取抗原的能力明显增强,其foxp3mrna及foxp3蛋白的表达出现上调,呈现出imdc的免疫行为特征。第二部分cd45rb+dcs对t细胞功能影响的体外实验研究目的:通过体外dcs细胞和t淋巴细胞的共培养,分别检测不同dcs细胞对t淋巴细胞增殖能力的影响和其对t淋巴细胞亚群的影响。方法:用wistar大鼠的dcs和sd大鼠的cd4+t细胞进行共培养,包括以下几组。a组:con组为阴性对照组,即sd大鼠的cd4+t细胞,b组:cona为阳性控制组,即sd大鼠分选后的cd4+t细胞给予cona刺激（浓度10ng/ml）,c组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠未成熟dcs进行细胞共培养（dc:t=1:10）,d组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠cd45rb+dcs进行细胞共培养（dc:t=1:10）,e组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠成熟dcs进行细胞共培养（dc:t=1:10）。共培养72h后,取各组cd4+t细胞进行功能检测,包括以cck-8法测定t淋巴细胞的扩增情况;初始th细胞向th1、th2、th17、treg的分化:提取rna之后采用qpcr分别测定相应的特异转录因子t-bet、gata-3、rorγt、foxp3的表达。流式细胞仪检测各组cd4+foxp3+t细胞数量。流式cba法检测培养上清中的il-2、ll-4、il-10、ll-17a、lfn-γ、tnf-α和ll-6等细胞因子表达水平。结果:细胞共培养后,cd45rb+dcs组t细胞增殖能力明显下降,组间有显着差异;同时cd45rb+dcs组cd4+foxp3+t细胞的数量增加,与对照组间有统计学差异（p<0.05）;cd45rb+dcs组和imdcs组特异性转录因子foxp3和t-bet表达上升,gata-3和r0rγ表达下降,ll-2和lfn-γ水平降低,ll-4、ll-10以及tgf-β1水平升高,与对照组间存在明显差别（p<0.05）。结论:大鼠cd45rb+dcs在体外明显抑制反应性t淋巴细胞的增殖,促进初始th0细胞向th2的方向分化倾斜,并能提升调节性t细胞的比例,进而增强t细胞的免疫抑制能力。第三部分cd45rb+dcs静脉输注诱导同种移植免疫耐受的实验研究目的:研究大鼠cd45rb+dcs移植预处理方法诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的作用。方法:首先建立wistar大鼠幼鼠至sd大鼠同种异体颈部心脏移植模型。在移植的5天前,对受体大鼠进行相应的细胞静脉注射。分组:a组（对照组）:只行颈部同种异位心脏移植;b组（imdcs注射组）:受体大鼠经静脉注射供体大鼠未成熟dc细胞1×106/0.2ml;c组（cd45rb+dcs注射组）:受体大鼠经静脉注射供体大鼠cd45rb+dc细胞1×106/0.2ml;d组（mdcs注射组）:受体大鼠经静脉注射供体大鼠成熟dc细胞1×106/0.2ml。用触诊法监测移植心脏的存活时间。分别在移植后的第1、3、5d将移植物中的淋巴细胞进行分离并提取rna,对microrna-182、microrna-183、microrna-7a、microrna-155、microrna-434、ll-2、lfn-γ、ll-4、ll-10的表达水平用定量rt-pcr进行测定。另外分别取受体血清,流式细胞技术测定cd4+foxp3+t淋巴细胞的比值。结果:同种异体心脏移植之后,cd45rb+dcs组和未成熟dcs组移植物存活时间延长明显,与对照组相比差异显着（p<0.05）,随着时间的推移,cd4+foxp3+t淋巴细胞比率呈现逐渐升高趋势,在术后第5d改变明显（p<0.05）。随着心脏移植后时间的推移,microrna-7a、microrna-182以及microrna-183水平逐渐升高,mir-434表达水平则逐渐降低,在移植后的不同时间点上均有统计学差异,但同一天各组间未见明显差别。第3、5dcd45rb+dcs组和imdcs组microrna-155表达增加,和对照组之间有统计学差异（p<0.05）。心脏移植后得第5d,ll-4水平在cd45rb+dcs组和未成熟dcs组中的表达均上升,ll-2和lfn-γ水平则呈现下降趋势,与对照组相比统计学差异显着（p<0.01）;同时il-10水平在cd45rb+dcs组升高明显,与对照相比有明显差异（p<0.01）。结论:cd45rb+dcs通过上调体内cd4+foxp3+调节性t细胞的数量,下调移植受体大鼠microrna-155的表达,增加移植物内淋巴细胞ll-10和ll-4水平,并降低lfn-γ和ll-2水平,从而显着延长移植心脏的存活时间。
王益林[7]（2014）在《新型mTOR抑制剂AZD8055对免疫系统的调控及机制研究》文中指出目的1、通过体内外实验研究阐释新型mTOR抑制剂AZD8055在IBD小鼠模型中的免疫调节作用及其机制,进一步充实对IBD发病机制的认识,为自身免疫性疾病及移植排斥的临床治疗寻求新的治疗途径或干预靶点。2、通过体内外实验研究新型mTOR抑制剂AZD8055对小鼠树突状细胞（DC）分化、发育成熟的影响,并通过体外实验对AZD8055诱导的DC进行一系列功能实验研究,以期对mTOR信号通路在诱导DC免疫耐受中的机制进行初步探究。3、通过第二代高通量转录组测序技术,进一步了解经新型mTOR抑制剂AZD8055诱导的DC具有耐受性特征的细胞生物学机制,为后续工作展开奠定基础。方法1、第一部分1)体内研究:建立C57BL/6小鼠IBD模型,予以AZD8055干预,结合小鼠体重变化、疾病活动度评分、结肠组织病理变化等综合评价AZD8055对IBD模型的保护作用;FCM检测各组小鼠肠系膜淋巴结中Th1、Th17及Treg细胞占CD4+T细胞的比例以及小鼠脾脏、淋巴结及外周血中CD4+、CD8+T细胞的比例。2)体外研究:体外磁珠分选获取C57BL/6小鼠CD4+T细胞,体外刺激活化,予以AZD8055梯度干预,Westernblot检测CD4+T细胞中mTOR信号通路上关键节点磷酸化蛋白水平;体外获取脾脏淋巴细胞或体外磁珠分选出C57BL/6小鼠naive T（CD4+CD62L+T）细胞,经CFSE荧光标记,CD3、CD28抗体刺激活化或在不同细胞因子条件下诱导naive T细胞分别向Th1、Th17、Treg等分化,并予以AZD8055梯度干预,FCM检测CD4+、CD8+T细胞活化增殖情况以及Th1、Th17、Treg等细胞分化和增殖。2、第二部分1)体内研究:应用AZD8055（10mg/kg/天×7天）行腹腔注射,设立对照,7天后处死C57BL/6小鼠,获取骨髓、脾脏和淋巴结,FCM检测其中CD11c+CD8+以及浆细胞样DC的比例;获取骨髓前体细胞,在体外进行诱导分化、培养,并在5、7、9天FCM检测其表面共刺激分子及CD11c比例。2)体外研究:体外磁珠分选出CD11c+DC后,予以AZD8055梯度干预,并在AZD8055处理1小时后加入LPS再刺激30min,Westernblot检测DC细胞中mTOR信号通路上关键节点磷酸化蛋白水平;分离骨髓前体细胞,体外细胞因子诱导其向树突状细胞定向分化过程中加入AZD8055干预,FCM检测DC表型;对诱导出的DC与同种异型CD4+T细胞进行MLR,FCM检测CD4+T细胞增殖、Treg比例、CD4+T细胞凋亡、Treg及非Treg增殖比例等。3、第三部分运用RNA-seq方法,对AZD8055诱导处理的具有耐受特性的未成熟DC（AZD-DC）、未作任何处理的具有免疫特性的成熟DC（WT-DC）、经LPS激活的成熟DC（LPS-DC）这3种反映DC不同功能状态的细胞从转录组水平进行比较分析,用DEGseq计算并鉴定出一批差异显着的基因,进行趋势、功能及KEGG等分析。结果1、第一部分1)AZD8055能显着改善IBD小鼠的体重下降、疾病活动度评分以及结肠组织病理学改变。2)AZD8055能降低IBD小鼠MLN中Th1、Th17细胞比例,升高Treg细胞比例。3)AZD8055能降低IBD小鼠脾脏、淋巴结及外周血中CD4+、CD8+T细胞比例。4)AZD8055在体外对CD4+T细胞中mTOR信号通路有明显抑制作用。5)AZD8055在体外对CD4+、CD8+T细胞增殖有明显抑制作用。6)AZD8055能明显抑制naive T细胞向Th1、Th17分化及增殖,促进Treg细胞分化及增殖。2、第二部分1)AZD8055体内应用后,能降低骨髓、脾脏、外周及肠系膜淋巴结中CD11c+DC的比例。2)AZD8055体内作用后对骨髓前体细胞向DC分化影响不大,但却明显抑制DC向成熟发展。3)AZD8055在10n M时对DC中mTOR信号通路有明显抑制作用。4)AZD8055在体外不影响骨髓前体细胞向DC分化。5)AZD8055能降低LPS刺激DC引起的共刺激分子表达,从而影响DC成熟。6)AZD-DC在体外可明显抑制同种异型CD4+T淋巴细胞的增殖。7)AZD-DC在体外可促进同种异型CD4+T淋巴细胞中Treg比例增加。8)AZD-DC在体外可诱导同种异型CD4+T淋巴细胞凋亡增加。9)AZD-DC在体外较非Treg能更加促进Treg的增殖。3、第三部分1)在AZD-DC和WT-DC、LPS-DC和WT-DC、AZD-DC和LPS-DC之间分别有430、1172和1436个差异基因。2)聚类分析发现AZD-DC组和WT-DC组在基因表达谱上更为接近。3)趋势分析发现8种趋势中的1（一直向下）、4（先平后下）、5（先平后上）号趋势在统计学上具有显着差异,趋势1的P-value值最低。4)基因功能分析:对三组之间两两表达差异的基因分别进行GO分析发现,三组都显着富集在免疫反应及创伤反应等生物学进程中;在AZD与WT两组比较的差异基因显着富集在chemokine activity、chemokine receptor binding、homeostatic process和carbohydrate binding四个GO中,而其余两两之间比较的差异基因在这四个GO中不富集;AZD与WT之间的差异基因较其他两组差异基因的FDR值普遍偏高;趋势1中的基因显着富集于翻译这个生物学进程。5)信号通路分析:三组差异基因都富集在NF-kappa B、Chemokine、Cytokine-cytokine receptor interaction、MAPK、Toll-like receptor、Apoptosis等信号通路上;趋势1中基因显着富集于Ribosome、PPAR信号通路。6)AZD-DC在四种剪切方式上均与WT-DC、LPS-DC明显不同。7)韦恩结合趋势分析发现MGL2、Cadherin-1、4-1BB、Rho B、PDPN等基因在DC从不成熟的耐受状态到成熟的免疫状态过程中表达出现连续上调或下调。结论1、第一部分1)AZD8055可能通过抑制效应性淋巴细胞增殖、抑制IBD诱导的Th1及Th17型反应和提高调节性T细胞（Treg）比例等来发挥其对IBD小鼠模型的保护作用。2)AZD8055在体外可抑制naive T淋巴细胞向Th1、Th17分化及增殖,促进Treg细胞分化及增殖,从而调控Treg与Th17平衡。3)AZD8055发挥特异性调控T辅助细胞亚群分化的作用,为进一步了解mTOR信号通路对T淋巴细胞的免疫调控作用及机制提供了新的思路和方向。mTOR分子可以作为IBD治疗的一个新靶点,但其在IBD发生发展中的作用还有待进一步深入研究。2、第二部分1)mTOR信号通路在维持小鼠造血淋巴系统中DC的数量及促进体内DC的成熟过程中发挥重要作用。2)AZD8055可能通过影响DC成熟从而诱导出耐受性DC。3)AZD-DC可能通过诱导T细胞无反应、诱导Treg比例增加、诱导T细胞凋亡等多个机制来发挥其诱导免疫耐受的作用。4)AZD8055发挥调控DC分化、发育、成熟及功能的作用,为进一步了解mTOR信号通路对DC的免疫调控作用及机制提供了新的思路和方向。mTOR分子可能作为诱导耐受性DC的一个新靶点。3、第三部分1)p38MAPK和NF-κB信号通路参与了DC分化、发育、成熟等过程。2)PPAR、Ribosome信号通路的激活可能参与了AZD8055诱导耐受性DC机制。3)MGL2、Cadherin-1、4-1BB、Rho B和Pdpn等基因在AZD8055诱导耐受性DC过程中可能发挥着重要作用。
黄浩岳[8]（2014）在《干细胞移植诱导产生调节性T细胞在同种异体心脏移植中的作用》文中研究说明第一部分大鼠骨髓间充质干细胞纳米铁颗粒标记目的：以超顺磁氧化铁纳米颗粒标记大鼠骨髓间充质干细胞,检测纳米铁标记对骨髓间充质干细胞功能的影响。方法：取200-250gWistar大鼠,分离股骨和胫骨的骨髓后,以贴壁分离法获取大鼠骨髓间充质干细胞,并传代培养,显微镜下观察生长。取第三代骨髓间充质干细胞,以流式细胞仪分别检测细胞表面CD14、CD29、CD31、CD34、CD45、CD90分子表达情况。以超顺磁氧化铁纳米颗粒溶液（SPIO25ug/ml,PLL0.75ug/ml）标记间充质干细胞,光镜下观察细胞生长情况,透射电镜观察细胞标记状况。并将钠米铁颗粒标记前后的间充质干细胞分别进行成骨和成脂肪诱导分化,观察纳米铁标记对干细胞分化功能的影响情况。结果：贴壁分离培养法可以顺利分离并纯化大鼠骨髓间充质干细胞,细胞生长良好,表面分子CD29、CD90呈阳性表达,不表达CD14、CD31、CD34、CD45,符合骨髓间充质干细胞特征。纳米铁标记后细胞生长良好,电镜下见细胞形态无变化,胞浆内可见SPIO颗粒。标记前后间充质干细胞均具有良好成骨和成脂肪分化功能。结论：含25ug/mlSPIO,0.75/mlPLL的超顺磁氧化铁标记溶液可良好标记大鼠骨髓间充质干细胞,对干细胞表面分子表达及成骨、成脂肪等基本生物学功能无明显影响。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞对T细胞功能影响的体外实验研究第一节骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖能力影响研究目的：通过体外混合淋巴细胞反应,检测大鼠骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖能力的影响。方法：以SD大鼠T淋巴细胞5×104个为反应细胞,Wistar大鼠T淋巴细胞5×104个为刺激细胞,建立单向混合淋巴细胞反应,反应中另分别加入不同量Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。分组：A组：SD大鼠T淋巴细胞单独培养；B组：SD大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠T淋巴细胞；C组：SD大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠MSC细胞5×102个；D组：SD大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠MSC细胞5×103个；E组：SD大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠T淋巴细胞+Wistar大鼠MSC细胞5×104个。混合细胞反应72h后,H3掺入法检测各组细胞增殖情况,结果：混合淋巴细胞反应后,B、C、D、E各实验组T细胞明显增殖,与A组有显着统计学差异,加入干细胞的C、D、E各组T细胞增殖能力逐渐下降,组间有显着差异。结论：大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以抑制反应性T淋巴细胞的增殖,这种抑制作用具有干细胞数量依赖性。第二节骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞亚群的影响研究目的：通过体外混合细胞培养,检测大鼠骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞亚群的影响。方法：同第一节分组方法建立体外混合细胞培养体系,细胞培养72h后,流式细胞仪检测各组CD4+CD25+T细胞比例,并计算各组CD4+/CD8+T细胞比值。ELISA法检测各组培养上清液中IL-2,IL-4,IL-10,TGF-β1, IFN-y水平。结果：混合细胞反应后,加入干细胞的C、D、E各组,CD4+CD25+T细胞比例及CD4+/CD8+T细胞比值逐渐增加,C、D、E各组有统计学差异。B、C、D、E各组IL-2和IFN-y水平逐渐下降,IL-4、IL-10、TGF-β1水平逐渐升高,各组间有统计学差异。结论：大鼠骨髓间充质干细胞在体外淋巴细胞混合培养中,可以提高CD4+CD25+调节性T细胞比例,及CD4+/CD8+细胞比值,这种作用具有剂量依赖性,与提高TGF-β1、IL-4、IL-10水平,降低IL-2、IFN-γ水平,促进Th细胞分化向Th2方向偏移等因素有关。第三部分骨髓间充质干细胞静脉输注联合胸腺注射诱导同种移植免疫耐受的实验研究目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞移植预处理方法诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的作用,并探讨分子机制。方法：建立雄性Wistar大鼠至雌性SD大鼠同种异体腹腔异位心脏移植模型。在心脏移植前1周,分别取纳米铁标记的供体Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,进行受体SD大鼠的胸腺内注射和尾静脉注射。实验分组：A组（对照组）：仅行Wistar大鼠至SD大鼠腹腔同种异位心脏移植；B组（静脉注射组）：受体（SD大鼠）经颈静脉注射供体（Wistar大鼠）MSCs1×106/0.2ml,一周后行Wistar大鼠至SD大鼠腹腔同种异位心脏移植；C组（胸腺注射组）：受体（SD大鼠）胸腺内注射供体（Wistar大鼠）MSCs5×105/0.1ml,余同B组；D组（静脉注射+胸腺注射组）：受体（SD大鼠）经颈静脉注射供体（Wistar大鼠）MSCs1×106/0.2ml,余同C组。触诊法观察心脏移植物存活时间。移植后第1、3、5天分别取心脏移植物分离淋巴细胞,提取RNA,相对定量RT-PCR检测各组IL-2、IL-4、IL-10、IFN-y、miR-7a、miR-155、miR-182、miR-183、miR-434-3p水平。分别取外周血,以流式细胞仪检坝CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞比例。PCR检测受体内供体SRY基因表达情况。MRI和普鲁士蓝染色检测标记干细胞在移植后的分布状况。结果：大鼠同种异体心脏移植后,B、C、D组移植物存活时间较对照组明显延长,有统计学差异。CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞比例逐步提高,第5天明显,有统计学差异。移植后第1、3、5天miR-7a、miR-182、miR-183水平逐步升高,miR-434-3p水平逐步降低,各时间点有统计学差异,但同一时间点各组差异不明显。第3天和第5天B、C、D组miR-155水平增幅下降,与对照组相比有统计学差异,D组有显着差异。移植后第5天,IL-2、IFN-y水平明显下降,与对照组相比,B组有统计学差异,C、D组有显着差异；C、D组IL-4水平升高,有统计学差异；D组IL-10水平升高,有显着性差异。B、C组受体大鼠腹腔淋巴结均可见供体SRY基因表达。MRI和普鲁士蓝染色可见胸腺及移植心脏内标记干细胞存留,数量逐渐减少。结论：大鼠同种心脏移植后,受体miR-155,miR-182,miR-183口miR-7表达升高,miR-434-3p表达下降。胸腺内注射供体MSCs和静脉内注射供体MSCs可以增加受体内CD4+CD25+调节性T细胞数量,降低受体大鼠miR-155表达水平,提高移植物细胞因子IL-4,IL-10表达水平,降低IL-2、IFN-γ表达水平,并促进供受体嵌合,延长心脏移植物存活时间。胸腺注射和静脉注射相结合效果更好。
买合皮热提汗·艾尔肯[9]（2012）在《泡状棘球蚴感染诱导免疫耐受的实验研究》文中提出目的：建立Lewis大鼠泡状棘球蚴感染模型后,进行BN大鼠对泡状棘球蚴感染Lewis（简称LEW）大鼠异位心脏移植,观察Lewis大鼠感染泡球蚴后,免疫系统发生的变化对移植心脏的影响,初步探讨其相关的发生机制。初步观察免疫抑制剂FK506、骁悉以及抗包虫药L-ABZ对感染泡球蚴大鼠移植心脏的疗效。方法：1)采用大鼠右下腹腔直接注射接种泡状棘球蚴悬浮液的方式,建立泡状棘球蚴感染的动物模型；2)建立大鼠颈部异位心脏移植模型,LEW大鼠为受体,Brown Norway（简称BN）大鼠为供体。将供心主动脉与肺动脉分别与受体右颈总动脉和右颈外静脉吻合；3)分别行BN大鼠对未感染泡球蚴LEW大鼠（即对照组,n=12）及BN大鼠对泡球蚴感染LEW大鼠（即实验组,n=12）异位心脏移植,术后观察异位移植心脏的存活时间,移植心脏发生排斥后进行组织病理学和免疫组化法检测,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清内白细胞介素4（IL-4）和γ干扰素（IFN-y）水平,免疫组化法检测排斥心肌组织内T细胞及嗜酸性粒细胞的浸润,细胞流式检测法（FACS）分别检测对照组和实验组大鼠脾内CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+Treg细胞）数量水平情况；4)建立BN大鼠对泡球蚴感染LEW大鼠异位心脏移植模型。实验动物分组：将感染泡球蚴的LEW大鼠随机分为下列实验组：Group1BN→LEW （n=9）:未治疗；Group2BN→LEW （n=9）:L-ABZ50mg/kg/d灌胃,每日一次；Group3BN→LEW （n=9）:FK5061mg/kg/d灌胃,每日一次；Group4（n=9）:FK5061mg/kg/d、L-ABZ50mg/kg/d灌胃,每日一次；Group5BN→LEW （n=9）:FK5061mg/kg/d、MMF20mg/kg/d;灌胃,每日一次；Group6BN→LEW （n=9）:FK506lmg/kg/d、MMF20mg/kg/d、L-ABZ50mg/kg/d灌胃,每日一次。判断心脏排斥后,观察移植物存活时间及移植心组织内浸润嗜酸性粒细胞数量的变化。结果：1)接种泡状棘球蚴LEW大鼠,用开腹肉眼、常规病理切片及间接ELISA法检测感染率。泡球蚴感染大鼠三个月后感染率约为85.0%；2)正式实验中同种异体组行大鼠颈部异位心脏移植50例,术后100%复跳,3天存活率为96.0%,供心缺血时间均少于35分钟。同种异体移植心存活时间平均8天左右7.89±1.65d,病理检查可见典型排斥反应征象；同系移植组10例,移植心均存活至处死取材（6例>11天,4例>3个月后处死不再观察生存期）。同系移植组移植心脏病理切片未见明显心肌损害；3)实验组（即感染泡球蚴组）移植心存活时间为16.17±3.19天,对照组（即未感染泡球蚴组）移植心存活时间7.92±1.93天,实验组移植心存活时间较对照组移植心存活时间明显延长,两者有显着性的统计学差异（P≤0.05）。实验组移植心的组织病理学分级（平均分级为3.38级）与对照组（平均分级为3.79级）比较,差异无统计学意义（P>0.05）。移植心脏发生排斥反应后,实验组血清内IL-4水平为152.21±45.62ng/L高于对照组50.85±22.15ngm,而实验组血清内IFN-γ水平为12.35±1.02ng/L水平低于对照组42.63±4.15ng/L,两组差异均有统计学意义（P≤0.05）; FACS流式检测结果提示实验组大鼠脾内CD4+CD25+调节性T细胞数量为10.8%,高于对照组的6.1%,两组差异有显着的统计学意义（P<0.001）；4)除FK506+MMF组移植心存活时间较感染对照组有所延长外（16.11±8.04vs11.60±6.02,P≤0.05）,其余各组的移植心存活时间未见延长（P>0.05）。单纯的L-ABZ不会影响移植物的存活且L-ABZ与FK506+MMF可能有一定的拮抗作用。结论：1)通过向实验大鼠右下腹腔注射泡球蚴悬浮液的方式建立大鼠泡球蚴感染模型是成功的,适用于大批量动物实验研究；2)应用Cuff技术建立大鼠异位心脏移植模型,明显降低了手术难度,具有手术创伤小、供心缺血时间短等优点,简单实用,制模成功率高；3)泡状棘球蚴感染造成Th1/Th2向Th2类细胞因子偏移,并且可能通过介导CD4+CD25+调节性T细胞数量增加而导致大鼠异位移植心脏存活时间延长,其可能是诱导移植免疫耐受的原因之一；4)单纯的L-ABZ不会影响移植物的存活；L-ABZ与FK506+MMF可能存在一定的拮抗作用。
朱淑惠[10]（2010）在《寿胎丸抗大鼠卵巢移植急性排斥期细胞凋亡的实验研究》文中研究指明目的建立SD大鼠和Wi star大鼠同种异体卵巢皮下游离移植模型,并以Wi star大鼠自体卵巢皮下游离移植模型作为对照组,以补肾安胎中药复方“寿胎丸”进行干预,观察卵巢移植模型组织形态学与超微结构的变化、凋亡指数及凋亡相关基因Bcl-2、Bax. Fas. FasL的表达、卵巢激素E2的水平,探讨“寿胎丸”抗卵巢移植急性排斥反应的机理。方法210只Wistar雌性大鼠随机分为7组,每组30只。①自体移植模型组；②自体移植+寿胎丸组；③异体移植模型组；④异体移植+寿胎丸组；⑤异体移植+CsA组；⑥异体移植+CsA及寿胎丸组；⑦正常对照组。①、②建立自体卵巢皮下游离移植模型,③、④、⑤、⑥建立同种异体卵巢移植模型,受体Wistar大鼠,供体SD大鼠,⑦行开腹缝合假手术处理,为正常对照组。术后给药,②自体移植+寿胎丸组和④异体移植+寿胎丸组予寿胎丸水煎剂,按26.8g/kg/d剂量灌胃,连用28天；⑤异体移植+CsA组予CsA,按10mg/kg/d剂量灌胃,连用14天,然后减量,按6mg/kg/d剂量连用14天；⑥异体移植+CsA及寿胎丸组同时予CsA和寿胎丸水煎剂,剂量同前；①自体移植模型组、③异体移植模型组、⑦正常对照组予生理盐水,按5ml/kg/d剂量灌胃,连用28天。各组于移植术后d7、d14、d21、d28、d35分批处死Wi star大鼠各6只,取双侧移植卵巢：在电镜下观察移植卵巢超微结构变化,新生血管的形态学特征；光镜下计算各个发育阶段卵泡、黄体的数量,观察间质的变化；TUNEL试剂盒检测移植卵巢凋亡指数；免疫组化检测凋亡相关基因Bcl一2／Bax.凋亡因子Fas及其天然配体FasL的表达；移植术前1天眼眶后静脉丛取血测血清E2,移植术后取三次血,第6-15天、第16-25天以及第26-35天,根据阴道涂片,选雌激素分泌最高峰当日,取血测血清E2。观察记录各组动物的体重及进食等一般情况。结果1、血清内分泌激素E2的变化各组卵巢移植大鼠移植术前的血清E2水平稍低于正常对照组静止期的E2水平,差异无统计学意义（P＞0.05）。移植术后6-15天,①自体移植模型组、②自体移植+寿胎丸组、⑤异体移植+CsA组、⑥异体移植+CsA及寿胎丸组大鼠的E2水平有大幅度升高,①自体移植模型组、⑥异体移植+CsA及寿胎丸组大鼠的血清E2与正常对照组血清E2比较,差异无统计学意义（P＞0.05）；③异体移植模型组、④异体移植+寿胎丸组大鼠的E2水平不升反降,分别与⑤异体移植+CsA组、⑥异体移植+CsA及寿胎丸组大鼠的血清E2比较,均有统计学意义（P＜0.05）；血清E2水平,⑥异体移植+CsA及寿胎丸组>⑤异体移植+CsA组>④异体移植+寿胎丸组、③异体移植模型组；③异体移植模型组与①自体移植模型组E2水平相比较,差异有统计学意义（P<0.05）。移植术后16-25天,①自体移植模型组、②自体移植+寿胎丸组、⑤异体移植+CsA组、⑥异体移植+CsA及寿胎丸组E2水平分别与③异体移植模型组、④异体移植+寿胎丸组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）；①自体移植模型组和②自体移植+寿胎丸组E2水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。移植术后26-35天,①自体移植模型组、②自体移植+寿胎丸组、⑤异体移植+CsA组、⑥异体移植+CsA及寿胎丸组E2水平仍高于③异体移植模型组和④异体移植+寿胎丸组,有统计学意义（P<0.05）；④异体移植+寿胎丸组E2水平稍高于③异体移植模型组,但差异无统计学意义（P>0.05）；①自体移植模型组和②自体移植+寿胎丸组E2水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。2、移植卵巢组织形态学的变化石蜡切片HE染色观察移植卵巢内各级卵泡和黄体数目,①自体移植模型组、②自体移植+寿胎丸组、④异体移植+寿胎丸组、⑤异体移植+CsA组、⑥异体移植+CsA及寿胎丸组卵巢内各级卵泡和黄体的数目,均多于③异体移植模型组,少于⑦正常对照组；②自体移植+寿胎丸组的原始卵泡明显多于①自体移植模型组；⑥异体移植+CsA及寿胎丸组的卵泡和黄体多于⑤异体移植+CsA组、④异体移植+寿胎丸组；③异体移植模型组大鼠卵巢仅在移植后7天出现黄体,其余各时间点,均未发现各级卵泡和黄体。电镜观察发现,存活的自体移植卵巢细胞,超微结构基本正常,仅见线粒体和内质网轻度扩张,新生血管有扩张瘀血现象。异体移植卵巢的细胞坏死和凋亡严重,坏死细胞细胞核变形,染色质边集,细胞膜不完整,细胞器极少,线粒体空泡化,脂滴丰富。凋亡细胞的细胞核固缩,核周间隙增宽,染色质凝集,形成不同性状和大小的块状,并逐步分裂为碎片；胞质致密,细胞器浓缩,失去水分；细胞膜下陷,包裹核碎片和细胞器,形成凋亡小体。移植卵巢内聚集大量巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞,新生血管有扩张瘀血现象,移植后期卵巢组织纤维化。经积极抗排斥治疗的大鼠,卵巢细胞超微结构基本正常,胞浆内细胞器较多,线粒体与内质网有不同程度肿胀。3、凋亡细胞数、Bcl-2、Bax、Fas、FasL的变化TUNEL法检测移植卵巢内的细胞凋亡数,③异体移植模型组凋亡细胞最多,⑦正常对照组凋亡细胞最少；③异体移植模型组多于①自体移植模型组（P<0.05）；④异体移植+寿胎丸组、⑤异体移植+CsA组、⑥异体移植+CsA及寿胎丸组的凋亡细胞均少于③异体移植模型组（P<0.05）；②自体移植+寿胎丸组的凋亡细胞少于①自体移植模型组（P<0.05）。检测移植卵巢内的Bcl-2表达,发现移植术后①自体移植模型组与③异体移植模型组大鼠卵巢内的Bcl-2水平与正常组比较明显降低（P<0.05）；②自体移植+寿胎丸组的Bcl-2水平高于①自体移植模型组（P<0.05）；移植后7天,⑤异体移植+CsA组的Bcl-2高于③异体移植模型组和④异体移植+寿胎丸组（P<0.05）；移植后35天,④异体移植+寿胎丸组、⑤异体移植+CsA组、⑥异体移植+CsA及寿胎丸组的Bcl-2水平均高于③异体移植模型组（P<0.05）,寿胎丸与CsA的的交互作用是负向的。检测移植卵巢内的Bax表达,移植14天,①自体移植模型组的Bax水平低于③异体移植模型组和⑦正常对照组（P＜0.05）,其余各时点,三组比较,均无明显差异（P>0.05）；②自体移植+寿胎丸组的Bax水平低于①自体移植模型组（P<0.05）；移植后14天,④异体移植+寿胎丸组、⑤异体移植+CsA组、⑥异体移植+CsA及寿胎丸组的Bax水平低于异体移植模型组（P＜0.05）,CsA和寿胎丸的交互作用是负向的。检测移植卵巢内的Fas表达,经统计分析,移植后14天,①自体移植模型组的Fas水平低于⑦正常对照组（P<0.05）,其余各时间点,①自体移植模型组、③异体移植模型组与⑦正常对照组比较,均无明显差异（P>0.05）;①自体移植模型组和②自体移植+寿胎丸组的Fas水平,在移植后各个时间点比较,差异均无统计学意义（P>O.05）：移植术后28天,⑤异体移植+CsA组的Fas水平低于③异体移植模型组和④异体移植+寿胎丸组,⑥异体移植+CsA及寿胎丸组Fas水平低于④异体移植+寿胎丸组（P<0.05）。寿胎丸、CsA的交互作用为正向效应。检测移植卵巢内的FasL表达,①自体移植模型组、③异体移植模型组大鼠卵巢内的FasL水平,与正常对照组在各时间点比较,均无明显差异（P＞0.05）；①自体移植模型组和②自体移植+寿胎丸组大鼠的FasL水平,在移植后各个时间点比较,差异均无统计学意义（P>0.05）；异体卵巢移植各组大鼠卵巢内的FasL水平比较,在移植术后各时间点,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论1白体卵巢冻融后移植是可行的,移植后的卵巢具有内分泌功能,并能保存较多的卵泡；异体卵巢移植经积极抗排斥治疗后也有内分泌功能,但卵泡丢失较多。2寿胎丸有抗异体卵巢移植排斥反应的作用。在提高内分泌激素E2水平和保存卵泡方面,寿胎丸与CsA有协同作用。3细胞凋亡与排斥反应相关,寿胎丸与CsA均能抑制急性排斥反应中卵巢细胞的凋亡,但CsA作用更明显,在抑制卵巢细胞凋亡方面,未发现寿胎丸和CsA有协同作用。4寿胎丸抗大鼠同种异体卵巢移植急性排斥反应的机理,可能与其调控细胞凋亡有关,CsA和寿胎丸均能升调Bcl-2表达,降调Bax表达,升调Bcl一2／Bax的比值,从而发挥抑制卵巢细胞凋亡的作用；寿胎丸调控卵巢细胞内Fas.FasL因子的作用不明显。5寿胎丸可减少自体移植卵巢内原始卵泡的丢失,可能与其抑制卵巢细胞凋亡的作用相关,而但其在短期内提高自体移植卵巢成活率、提高内分泌激素E2水平的作用尚不明显。
二、新生大鼠同种心脏移植免疫耐受的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新生大鼠同种心脏移植免疫耐受的实验研究（论文提纲范文）
（1）木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究（论文提纲范文）
| 答辩委员会名单及评定意见 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 移植免疫概述 |
| 一、器官移植排斥反应概述 |
| 二、调节性T细胞在移植免疫中的作用 |
| 三、DC细胞在移植免疫中的作用 |
| 第二节 免疫抑制剂在器官移植中的作用 |
| 一、免疫抑制剂分类 |
| 二、雷帕霉素 |
| 第三节 中医药在器官移植中的研究进展 |
| 一、中医药对移植前后的病因病机认识 |
| 二、中医药对移植前后的辨证认识 |
| 三、中药对器官移植的治疗 |
| 第四节 木犀草素的研究进展 |
| 一、木犀草素药代动力学及生物利用度的研究进展 |
| 二、木犀草素药理作用的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 木犀草素对小鼠皮肤移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体皮肤移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的作用 |
| 三、木犀草素联合应用Anti-CD25抗体删除Treg对小鼠皮肤移植反应的影响 |
| 四、讨论 |
| 第二节 木犀草素对小鼠胰岛移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体胰岛移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠胰岛移植的作用 |
| 三、讨论 |
| 第三节 木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验 |
| 一、实验内容 |
| 二、讨论 |
| 第三章 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新性 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（2）阻断OX40/OX40L通路联合ECDI结合供体脾细胞诱导预致敏小鼠心脏移植免疫耐受（论文提纲范文）
| 中英文对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料和方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）小鼠自发肾移植耐受诱导系统性免疫耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 方法与材料 |
| 1.1 小鼠肾脏移植 |
| 1.2 小鼠颈部异位心脏移植 |
| 1.3 小鼠皮肤移植 |
| 1.4 小鼠胰岛移植 |
| 1.5 小鼠胸腺切除 |
| 1.6 流式细胞术 |
| 1.7 酶联免疫斑点检测(Enzyme-linked Immunospot Assay,ELISPOT) |
| 1.8 组织细胞RNA提取 |
| 1.9 组织石蜡切片H&E染色 |
| 1.10 石蜡切片免疫组化染色 |
| 试验结果 |
| 2.1 自发耐受肾脏移植物中的调节性三级淋巴器官 |
| 2.2 自发耐受肾脏移植物诱导的免疫耐受环境可产生耐受分离 |
| 2.3 调节性T细胞在维持系统性免疫耐受中的作用 |
| 2.4 移植物浸润免疫细胞耗竭在维持免疫耐受中的作用 |
| 讨论与总结 |
| 3.1 耐受分离现象及其机制 |
| 3.2 Treg与移植免疫 |
| 3.3 免疫细胞耗竭的机制及其在移植免疫中的作用 |
| 3.4 移植物淋巴组织新生及三级淋巴结构 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）紫草素抑制小鼠皮肤移植排斥反应及其免疫调节机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 移植排斥反应 |
| 一、T细胞在移植排斥反应中的作用 |
| 二、树突状细胞在移植排斥反应中的作用 |
| 三、吲哚胺2,3-双加氧酶在移植排斥反应中的作用 |
| 第二节 中药在抗移植排斥反应中的研究进展 |
| 一、祛风湿类中药 |
| 二、补益类中药 |
| 三、活血化瘀类中药 |
| 四、清热类中药 |
| 第三节 紫草素的研究进展 |
| 一、紫草素药代动力学及生物利用度的研究概况 |
| 二、紫草素药理作用的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 紫草素对小鼠皮肤移植排斥反应的实验研究 |
| 一、实验材料及试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 紫草素联合Anti-CD25抗体对小鼠皮肤移植排斥反应的影响 |
| 一、实验材料及试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 紫草素对小鼠皮肤移植排斥反应的机制研究 |
| 一、实验材料及试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（5）安全免疫耐受型人胚胎干细胞的建立及其潜在应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 人类胚胎干细胞的研究进展 |
| 第二节 免疫系统人源化动物模型 |
| 第三节 心肌梗死的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 安全免疫耐受型人胚胎干细胞hESCs-CPTK的建立 |
| 第二节 hESCs-CPTK诱导免疫耐受的作用以及安全性研究 |
| 第三节 心肌细胞的分化 |
| 第四节 动物模型的建立 |
| 结语 |
| 一 结论 |
| 二 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）干细胞调控CD45RB+调节性树突状细胞在同种异体心脏移植中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠BMSCs对DC细胞表型的影响及CD45RB~+ DCs免疫功能的检测 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分CD45RB~+DCs对T细胞功能影响的体外实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分CD45RB~+DCs细胞静脉输注诱导同种移植免疫耐受的实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表论文和科研情况 |
| 致谢 |
（7）新型mTOR抑制剂AZD8055对免疫系统的调控及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第一部分 新型mTOR抑制剂AZD8055对T淋巴细胞的调控及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1、实验动物 |
| 2、实验试剂 |
| 3、实验耗材 |
| 4、实验仪器 |
| 5、实验方法 |
| 6、Western Blot 检测 |
| 7、统计分析 |
| 结果 |
| 1、AZD8055对IBD小鼠模型的保护作用及机制研究 |
| 1.1 模型建立 |
| 1.2 AZD8055干预及效果评估 |
| 1.3 AZD8055 能改善IBD结肠炎的肠道炎症反应 |
| 1.4 AZD8055 能降低IBD小鼠MLN中 Th1、Th17 比例,升高Treg比例 |
| 1.5 AZD8055 能降低IBD小鼠脾脏、淋巴结及外周血中CD4+及CD8+T细胞的比例 |
| 2、AZD8055体外研究结果 |
| 2.1 AZD8055对CD4+T淋巴细胞mTOR信号通路的抑制作用 |
| 2.2 AZD8055对CD4+T辅助细胞及CD8+T细胞增殖的影响 |
| 1 )AZD8055对CD4+T辅助细胞增殖的影响 |
| 2 )AZD8055对CD8+T细胞增殖的影响 |
| 2.3 AZD8055对naive T淋巴细胞分化的影响 |
| 1 )AZD8055对naive T淋巴细胞向Th1分化及增殖的影响 |
| 2 )AZD8055对naive T淋巴细胞向Th17 分化的影响 |
| 3 )AZD8055对naive T淋巴细胞向Treg细胞分化及增殖的影响 |
| 讨论 |
| 1、mTOR抑制剂的应用 |
| 2、免疫排斥反应中的细胞免疫机制 |
| 3、Th1/Th2的作用 |
| 4、Treg的作用 |
| 5、Th17的作用 |
| 6、Treg/Th17 平衡的作用 |
| 7、mTOR信号通路对T细胞分化的影响 |
| 8、总结 |
| 第二部分 应用mTOR抑制剂AZD8055 制备耐受性DC及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1、实验动物 |
| 2、主要仪器及设备 |
| 3、主要试剂 |
| 4、主要液体的配制 |
| 5、主要实验方法 |
| 6、统计学处理 |
| 结果 |
| 1、AZD8055作用的体内结果 |
| 1.1 AZD8055体内作用对骨髓前体细胞及外周淋巴系统DC的影响 |
| 1.2 AZD8055体内作用后对骨髓前体细胞向树突状细胞分化的影响 |
| 2、DC的分离诱导分化、培养及体外扩增 |
| 3、AZD8055对DC中 mTOR信号通路抑制的研究 |
| 4、AZD8055体外研究结果 |
| 4.1 AZD8055在体外不影响DC的分化 |
| 4.2 AZD8055对DC表型的影响 |
| 4.3 AZD-DC 在体外可明显抑制同种异型 CD4+T 淋巴细胞的增殖 |
| 4.4 AZD-DC在体外可促进同种异型CD4+T细胞中Treg比例增加 |
| 4.5 AZD-DC 在体外可诱导同种异型 CD4+T 淋巴细胞凋亡增加 |
| 4.6 AZD-DC对同种异型CD4+T细胞中Treg及非Treg增殖的影响 |
| 讨论 |
| 1、树突状细胞概况 |
| 2、DC体外诱导分化培养、扩增 |
| 3、应用DC诱导免疫耐受的方法 |
| 4、DC诱导免疫耐受的机制 |
| 5、mTORC1及mTORC2 与耐受性DC功能 |
| 6、应用耐受性DC诱导移植物长期存活的研究 |
| 第三部分 转录组测序研究耐受性树突状细胞分子生物学变化 |
| 前言 |
| 试验材料与方法 |
| 一、试验材料 |
| 二、试验方法 |
| 结果 |
| 1、RNA-seq数据质量控制 |
| 2、RNA-seq数据分析 |
| 3、差异表达基因分析 |
| 4、聚类分析 |
| 5、趋势分析 |
| 6、基因功能分析 |
| 7、GO-tree分析 |
| 8、信号通路分析 |
| 9、选择性剪切分析 |
| 10、韦恩结合趋势分析 |
| 讨论 |
| 1、转录组测序概述 |
| 2、转录组测序分析耐受性DC的分子机制 |
| 2.1 树突状细胞的分化、发育及成熟 |
| 2.2 耐受性树突状细胞 |
| 2.3 体外诱导树突状细胞的来源 |
| 2.4 树突状细胞的转录组测序结果分析 |
| 2.5 总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（8）干细胞移植诱导产生调节性T细胞在同种异体心脏移植中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞纳米铁颗粒标记 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞对T细胞功能 影响的体外实验研究 |
| 第一节 骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖能力影响研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 第二节 骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞亚群的影响研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 骨髓间充质干细胞静脉输注联合胸腺注射诱导同种移植免疫耐受的实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表论文和科研情况 |
| 致谢 |
（9）泡状棘球蚴感染诱导免疫耐受的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 建立Lewis大鼠泡状棘球蚴模型 |
| 1. 研究内容与方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 泡球蚴的动物模型制备方法 |
| 1.3 感染观察指标 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 应用Cuff技术建立大鼠颈部异位心脏移植模型 |
| 1. 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 实验设备及材料 |
| 1.3 手术方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 图表附录 |
| 第三部分 泡状棘球蚴感染诱导免疫耐受的实验研究 |
| 1. 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 FK506+MMF方案联合阿苯哒唑脂质体对泡状棘球蚴感染大鼠心脏移植的疗效观察 |
| 1. 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
| 导师评阅表 |
（10）寿胎丸抗大鼠卵巢移植急性排斥期细胞凋亡的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 移植免疫 |
| 一、同种异型抗原排斥反应发生的机制 |
| (一) 同种异型抗原是激发宿主产生移植排斥反应的主要因素 |
| (二) T细胞是识别同种异型抗原、介导移植排斥反应的关键细胞 |
| (三) 同种异型抗原识别的抗原提呈细胞 |
| (四) T细胞对同种异型抗原的识别模式 |
| 二、同种异体移植排斥反应的类型及效应机制 |
| (一) 宿主抗移植物反应 |
| (二) 移植物抗宿主反应 |
| 三、同种异体移植排斥反应的防治 |
| (一) 选择理想的供者 |
| (二) 移植物或受者的预处理 |
| (三) 抑制受者的免疫应答 |
| (四) 诱导受者产生针对移植物的免疫耐受 |
| 四、移植后的免疫监测 |
| 第二节 卵巢移植的研究现状 |
| 一、卵巢移植的意义 |
| 二、卵巢移植的理论依据 |
| 三、卵巢移植的部位 |
| 四、卵巢移植的方法 |
| 五、卵巢移植的方式 |
| 六、卵巢组织的冻融 |
| 七、移植卵巢的监测 |
| 第三节 细胞凋亡 |
| 一、细胞凋亡的表现 |
| (一) 凋亡的形态改变 |
| (二) 细胞凋亡的生化改变 |
| 二、细胞凋亡的机制 |
| (一) 胞外信号对凋亡的调节 |
| (二) 两条细胞凋亡信号转导途径 |
| (三) 凋亡相关的基因 |
| 三、诱导和抑制细胞凋亡的因素 |
| (一) 诱发细胞凋亡的因素 |
| (二) 抑制细胞凋亡的因素 |
| 四、细胞凋亡生理意义与疾病的发生和治疗 |
| (一) 细胞凋亡的生理学意义 |
| (二) 细胞凋亡与诸多疾病的发生有关 |
| (三) 细胞凋亡与疾病的有效治疗关系密切 |
| 五、女性生殖细胞的凋亡 |
| (一) 颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁 |
| (二) 黄体细胞凋亡与黄体萎缩 |
| (三) 促排卵治疗中的凋亡机制 |
| 六、细胞凋亡与器官移植 |
| 第四节 中药抗排斥与调控细胞凋亡 |
| 一、中药抗移植排斥 |
| 二、中药调控细胞凋亡 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 寿胎丸对大鼠卵巢移植术后E2分泌的影响 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 主要仪器和试剂 |
| (三) 实验药物 |
| (四) 建立模型 |
| (五) 实验分组与药物观察 |
| 二、观察指标与检测方法 |
| (一) 一般情况 |
| (二) 阴道细胞涂片 |
| (三) 取血方法 |
| (四) 血清E2水平的检测 |
| (五) 数据处理与分析 |
| 三、结果 |
| (一) 各组大鼠一般情况 |
| (二) 阴道涂片观察各组大鼠动情情况 |
| (三) 卵巢移植后各组大鼠血清E2分泌的变化 |
| 四、讨论 |
| (一) 大鼠自体卵巢移植模型建立的关键点 |
| (二) 寿胎丸对自体卵巢移植大鼠E2分泌的影响 |
| (三) 寿胎丸对异体卵巢移植大鼠E2分泌的影响 |
| 第二节 寿胎丸对大鼠卵巢移植术后形态学的影响 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验动物分组及造模方法 |
| (二) 器械与设备 |
| 二、观察指标与检测方法 |
| (一) 解剖后大体标本观察 |
| (二) 移植卵巢光镜下形态学的观察 |
| (三) 移植卵巢超微结构观察 |
| (四) 数据处理与分析 |
| 三、结果 |
| (一) 移植卵巢大体标本观察 |
| (二) 光学显微镜下移植卵巢组织学观察 |
| (三) 移植卵巢超微结构观察 |
| 四、讨论 |
| (一) 自体卵巢经冻融移植后的生长情况 |
| (二) 移植排斥反应对移植卵巢内卵泡和黄体影响 |
| (三) 寿胎丸对自体移植卵巢内卵泡和黄体影响 |
| (四) 寿胎丸对异体移植卵巢内卵泡和黄体的影响 |
| 第三节 寿胎丸调控大鼠卵巢移植急性排斥期细胞凋亡的研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验动物分组及造模方法 |
| (二) 器械设备与试剂 |
| 二、观察指标与检测方法 |
| (一) 取材方法 |
| (二) TUNEL法操作规程 |
| (三) 凋亡指标Bcl-2、Bax、Fas、FasL表达的检测 |
| 三、结果 |
| (一) 自体移植与异体移植模型大鼠卵巢凋亡细胞数的比较 |
| (二) 自体卵巢移植大鼠不同时点凋亡细胞数的比较 |
| (三) 异体移植各组大鼠卵巢不同时点凋亡细胞数的比较 |
| (四) 自体移植与异体移植模型大鼠四种凋亡相关指标的变化 |
| (五) 自体卵巢移植大鼠四种凋亡相关指标的变化 |
| (六) 异体移植各组大鼠四种凋亡相关指标的变化 |
| 四、讨论 |
| (一) 细胞凋亡研究方法的选择 |
| (二) 移植排斥反应与细胞凋亡的相关性 |
| (三) 寿胎丸对移植卵巢细胞凋亡的影响 |
| (四) 寿胎丸对Bcl-2/Bax的调控作用 |
| (五) 寿胎丸对Fas/FasL的调控作用 |
| 第四节 寿胎丸抗卵巢移植急性排斥的作用与机制 |
| 一、寿胎丸的功效与中药药理 |
| 二、妊娠免疫调节 |
| 三、器官移植的免疫机制 |
| 四、寿胎丸抗卵巢移植急性排斥的作用机理 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 一、缩写词 |
| 二、在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、新生大鼠同种心脏移植免疫耐受的实验研究（论文参考文献）
- [1]木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究[D]. 叶书林. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]阻断OX40/OX40L通路联合ECDI结合供体脾细胞诱导预致敏小鼠心脏移植免疫耐受[D]. 姚仲鹏. 广州医科大学, 2020(01)
- [3]小鼠自发肾移植耐受诱导系统性免疫耐受的机制研究[D]. Jianxin Qiu. 上海交通大学, 2019(01)
- [4]紫草素抑制小鼠皮肤移植排斥反应及其免疫调节机制研究[D]. 曾巧煌. 广州中医药大学, 2019(03)
- [5]安全免疫耐受型人胚胎干细胞的建立及其潜在应用[D]. 何景进. 南方医科大学, 2018
- [6]干细胞调控CD45RB+调节性树突状细胞在同种异体心脏移植中的作用[D]. 华菲. 苏州大学, 2016(11)
- [7]新型mTOR抑制剂AZD8055对免疫系统的调控及机制研究[D]. 王益林. 上海交通大学, 2014
- [8]干细胞移植诱导产生调节性T细胞在同种异体心脏移植中的作用[D]. 黄浩岳. 苏州大学, 2014(01)
- [9]泡状棘球蚴感染诱导免疫耐受的实验研究[D]. 买合皮热提汗·艾尔肯. 新疆医科大学, 2012(05)
- [10]寿胎丸抗大鼠卵巢移植急性排斥期细胞凋亡的实验研究[D]. 朱淑惠. 广州中医药大学, 2010(09)